人甲状旁腺素(1-34)对新生鼠成骨细胞钙含量及钙化结节形成的影响
作者：韩志岩 程锦轩 刘景生
单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院药理室
关键词：人甲状旁腺素(1-34)[hPTH(1-34)]；成骨细胞；基质钙；钙化结节
人甲状旁腺素 摘要 目的 研究外源性hPTH(1-34)对新生大鼠成骨细胞基质钙含量及钙化结节形成的影响。方法 新生大鼠成骨细胞原代培养，原子吸收分光光度法测细胞基质钙含量，von Kossa染色鉴定钙化结节。 结果 10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)持续作用于细胞，基质钙含量与对照相比显著降低；10-8mol.L-1h PTH(1-34)在以48小时为一循环的前12小时给药循环8次时基质钙含量达最高峰，与对照组相比增加576%，且形成钙化结节最多。 结论 hPTH(1-34)刺激成骨细胞基质钙含量及钙化结节形成与给药方式及药物浓度有关，低浓度间歇性给与hPTH(1-34)能提高成骨细胞基质钙及促进钙化结节形成。 Effect of human parathyroid hormone(1-34)on content of matrix calcium and
, http://www.100md.com
bone nodule formation of osteoblasts in neonatal rats
Han Zhiyan Cheng Jinxuan Liu Jingsheng
Institute of Basic Medical Science,Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College,Beijing 100005,China
Abstract To investigate the effect of human parathyroid hormone(1-34)[hPTH(1-34)]on the content of matrix calcium and bone nodule formation of osteoblasts. Methods Isolating the osteoblasts from newborn rat calvaria through trypsin digestion,contents of matrix calcium were detected by atomic absorptiometry and bone nodules were observed by von Kossa's staining. Results While given the osteoblasts with 10-10 mol.L-1hPTH(1-34) to 10-7mol.L-1hPTH(1-34)continuously,the contents of calcium had no discrepancy compared with the control group(P>0.05).Contents of calcium were increased 576% after the first 12 h of each 48 h incubation cycle for 8 cycles compared with control group under the effect of 10-8 mol.L-1hPTH(1-34)(P<0.01).The intermittent effect of PTH from 10-10 to 10-8 mol.L-1 on osteoblast matrix calcium was directly relative to its concentration.Bone nodules increased greatly under the effect of 10-8mol.L-1 hPTH(1-34) after first 12 hours of each 48h incubation cycle for 8 cycles. Conclusions PTH has diverse effect on contents of matrix calcium and bone nodule formation of osteoblasts, depending on the exposure time and its concentration in vitro.Contents of matrix calcium and bone nodule increase after intermittent exposure to hPTH(1-34).
, 百拇医药
Key words Human parathyroid hormone(1-34) Osteoblasts Matrix calcium Bone nodules
骨的矿化是指钙、磷等无机矿物质在合适的比例条件下以晶体形式沉积在骨基质的过程。由于骨质疏松的主要病理改变为骨的有机质与无机质等比例减少。因此，在研究人甲状旁腺素(1-34)[hPTH(1-34)]对成骨细胞分泌胶原改变的同时，应观察细胞间质中总钙含量及钙化结节形成的改变，帮助阐明间歇性注射hPTH(1-34)治疗骨质疏松的机制。
1 材料和方法
试剂：hPTH(1-34)、 胶原酶Ⅱ(Sigma公司)，DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(北京解放军军马研究所)，其余试剂均为国产分析纯试剂。
Wistar新生鼠成骨细胞原代培养：成骨细胞原代培养参考文献[1]。消化原代培养1代末细胞，用DMEM悬浮，至6孔板使其为4×103/cm2。待细胞贴壁后，用PBS洗2次，换含10%去类固醇胎牛血清的DMEM 1.5 ml，平衡12小时后，以48小时为1循环，加入不同浓度hPTH(1-34)使其在每一循环的开始分别作用1、6、12、24及48小时，经历8次循环，对照组加入hPTH(1-34)的溶媒1‰冰乙酸。
, http://www.100md.com
细胞基质钙含量的测定：药物终止作用后，PBS洗两次，用0.2 mol/L NaOH 1 ml溶解细胞及间质，于422.7 nm波长，原子吸收分光光度仪上测定每孔总Ca2+含量。
von Kossa染色显示钙化结节：药物终止作用后将6孔板用PBS冲洗几次，于95%乙醇中固定10分钟，PBS冲洗几次，pH4.5缓冲液(0.2 mol.L-1磷酸氢二钠9.09 ml，0.1 mol.L-1柠檬酸10.91 ml，pH4.5)中20分钟，5%硝酸银常温避光15分钟，紫外线照射10～20分钟，蒸馏水洗数次，5%硫代硫酸钠中2～3分钟,中性红或藏红花红作对比染色，照相。
统计学处理：所有数据均以平均数±标准差(
)表示，组间比较采用t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 hPTH(1-34)持续作用于细胞对其基质钙含量的影响
10-10～10-7mol.L-1hPTH(1-34)以48小时为1循环，持续作用8次循环。对照组细胞基质钙含量为(2.9±0.48)μg.孔-1，10-10～10-7 mol.L-1hPTH(1-34)作用组细胞基质钙含量分别为1.11±0.20、1.27±0.07、1.16±0.06、(2.32±0.13)μg.孔-1，与对照组相比有显著降低(P<0.01)(图1)。
, http://www.100md.com
图1 不同浓度hPTH(1-34)持续48小时
作用于成骨细胞对其基质钙含量的影响
(n=4,，与对照组相比*P<0.05
**P<0.01)
2.2 不同浓度PTH在不同作用时间下对细胞基质钙含量的影响
1小时作用组10-10mol.L-1～10-9mol.L-1hPTH(1-34)对细胞基质钙含量影响不大(P>0.05)，而10-8～10-7mol.L-1hPTH(1-34)对细胞基质钙含量分别比对照组升高62%(P<0.01)，47%(P<0.01)；6小时及12小时作用组10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)对细胞基质钙含量分别比对照组升高109%、247%、388%、98%和276%、410%、576%、294%(P<0.01)；24小时作用组10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)对细胞基质钙含量分别比对照组升高87%、178%、266%及150%(P<0.01)(图2)。
, http://www.100md.com
图2 不同浓度hPTH(1-34)在不同作用
时间下对细胞基质钙含量的影响
(n=4,，与对照相比*P<0.05)
2.3 光学显微镜下观察von Kossa染色钙化结节
特异von Kossa染色后培养板内肉眼可见棕黑色颗粒，显示结节内有钙盐沉积，表明培养细胞在体外形成钙化骨基质；光学显微镜下可见钙化灶点状散布于细胞中，被胶原纤维缠绕；钙化灶大小不等，略凸出于细胞层之上，10-8mol.L-1h PTH(1-34)从6小时作用组起就具有刺激钙化结节形成的作用，12小时作用组与对照组相比刺激钙化结节形成作用达最高峰，而10-8mol.L-1 hPTH(1-34)持续作用组与对照相比明显抑制钙化结节的形成(图3～6)。
, http://www.100md.com
图3 正常对照组成骨细胞钙
化结节 von Kossa染色
图4 10-8mol.L-1 hPTH(1-34)6小时作用组成
骨细胞钙化结节 von kossa染色
图5 10-8mol.L-1 hPTH(1-34)12小时作用组成
, http://www.100md.com
骨细胞钙化结节 von Kossa染色
图6 10-8mol.L-1 hPTH(1-34)48小时作用组成
骨细胞钙化结节 von Kossa染色
3 讨论
骨基质矿化的途径为成骨细胞合成并分泌骨的有机质，主要为骨的Ⅰ型胶原，胶原纤维形成框架区间，此为骨矿化提供了结构基础。机体吸收的钙离子和焦磷酸裂解的磷离子(以2∶1的比例)合成羟基磷灰石(骨无机盐的主体)转运至骨胶原间隙区域内，按一定的电位极性排列、沉积(骨胶原纤维间空隙区域间距离为0.5 nm，这与羟基磷灰石钙离子之间的距离相同)，磷灰石中的钙原子与胶原内骨钙素分子经β逆转的α单环结构的两个Gla残基形成化学键，完成骨基质的矿化。促进骨矿化的主要细胞是成骨细胞[2]。Bellows等研究证实，每个矿化结节均为1个具有形成结节的成骨细胞经过2～3周的增殖与分化而形成的[3]。
, 百拇医药
研究培养的成骨细胞基质钙的方法有很多，如组织化学染色法、定量荧光度法及原子吸收分光光度法，这些方法均可精确地反映细胞基质钙含量的变化。因此我们选用操作简单的原子吸收光谱法测量细胞内和细胞间隙中的总钙。
Prank等观察到，PTH在正常人中的分泌具有两个时相。一是PTH分泌的动力学状态在分钟与分钟之间的多变性，此时相的主要作用是调节血钙平衡。二是PTH分泌状态的高度稳定性，每天分泌次数及每次分泌量均有规律可寻，此时相的主要作用是维持正常骨量及骨代谢的平衡。在正常人中此二时相之间有一“开关”(switch)，每隔一定时间可使二时相进行相互转换，完成PTH的生理功能。在骨重建过程中，PTH血浆浓度的多变性可防止PTH受体对PTH亲和力的下调作用，而从PTH分泌的多变性向PTH分泌的高度规律转换，可维持骨吸收及骨形成的生理平衡。在骨质疏松病人体内缺乏使PTH从紊乱向规律转换的开关，也就是说PTH只能以杂乱无章形式分泌，造成骨形成及骨吸收的不平衡，引起骨量丢失及骨结构改变[4，5]。
, http://www.100md.com
根据PTH在体内分泌方式的独特性，我们采用间歇性用药方式，此方法为国内首次使用，为以后研究药物作用机制提供新的思路。结果发现：10-8mol.L-1 hPTH(1-34)在每48小时为一循环的前12小时作用于成骨细胞，循环8次后刺激原代培养的成骨细胞基质钙含量达最高峰，浓度降低其刺激钙沉积作用减弱，但至10-10mol.L-1时PTH仍有刺激成骨细胞基质钙沉积作用，hPTH(1-34)在10-10～10-8mol.L-1范围内刺激成骨细胞基质钙沉积呈量效依赖关系，而10-7mol.L-1 hPTH(1-34)刺激基质钙沉积作用却低于10-8mol.L-1 hPTH(1-34)。10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)48小时持续作用于细胞，循环8次后却明显抑制基质钙沉积。在此基础上我们进一步通过von Kossa染色观察hPTH(1-34)对细胞间质内钙化结节的形成影响。结果表明10-8mol.L-1 hPTH(1-34)在每48小时为一循环的前12小时给药下循环8次后刺激原代培养成骨细胞钙化结节形成数目最多，而hPTH(1-34)持续作用组与对照相比却明显抑制钙化结节的形成。
, http://www.100md.com
本实验在细胞水平上证实低浓度间歇性给予hTPH(1-34)具有刺激成骨细胞形成钙化结节作用。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39300152)
作者简历：韩志岩，女28岁。1994年考入协和医科大学攻读药理学研究生，因成绩优异1996年转为本专业博士研究生。目前已通过论文答辩，将于1999年7月获医学博士学位。研究生期间一直从事hPTH(1-34)对成骨细胞作用研究，在国家一级杂志发表论文6篇，并参加一次国际会议(第一作者大会交流)。现为北京生理科学会会员。
参考文献
1 韩志岩，刘景生.甲状旁腺素对Wistar新生鼠成骨细胞增殖作用的影响.基础医学与临床，1998(6)：33.
2 刘忠厚主编.骨质疏松学.科学出版版，1998，91-93.
, 百拇医药
3 Bellows CG,Aubin JEM,Antosa ME.Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria populations.Calcif Tissue Int,1986,38:143.
4 Lennard JD,Steven JS.Predicting PTH pulses and patterns in osteoporosis.J Clin Invest,1995,96:2433.
5 Prank K,Steven JN,Heio MH,et al.Time series prediction of plasma hormone concentration.J Clin Invest,1995,96:2910., 百拇医药
单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院药理室
关键词：人甲状旁腺素(1-34)[hPTH(1-34)]；成骨细胞；基质钙；钙化结节
人甲状旁腺素 摘要 目的 研究外源性hPTH(1-34)对新生大鼠成骨细胞基质钙含量及钙化结节形成的影响。方法 新生大鼠成骨细胞原代培养，原子吸收分光光度法测细胞基质钙含量，von Kossa染色鉴定钙化结节。 结果 10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)持续作用于细胞，基质钙含量与对照相比显著降低；10-8mol.L-1h PTH(1-34)在以48小时为一循环的前12小时给药循环8次时基质钙含量达最高峰，与对照组相比增加576%，且形成钙化结节最多。 结论 hPTH(1-34)刺激成骨细胞基质钙含量及钙化结节形成与给药方式及药物浓度有关，低浓度间歇性给与hPTH(1-34)能提高成骨细胞基质钙及促进钙化结节形成。 Effect of human parathyroid hormone(1-34)on content of matrix calcium and
, http://www.100md.com
bone nodule formation of osteoblasts in neonatal rats
Han Zhiyan Cheng Jinxuan Liu Jingsheng
Institute of Basic Medical Science,Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College,Beijing 100005,China
Abstract To investigate the effect of human parathyroid hormone(1-34)[hPTH(1-34)]on the content of matrix calcium and bone nodule formation of osteoblasts. Methods Isolating the osteoblasts from newborn rat calvaria through trypsin digestion,contents of matrix calcium were detected by atomic absorptiometry and bone nodules were observed by von Kossa's staining. Results While given the osteoblasts with 10-10 mol.L-1hPTH(1-34) to 10-7mol.L-1hPTH(1-34)continuously,the contents of calcium had no discrepancy compared with the control group(P>0.05).Contents of calcium were increased 576% after the first 12 h of each 48 h incubation cycle for 8 cycles compared with control group under the effect of 10-8 mol.L-1hPTH(1-34)(P<0.01).The intermittent effect of PTH from 10-10 to 10-8 mol.L-1 on osteoblast matrix calcium was directly relative to its concentration.Bone nodules increased greatly under the effect of 10-8mol.L-1 hPTH(1-34) after first 12 hours of each 48h incubation cycle for 8 cycles. Conclusions PTH has diverse effect on contents of matrix calcium and bone nodule formation of osteoblasts, depending on the exposure time and its concentration in vitro.Contents of matrix calcium and bone nodule increase after intermittent exposure to hPTH(1-34).
, 百拇医药
Key words Human parathyroid hormone(1-34) Osteoblasts Matrix calcium Bone nodules
骨的矿化是指钙、磷等无机矿物质在合适的比例条件下以晶体形式沉积在骨基质的过程。由于骨质疏松的主要病理改变为骨的有机质与无机质等比例减少。因此，在研究人甲状旁腺素(1-34)[hPTH(1-34)]对成骨细胞分泌胶原改变的同时，应观察细胞间质中总钙含量及钙化结节形成的改变，帮助阐明间歇性注射hPTH(1-34)治疗骨质疏松的机制。
1 材料和方法
试剂：hPTH(1-34)、 胶原酶Ⅱ(Sigma公司)，DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(北京解放军军马研究所)，其余试剂均为国产分析纯试剂。
Wistar新生鼠成骨细胞原代培养：成骨细胞原代培养参考文献[1]。消化原代培养1代末细胞，用DMEM悬浮，至6孔板使其为4×103/cm2。待细胞贴壁后，用PBS洗2次，换含10%去类固醇胎牛血清的DMEM 1.5 ml，平衡12小时后，以48小时为1循环，加入不同浓度hPTH(1-34)使其在每一循环的开始分别作用1、6、12、24及48小时，经历8次循环，对照组加入hPTH(1-34)的溶媒1‰冰乙酸。
, http://www.100md.com
细胞基质钙含量的测定：药物终止作用后，PBS洗两次，用0.2 mol/L NaOH 1 ml溶解细胞及间质，于422.7 nm波长，原子吸收分光光度仪上测定每孔总Ca2+含量。
von Kossa染色显示钙化结节：药物终止作用后将6孔板用PBS冲洗几次，于95%乙醇中固定10分钟，PBS冲洗几次，pH4.5缓冲液(0.2 mol.L-1磷酸氢二钠9.09 ml，0.1 mol.L-1柠檬酸10.91 ml，pH4.5)中20分钟，5%硝酸银常温避光15分钟，紫外线照射10～20分钟，蒸馏水洗数次，5%硫代硫酸钠中2～3分钟,中性红或藏红花红作对比染色，照相。
统计学处理：所有数据均以平均数±标准差(
)表示，组间比较采用t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 hPTH(1-34)持续作用于细胞对其基质钙含量的影响
10-10～10-7mol.L-1hPTH(1-34)以48小时为1循环，持续作用8次循环。对照组细胞基质钙含量为(2.9±0.48)μg.孔-1，10-10～10-7 mol.L-1hPTH(1-34)作用组细胞基质钙含量分别为1.11±0.20、1.27±0.07、1.16±0.06、(2.32±0.13)μg.孔-1，与对照组相比有显著降低(P<0.01)(图1)。
, http://www.100md.com
图1 不同浓度hPTH(1-34)持续48小时
作用于成骨细胞对其基质钙含量的影响
(n=4,
，与对照组相比*P<0.05**P<0.01)
2.2 不同浓度PTH在不同作用时间下对细胞基质钙含量的影响
1小时作用组10-10mol.L-1～10-9mol.L-1hPTH(1-34)对细胞基质钙含量影响不大(P>0.05)，而10-8～10-7mol.L-1hPTH(1-34)对细胞基质钙含量分别比对照组升高62%(P<0.01)，47%(P<0.01)；6小时及12小时作用组10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)对细胞基质钙含量分别比对照组升高109%、247%、388%、98%和276%、410%、576%、294%(P<0.01)；24小时作用组10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)对细胞基质钙含量分别比对照组升高87%、178%、266%及150%(P<0.01)(图2)。
, http://www.100md.com
图2 不同浓度hPTH(1-34)在不同作用
时间下对细胞基质钙含量的影响
(n=4,
，与对照相比*P<0.05)2.3 光学显微镜下观察von Kossa染色钙化结节
特异von Kossa染色后培养板内肉眼可见棕黑色颗粒，显示结节内有钙盐沉积，表明培养细胞在体外形成钙化骨基质；光学显微镜下可见钙化灶点状散布于细胞中，被胶原纤维缠绕；钙化灶大小不等，略凸出于细胞层之上，10-8mol.L-1h PTH(1-34)从6小时作用组起就具有刺激钙化结节形成的作用，12小时作用组与对照组相比刺激钙化结节形成作用达最高峰，而10-8mol.L-1 hPTH(1-34)持续作用组与对照相比明显抑制钙化结节的形成(图3～6)。
, http://www.100md.com
图3 正常对照组成骨细胞钙
化结节 von Kossa染色
图4 10-8mol.L-1 hPTH(1-34)6小时作用组成
骨细胞钙化结节 von kossa染色
图5 10-8mol.L-1 hPTH(1-34)12小时作用组成
, http://www.100md.com
骨细胞钙化结节 von Kossa染色
图6 10-8mol.L-1 hPTH(1-34)48小时作用组成
骨细胞钙化结节 von Kossa染色
3 讨论
骨基质矿化的途径为成骨细胞合成并分泌骨的有机质，主要为骨的Ⅰ型胶原，胶原纤维形成框架区间，此为骨矿化提供了结构基础。机体吸收的钙离子和焦磷酸裂解的磷离子(以2∶1的比例)合成羟基磷灰石(骨无机盐的主体)转运至骨胶原间隙区域内，按一定的电位极性排列、沉积(骨胶原纤维间空隙区域间距离为0.5 nm，这与羟基磷灰石钙离子之间的距离相同)，磷灰石中的钙原子与胶原内骨钙素分子经β逆转的α单环结构的两个Gla残基形成化学键，完成骨基质的矿化。促进骨矿化的主要细胞是成骨细胞[2]。Bellows等研究证实，每个矿化结节均为1个具有形成结节的成骨细胞经过2～3周的增殖与分化而形成的[3]。
, 百拇医药
研究培养的成骨细胞基质钙的方法有很多，如组织化学染色法、定量荧光度法及原子吸收分光光度法，这些方法均可精确地反映细胞基质钙含量的变化。因此我们选用操作简单的原子吸收光谱法测量细胞内和细胞间隙中的总钙。
Prank等观察到，PTH在正常人中的分泌具有两个时相。一是PTH分泌的动力学状态在分钟与分钟之间的多变性，此时相的主要作用是调节血钙平衡。二是PTH分泌状态的高度稳定性，每天分泌次数及每次分泌量均有规律可寻，此时相的主要作用是维持正常骨量及骨代谢的平衡。在正常人中此二时相之间有一“开关”(switch)，每隔一定时间可使二时相进行相互转换，完成PTH的生理功能。在骨重建过程中，PTH血浆浓度的多变性可防止PTH受体对PTH亲和力的下调作用，而从PTH分泌的多变性向PTH分泌的高度规律转换，可维持骨吸收及骨形成的生理平衡。在骨质疏松病人体内缺乏使PTH从紊乱向规律转换的开关，也就是说PTH只能以杂乱无章形式分泌，造成骨形成及骨吸收的不平衡，引起骨量丢失及骨结构改变[4，5]。
, http://www.100md.com
根据PTH在体内分泌方式的独特性，我们采用间歇性用药方式，此方法为国内首次使用，为以后研究药物作用机制提供新的思路。结果发现：10-8mol.L-1 hPTH(1-34)在每48小时为一循环的前12小时作用于成骨细胞，循环8次后刺激原代培养的成骨细胞基质钙含量达最高峰，浓度降低其刺激钙沉积作用减弱，但至10-10mol.L-1时PTH仍有刺激成骨细胞基质钙沉积作用，hPTH(1-34)在10-10～10-8mol.L-1范围内刺激成骨细胞基质钙沉积呈量效依赖关系，而10-7mol.L-1 hPTH(1-34)刺激基质钙沉积作用却低于10-8mol.L-1 hPTH(1-34)。10-10～10-7mol.L-1 hPTH(1-34)48小时持续作用于细胞，循环8次后却明显抑制基质钙沉积。在此基础上我们进一步通过von Kossa染色观察hPTH(1-34)对细胞间质内钙化结节的形成影响。结果表明10-8mol.L-1 hPTH(1-34)在每48小时为一循环的前12小时给药下循环8次后刺激原代培养成骨细胞钙化结节形成数目最多，而hPTH(1-34)持续作用组与对照相比却明显抑制钙化结节的形成。
, http://www.100md.com
本实验在细胞水平上证实低浓度间歇性给予hTPH(1-34)具有刺激成骨细胞形成钙化结节作用。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39300152)
作者简历：韩志岩，女28岁。1994年考入协和医科大学攻读药理学研究生，因成绩优异1996年转为本专业博士研究生。目前已通过论文答辩，将于1999年7月获医学博士学位。研究生期间一直从事hPTH(1-34)对成骨细胞作用研究，在国家一级杂志发表论文6篇，并参加一次国际会议(第一作者大会交流)。现为北京生理科学会会员。
参考文献
1 韩志岩，刘景生.甲状旁腺素对Wistar新生鼠成骨细胞增殖作用的影响.基础医学与临床，1998(6)：33.
2 刘忠厚主编.骨质疏松学.科学出版版，1998，91-93.
, 百拇医药
3 Bellows CG,Aubin JEM,Antosa ME.Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria populations.Calcif Tissue Int,1986,38:143.
4 Lennard JD,Steven JS.Predicting PTH pulses and patterns in osteoporosis.J Clin Invest,1995,96:2433.
5 Prank K,Steven JN,Heio MH,et al.Time series prediction of plasma hormone concentration.J Clin Invest,1995,96:2910., 百拇医药