载脂蛋白E基因多态性对血脂水平的影响及与冠状动脉狭窄的关系
作者：李卫华 黄德嘉 杜修海 张卫泽 胡静泠
单位：李卫华(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；杜修海(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；张卫泽(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；胡静泠(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；黄德嘉(华西医科大学附属第一医院心内科，成都 610041)
关键词：载脂蛋白E；基因； 多态性；血脂；冠状动脉疾病；再狭窄
中国动脉硬化杂志000115[摘 要] 为探讨载脂蛋白E基因多态性对血脂水平的影响及与冠状动脉狭 窄程度的关系， 采用聚合酶链反应—限制片段长度多态性对95例冠心病患者和46例正常对照者载脂者蛋白E 基因 型进行分析，同时测定血脂及载脂蛋白B水平。并根据冠状动脉受累支数不同将冠心病患 者分 为冠状动脉多支病变组和单支病变组。结果显示，55例冠状动脉病变多支组和40例冠状动脉 单支病变 组E3/4基因型和ε4 等位基因频率均高于对照组(P<0.01)，且多支 病变组E3/4基因 型和ε4 等位基因频率高于单支病变组(P<0.05)。与E3/3及E2/3基因型比 较，E3/4基因型者 有较高的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白B水平及较低的高密 度脂蛋白胆固醇水平。与对照组比较，冠心病组E3/4基因型升高总胆固醇、低密度脂蛋白胆 固醇和载脂蛋白B的作用及降低高密度脂蛋白胆固醇的作用更明显。表明载脂蛋白E基因多态 性影响血胆固醇代谢 ，ε4等位基因与冠心病危险性增加有关，ε4等位基因频率升高的冠心病者冠状动脉受 累支数加重，推测ε4等位基因可能与冠状动脉狭窄程度存在内在联系。
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[中图分类号] R363.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949( 2000)-01-0054-04
Effect of Apolipoprotein E Polymorphisms on Serum Lipids and Relation to Coronary Stenosis
LI Wei-Hua HUANG De-Jia DU Xiu-Hai ZHANG Wei-Ze HU Jing-Ling
(Department of Cardiology, Lanzhou General Hospital , Lanzhou 730050 , China)
ABSTRACT Aim To evaluate the effect of apolipoprotein E (apo E) polymorphism on serum lipids and the relationship between apo E polymor p hism and coronary stenosis. Methods The poly morphis site of apo E ge ne were studied using polymerase chain reaction-restriction fragment l ength polymorphism (PCR-RFLP) in 95 cases with coronary artery disease (CAD) and in 46 controls of equivalent age. The serum lipids a nd apolipoprotein B (apo B) levels were measured in the two groups. Results The frequen cres of apo E3/4 genotype and apo E4 allele were significantly higher in 55 cases of CAD with multiple vessel dissease (MVD) and in 40 ca ses of CAD with single vessel disease (SVD) than in 46 controls (P<0 .01), while there were significantly higher in the MVD groups than in the SVD groups (P<0.05). Apo E3/4 genotype had signifi cantly higher s erum total cholesterol (TC), LDL-cholesterol (LDLC) and apo B levels and lower HDL-cholesterol (HDLC) level compared to apo E3/3 and apo E2/3 genotypes in the patients and in the controls. In the patients , ap o E3/4 genotype had significantly higher TC, LDLC and apo B levels an d lower HDLC levels compared with in the controls . C onclusions It is concluded that apoE polymorphism is involved in cholesterol metabolism , where apo E4 allele is associated with an increased risk of CAD. In CAD cases , an increased frequency of apo E4 allele is associated with an increased severity of coronary stenosis. Therefore it is assumed t h at there is certain relation between apoE4 allale and severity of cor onary stenosis.
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MeSH Apolipoprotein E; Genes; Polymorphisms; Se rum Lipids; Coronary Artery Disease; Stenosis
动脉粥样硬化(atherosclerosis， As)的发病机制受多种因素的影响，其中脂质沉 积在As形成过程中起重要作用。研究发现，载脂蛋白 E (apolipoprotein E， apo E)在脂 代 谢及巨噬细胞聚集脂质中发挥重要作用[1]。载脂蛋白E结构基因存在多态性，这种多态性是 决定个体血脂水平差异的重要遗传因素之 一[2]。急性心肌梗死与As的发生发展密 切相关，是早发冠心病的预测因子[3]。最近的研究表明，载脂蛋白 E基因多态性 与冠心病的严重程度相关[ 4]。但对这一假说迄今尚未得到明确的结论。本文通过对经冠状动脉造影证实的不同狭 窄程 度的冠状动脉病变者与冠状动脉正常者进行载脂蛋白 E基因型分析及血脂测定，以探讨载脂 蛋 白 E基因多态性对血脂水平的影响及与冠状动脉狭窄程度间可能的内在联系。
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1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 冠心病组 造影结果显示至少一支冠状动脉主支狭窄≥50% ，并根据病变累及大冠状动 脉及其主要分支的血管条数分为两组：①单支病变组40例，男性28例，女性12例，平均年龄 59.1±8.3岁；②多支病变组(左主干或冠状动脉主要分支狭窄≥2支)55例，男性35例，女性 20例，平均年龄59.1±9.5岁。
1.1.2 对照组 造影结果显示冠状动脉正常者46例，男性28例，女性18例，平 均年龄57.9±9. 0岁。以上研究对象排除家族性高胆固醇血症、糖尿病、甲状腺功能异常及肝肾功能障 碍者。近两个月内未服用降脂、抗凝及止血药等。两组在年龄、体重指数、吸烟状况、血压 及心功能方面均无统计学差异(P>0.05)。
1.2 血脂水平检测
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所有研究对象均于清晨空腹采静脉血10 m，其中5 mL放置含EDTA抗凝管中待测载脂蛋白 E基因型，另5 mL离心后将血清置-70℃冻存待查血脂。血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein chol e sterol,HDLC)采用标准酶法测定，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholest erol,LDLC)采用Friedewald公式计算：LDLC=(TC-HDLC-1)/5TG(各项指标单位均为 mmol/L，TG<4 mmol/L时此公式适用)，载脂蛋白B采用免疫比浊法测定。以上指标测定均 由专人操作，由同一台全自动生物化学分析仪完成。
1.3 载脂蛋白E基因型分析
1.3.1 基因组DNA的提取 参照文献[5]，取EDTA抗凝血5 mL，离心后的沉淀物加5倍体 积双蒸水混匀， 3 500 rpm离心20 min，弃上清，加生理盐水10 mL洗涤，收获白细胞。加入10 mL细胞裂解 液 ，混匀，3 500 rpm离心15 min，弃上清，加STE 3 mL，10% SDS 0.3 mL和蛋白酶K 0.2 mL 混 匀，置37℃孵育12 h。以酚、氯仿萃取三次，10 000 rpm离心10 min；上清加1/10体积3 mo l/L醋酸钠，2倍体积冷无水乙醇，沉淀DNA，70%乙醇漂洗二次。TE溶解，置-20℃保存。备 用模板DNA。
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1.3.2 聚合酶链反应引物扩增 参照文献[6]，引物序列为:引物F4:5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'，引物F6:5'-TAAGCTTGGCACGGCTG TCCAAGGA-3'(上海细胞研究所合成)。PCR反应总体积50 μL，包括10 μmol/L Tris-HCl 、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、引物F4和F6各0.3 μmol/L、dNTPs各0.12 mmol/ L、模板DNA 0.1～ 0.3 μg及Taq聚合酶2u，混匀后加等体积石蜡油覆盖。反应程序：加Taq聚合酶前以95℃ 1 0 min预 变性，以后每个循环均以95℃变性1 min，57℃复性1.5 min，72℃延伸2 min，循环30次 后于72℃保温5 min，终止反应。取5 μL扩增产物进行2%琼脂糖电泳鉴定。
1.3.3 聚合酶链反应扩增产物的检测 取扩增的PCR产物(244 bp)10 μL ，加入HhaI 1 μL，37℃进行酶切反应 3 h，取10 μL产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染法判定结果。
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1.4 统计学处理
数据用均数±标准差(
±s)表示，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 冠心病组与对照组血脂水平比较
从表1 (Table 1) 可见，冠心病多支病变组和单支病变组TC、LDLC及载脂蛋白B水平均高 于对照组(P<0.0 1)，且随冠状动脉受累支数的加重，TC、LDLC及载脂蛋白B水平呈上升趋势，而HDLC呈降 低趋势。
表1. 不同冠状动脉病变组与对照组血脂水平比较
Table 1. Comparison of serum lipids levels between
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control group and diff erent vessels disease group (±s) Index
Control group
(n=46)
SVD group
(n=40)
MVD group
(n=55)
TC (mmol/L)
4.07±0.83
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5.75±0.91a
TG (mmol/L)
1.41±0.27
1.44±0.23
1.47±0.29
HDLC (mmol/L)
1.26±0.21
1.07±0.24b
1.05±0.23b
LDLC (mmol/L)
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2.53±0.57
3.06±0.58a
4.41±0.62a
Apo B (g/L)
0.61±0.30
0.80±0.31a
0.84±0.31a
a: P<0.01, b: P<0.05, compared with contr ol group. MVD group:mitiple vessel disease group; SVD group:single vessel disease group
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2.2 冠心病组与对照组载脂蛋白E基因型比较
从表2 (Table 2)可见，141例研究对象中，载脂蛋白E基因型以E3/3频率最高，而E2/2、E2/4 及 E4/4频率则很低。冠状动脉多支病变组和单支病变组E3/4频率均高于对照组，而E3/3频率略 低于对照组。冠状动脉多支病变组E2/3频率较对照组低。各组等位基因累积频率按公式计算 ，冠状动脉多支病变组和单支病变组ε4频率均明显高于对照组，且多支病变组ε4频率高于 单支病变组。此外，多支病变组ε2频率低于对照组。
表2. 不同冠状动脉病变组与对照组载脂蛋白E基因型及等位基因频率分布比较
Table 2. Comparison of apolipoprotein E genotypes and frequenci es of
allele between defferent vessels disease group and control group (n,%) Genotypes
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Control
(n=46)
SVD
(n=40)
MVD
(n=55)
Total
(n=141)
E2/2
1(2.2)
1(2.5)
0(0)
2(1.4)
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E2/3
4(8.7)
3(7.5)
3(5.4)bd
10(7.1)
E2/4
1(2.2)
1(2.5)
2(3.6)
4(2.8)
E3/3
34(73.9)
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27(67.7)
34(61.8)
95(67.4)
E3/4
6(13.0)
7(17.3)b
14(25.6)ac
27(19.1)
E4/4
0(0)
1(2.5)
2(3.6)
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3(2.1)
Alleles
ε2
3(7.6)
3(7.5)
3(4.5)bd
9(6.4)
ε3
40(84.8)
32(80.1)
42(77.3)
114(80.5)
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ε4
3(7.6)
5(12.4)b
10(18.2)ad
18(13.1)
a: P<0.01, b:P<0.05,compared with control group；c: P<0.01, d: P<0.05,compared with SVD gr oup
2.3 冠心病组与对照组不同载脂蛋白E基因型血脂水平比较
按载脂蛋白 E六种基因型分为三组：E2/2+E2/3、E3/3、E3/4+E4/4。E2/4因中性作用而 排除在外。由表3 (Table 3)可见,在不同基因型间，TC、LDLC及载脂蛋白B水平均按E3/4+ E4/4>E3/3>E2/ 2+E2/3顺序递减，而HDLC水平按E3/4+E4/40.05)。
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表3. 冠心病组与对照组不同基因型间血脂水平比较
Table 3. comparison of different ApoE genotypes with
serum lipids level in co ntrol group and CHD group (±s) Index
E2/2+E2/3
E3/3
E3/4+E4/4
CHD(n=7)
Control(n=5)
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CHD(n=61)
Control(n=34)
CHD(n=24)
Control(n=6)
TC(mmol/L)
5.05±0.85a
3.97±0.81
5.20±0.82b
4.18±0.80
5.95±0.86a
4.35±0.83
, 百拇医药
TG(mmol/L)
1.87±0.80
1.36±0.28
1.55±0.84
1.16±0.31
1.23±0.81
1.15±0.29
HDLC(mmol/L)
1.26±0.31b
1.33±0.30
1.16±0.29b
, 百拇医药
1.27±0.29
1.05±0.28b
1.15±0.31
LDLC(mmol/L)
3.42±0.38a
2.37±0.45
3.37±0.36b
2.63±0.44
4.28±0.42a
2.97±0.46
, 百拇医药 Apo B(g/L)
0.71±0.20a
0.51±0.19
0.82±0.19a
0.62±0.18
0.88±0.20a
0.69±0.21
a: P<0.01, b: P<0.05, compared with control group
3 讨论
载脂蛋白E结构基因存在多态性，三种常见等位基因ε2、ε3和ε4分别编码载脂蛋白 E的三种主要异构体E2、E3和E4。不同载脂蛋白 E异构体显示不同的受体结合活性，从而导 致个体间血脂水平的差异，这是载脂蛋白 E与As的发生发展密切相关的重要基础[7] 。本文观察到，在 不同基因型的冠心病组与对照组中，ε4 等位基因携带者均伴有血清总胆固醇、低密度脂蛋 白胆固醇及载 脂蛋白 B水平的升高，其升高趋势为：E3/4+E4/4>E3/3>E2/2+E2/3，且冠心病组ε4等位基 因升高总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及载脂蛋白B的作用较对照组更明显。与多数研究认 为ε4等位基因变异影 响血胆固醇和载脂蛋白 B水平的结果相符[2～4]。提示载脂蛋白E基因多态性是影 响个体血脂水平差异的内在遗传因素之一，推测其机制除与不同载脂蛋白E异构体的受体结 合活性及体内代谢速率明显差异有关外，尚可能与肠道对胆固醇摄取能力的差异有关[ 8]。此外，本文研究显示，冠心病组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇及载脂 蛋白 B水平均高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇低于对照组，且随冠状动脉病变累及条数的加 重，总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平 明显升高，进一步支持血脂异常是冠心病的重要危险因素，尤其是血清高胆固醇水平与As程 度呈正相关。
, 百拇医药
由于载脂蛋白 E基因多态性与血脂之间，以及血脂异常与冠心病之间的密切联系，载脂蛋白 E基 因多态性与冠心病之间的可能内在联系成为人们关注的热点。近年来有研究表明，在经冠状 动脉 造影证实的冠心病患者及急性心肌梗死患者中，ε4等位基因频率明显升高[9，10] 。本文观察显 示，冠状动脉多支病变组和单支病变组ε4 等位基因频率均明显高于对照组。此外，多 支病变组ε4等位基因频率高于单支病变组，而ε2等位基因频率低于后者，提示 随着ε4等位基因频率的升高，冠状动脉狭窄的严重程度可能进一步加重。Wang等[11 ]研究发现， 冠心病患者ε4 等位基因携带者其冠状动脉病变程度明显加重。随着病变累及大冠状动脉及 其主要分 支血管条数的递增，其ε4等位基因频率呈增加趋势。Lehtinen等[9]报道，ε4 等 位基因与冠状动脉病变 的严重程度具有相关性。冠状动脉三支或三支以上病变者血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固 醇及ε4频率分布均明显高 于一支或二支病变者。这些结果均支持本文的观察结果。其机制可能是ε4 等位基因不仅 与血浆高胆固醇和载脂蛋白 B水平相关，而且还与动脉粥样硬化性损伤有关，但也有一些研 究持相反观点。Kusisto等[12]认为，ε4 等位基因与冠心病的严重性无关。最近 国内有人报 道载脂蛋白E基因多态性与冠状动脉受累数目无关[13]，其原因可能与冠心病危险 因素的多元性以及存在冠心病诊断标准，标本量大小和研究手段的限制等问题有关。
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载脂蛋白E基因多态性是影响个体间血脂水平的内在遗传因素之一，尤其对血浆 胆固醇和载脂蛋白 B水平的影响，并在一定程度上影响冠状动脉病变的严重性。推测ε4 等 位基因频率升高可能对冠状动脉狭窄程度有预测价值，还需在大样本的前瞻性研究中 进一步证实。
[作者简介] 李卫华，女，1968年2月出生，硕士研究生毕 业，现为住院医师。
参考文献
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(此文1999-08-25收到，2000-02-08修回), 百拇医药
单位：李卫华(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；杜修海(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；张卫泽(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；胡静泠(兰州军区总医院心内科, 兰州 730050)；黄德嘉(华西医科大学附属第一医院心内科，成都 610041)
关键词：载脂蛋白E；基因； 多态性；血脂；冠状动脉疾病；再狭窄
中国动脉硬化杂志000115[摘 要] 为探讨载脂蛋白E基因多态性对血脂水平的影响及与冠状动脉狭 窄程度的关系， 采用聚合酶链反应—限制片段长度多态性对95例冠心病患者和46例正常对照者载脂者蛋白E 基因 型进行分析，同时测定血脂及载脂蛋白B水平。并根据冠状动脉受累支数不同将冠心病患 者分 为冠状动脉多支病变组和单支病变组。结果显示，55例冠状动脉病变多支组和40例冠状动脉 单支病变 组E3/4基因型和ε4 等位基因频率均高于对照组(P<0.01)，且多支 病变组E3/4基因 型和ε4 等位基因频率高于单支病变组(P<0.05)。与E3/3及E2/3基因型比 较，E3/4基因型者 有较高的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白B水平及较低的高密 度脂蛋白胆固醇水平。与对照组比较，冠心病组E3/4基因型升高总胆固醇、低密度脂蛋白胆 固醇和载脂蛋白B的作用及降低高密度脂蛋白胆固醇的作用更明显。表明载脂蛋白E基因多态 性影响血胆固醇代谢 ，ε4等位基因与冠心病危险性增加有关，ε4等位基因频率升高的冠心病者冠状动脉受 累支数加重，推测ε4等位基因可能与冠状动脉狭窄程度存在内在联系。
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[中图分类号] R363.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949( 2000)-01-0054-04
Effect of Apolipoprotein E Polymorphisms on Serum Lipids and Relation to Coronary Stenosis
LI Wei-Hua HUANG De-Jia DU Xiu-Hai ZHANG Wei-Ze HU Jing-Ling
(Department of Cardiology, Lanzhou General Hospital , Lanzhou 730050 , China)
ABSTRACT Aim To evaluate the effect of apolipoprotein E (apo E) polymorphism on serum lipids and the relationship between apo E polymor p hism and coronary stenosis. Methods The poly morphis site of apo E ge ne were studied using polymerase chain reaction-restriction fragment l ength polymorphism (PCR-RFLP) in 95 cases with coronary artery disease (CAD) and in 46 controls of equivalent age. The serum lipids a nd apolipoprotein B (apo B) levels were measured in the two groups. Results The frequen cres of apo E3/4 genotype and apo E4 allele were significantly higher in 55 cases of CAD with multiple vessel dissease (MVD) and in 40 ca ses of CAD with single vessel disease (SVD) than in 46 controls (P<0 .01), while there were significantly higher in the MVD groups than in the SVD groups (P<0.05). Apo E3/4 genotype had signifi cantly higher s erum total cholesterol (TC), LDL-cholesterol (LDLC) and apo B levels and lower HDL-cholesterol (HDLC) level compared to apo E3/3 and apo E2/3 genotypes in the patients and in the controls. In the patients , ap o E3/4 genotype had significantly higher TC, LDLC and apo B levels an d lower HDLC levels compared with in the controls . C onclusions It is concluded that apoE polymorphism is involved in cholesterol metabolism , where apo E4 allele is associated with an increased risk of CAD. In CAD cases , an increased frequency of apo E4 allele is associated with an increased severity of coronary stenosis. Therefore it is assumed t h at there is certain relation between apoE4 allale and severity of cor onary stenosis.
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MeSH Apolipoprotein E; Genes; Polymorphisms; Se rum Lipids; Coronary Artery Disease; Stenosis
动脉粥样硬化(atherosclerosis， As)的发病机制受多种因素的影响，其中脂质沉 积在As形成过程中起重要作用。研究发现，载脂蛋白 E (apolipoprotein E， apo E)在脂 代 谢及巨噬细胞聚集脂质中发挥重要作用[1]。载脂蛋白E结构基因存在多态性，这种多态性是 决定个体血脂水平差异的重要遗传因素之 一[2]。急性心肌梗死与As的发生发展密 切相关，是早发冠心病的预测因子[3]。最近的研究表明，载脂蛋白 E基因多态性 与冠心病的严重程度相关[ 4]。但对这一假说迄今尚未得到明确的结论。本文通过对经冠状动脉造影证实的不同狭 窄程 度的冠状动脉病变者与冠状动脉正常者进行载脂蛋白 E基因型分析及血脂测定，以探讨载脂 蛋 白 E基因多态性对血脂水平的影响及与冠状动脉狭窄程度间可能的内在联系。
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1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 冠心病组 造影结果显示至少一支冠状动脉主支狭窄≥50% ，并根据病变累及大冠状动 脉及其主要分支的血管条数分为两组：①单支病变组40例，男性28例，女性12例，平均年龄 59.1±8.3岁；②多支病变组(左主干或冠状动脉主要分支狭窄≥2支)55例，男性35例，女性 20例，平均年龄59.1±9.5岁。
1.1.2 对照组 造影结果显示冠状动脉正常者46例，男性28例，女性18例，平 均年龄57.9±9. 0岁。以上研究对象排除家族性高胆固醇血症、糖尿病、甲状腺功能异常及肝肾功能障 碍者。近两个月内未服用降脂、抗凝及止血药等。两组在年龄、体重指数、吸烟状况、血压 及心功能方面均无统计学差异(P>0.05)。
1.2 血脂水平检测
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所有研究对象均于清晨空腹采静脉血10 m，其中5 mL放置含EDTA抗凝管中待测载脂蛋白 E基因型，另5 mL离心后将血清置-70℃冻存待查血脂。血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein chol e sterol,HDLC)采用标准酶法测定，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholest erol,LDLC)采用Friedewald公式计算：LDLC=(TC-HDLC-1)/5TG(各项指标单位均为 mmol/L，TG<4 mmol/L时此公式适用)，载脂蛋白B采用免疫比浊法测定。以上指标测定均 由专人操作，由同一台全自动生物化学分析仪完成。
1.3 载脂蛋白E基因型分析
1.3.1 基因组DNA的提取 参照文献[5]，取EDTA抗凝血5 mL，离心后的沉淀物加5倍体 积双蒸水混匀， 3 500 rpm离心20 min，弃上清，加生理盐水10 mL洗涤，收获白细胞。加入10 mL细胞裂解 液 ，混匀，3 500 rpm离心15 min，弃上清，加STE 3 mL，10% SDS 0.3 mL和蛋白酶K 0.2 mL 混 匀，置37℃孵育12 h。以酚、氯仿萃取三次，10 000 rpm离心10 min；上清加1/10体积3 mo l/L醋酸钠，2倍体积冷无水乙醇，沉淀DNA，70%乙醇漂洗二次。TE溶解，置-20℃保存。备 用模板DNA。
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1.3.2 聚合酶链反应引物扩增 参照文献[6]，引物序列为:引物F4:5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'，引物F6:5'-TAAGCTTGGCACGGCTG TCCAAGGA-3'(上海细胞研究所合成)。PCR反应总体积50 μL，包括10 μmol/L Tris-HCl 、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、引物F4和F6各0.3 μmol/L、dNTPs各0.12 mmol/ L、模板DNA 0.1～ 0.3 μg及Taq聚合酶2u，混匀后加等体积石蜡油覆盖。反应程序：加Taq聚合酶前以95℃ 1 0 min预 变性，以后每个循环均以95℃变性1 min，57℃复性1.5 min，72℃延伸2 min，循环30次 后于72℃保温5 min，终止反应。取5 μL扩增产物进行2%琼脂糖电泳鉴定。
1.3.3 聚合酶链反应扩增产物的检测 取扩增的PCR产物(244 bp)10 μL ，加入HhaI 1 μL，37℃进行酶切反应 3 h，取10 μL产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染法判定结果。
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1.4 统计学处理
数据用均数±标准差(
±s)表示，计数资料采用χ2检验。2 结果
2.1 冠心病组与对照组血脂水平比较
从表1 (Table 1) 可见，冠心病多支病变组和单支病变组TC、LDLC及载脂蛋白B水平均高 于对照组(P<0.0 1)，且随冠状动脉受累支数的加重，TC、LDLC及载脂蛋白B水平呈上升趋势，而HDLC呈降 低趋势。
表1. 不同冠状动脉病变组与对照组血脂水平比较
Table 1. Comparison of serum lipids levels between
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control group and diff erent vessels disease group (
±s) IndexControl group
(n=46)
SVD group
(n=40)
MVD group
(n=55)
TC (mmol/L)
4.07±0.83
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5.75±0.91a
TG (mmol/L)
1.41±0.27
1.44±0.23
1.47±0.29
HDLC (mmol/L)
1.26±0.21
1.07±0.24b
1.05±0.23b
LDLC (mmol/L)
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2.53±0.57
3.06±0.58a
4.41±0.62a
Apo B (g/L)
0.61±0.30
0.80±0.31a
0.84±0.31a
a: P<0.01, b: P<0.05, compared with contr ol group. MVD group:mitiple vessel disease group; SVD group:single vessel disease group
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2.2 冠心病组与对照组载脂蛋白E基因型比较
从表2 (Table 2)可见，141例研究对象中，载脂蛋白E基因型以E3/3频率最高，而E2/2、E2/4 及 E4/4频率则很低。冠状动脉多支病变组和单支病变组E3/4频率均高于对照组，而E3/3频率略 低于对照组。冠状动脉多支病变组E2/3频率较对照组低。各组等位基因累积频率按公式计算 ，冠状动脉多支病变组和单支病变组ε4频率均明显高于对照组，且多支病变组ε4频率高于 单支病变组。此外，多支病变组ε2频率低于对照组。
表2. 不同冠状动脉病变组与对照组载脂蛋白E基因型及等位基因频率分布比较
Table 2. Comparison of apolipoprotein E genotypes and frequenci es of
allele between defferent vessels disease group and control group (n,%) Genotypes
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Control
(n=46)
SVD
(n=40)
MVD
(n=55)
Total
(n=141)
E2/2
1(2.2)
1(2.5)
0(0)
2(1.4)
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E2/3
4(8.7)
3(7.5)
3(5.4)bd
10(7.1)
E2/4
1(2.2)
1(2.5)
2(3.6)
4(2.8)
E3/3
34(73.9)
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27(67.7)
34(61.8)
95(67.4)
E3/4
6(13.0)
7(17.3)b
14(25.6)ac
27(19.1)
E4/4
0(0)
1(2.5)
2(3.6)
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3(2.1)
Alleles
ε2
3(7.6)
3(7.5)
3(4.5)bd
9(6.4)
ε3
40(84.8)
32(80.1)
42(77.3)
114(80.5)
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ε4
3(7.6)
5(12.4)b
10(18.2)ad
18(13.1)
a: P<0.01, b:P<0.05,compared with control group；c: P<0.01, d: P<0.05,compared with SVD gr oup
2.3 冠心病组与对照组不同载脂蛋白E基因型血脂水平比较
按载脂蛋白 E六种基因型分为三组：E2/2+E2/3、E3/3、E3/4+E4/4。E2/4因中性作用而 排除在外。由表3 (Table 3)可见,在不同基因型间，TC、LDLC及载脂蛋白B水平均按E3/4+ E4/4>E3/3>E2/ 2+E2/3顺序递减，而HDLC水平按E3/4+E4/4
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表3. 冠心病组与对照组不同基因型间血脂水平比较
Table 3. comparison of different ApoE genotypes with
serum lipids level in co ntrol group and CHD group (
±s) IndexE2/2+E2/3
E3/3
E3/4+E4/4
CHD(n=7)
Control(n=5)
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CHD(n=61)
Control(n=34)
CHD(n=24)
Control(n=6)
TC(mmol/L)
5.05±0.85a
3.97±0.81
5.20±0.82b
4.18±0.80
5.95±0.86a
4.35±0.83
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TG(mmol/L)
1.87±0.80
1.36±0.28
1.55±0.84
1.16±0.31
1.23±0.81
1.15±0.29
HDLC(mmol/L)
1.26±0.31b
1.33±0.30
1.16±0.29b
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1.27±0.29
1.05±0.28b
1.15±0.31
LDLC(mmol/L)
3.42±0.38a
2.37±0.45
3.37±0.36b
2.63±0.44
4.28±0.42a
2.97±0.46
, 百拇医药 Apo B(g/L)
0.71±0.20a
0.51±0.19
0.82±0.19a
0.62±0.18
0.88±0.20a
0.69±0.21
a: P<0.01, b: P<0.05, compared with control group
3 讨论
载脂蛋白E结构基因存在多态性，三种常见等位基因ε2、ε3和ε4分别编码载脂蛋白 E的三种主要异构体E2、E3和E4。不同载脂蛋白 E异构体显示不同的受体结合活性，从而导 致个体间血脂水平的差异，这是载脂蛋白 E与As的发生发展密切相关的重要基础[7] 。本文观察到，在 不同基因型的冠心病组与对照组中，ε4 等位基因携带者均伴有血清总胆固醇、低密度脂蛋 白胆固醇及载 脂蛋白 B水平的升高，其升高趋势为：E3/4+E4/4>E3/3>E2/2+E2/3，且冠心病组ε4等位基 因升高总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及载脂蛋白B的作用较对照组更明显。与多数研究认 为ε4等位基因变异影 响血胆固醇和载脂蛋白 B水平的结果相符[2～4]。提示载脂蛋白E基因多态性是影 响个体血脂水平差异的内在遗传因素之一，推测其机制除与不同载脂蛋白E异构体的受体结 合活性及体内代谢速率明显差异有关外，尚可能与肠道对胆固醇摄取能力的差异有关[ 8]。此外，本文研究显示，冠心病组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇及载脂 蛋白 B水平均高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇低于对照组，且随冠状动脉病变累及条数的加 重，总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平 明显升高，进一步支持血脂异常是冠心病的重要危险因素，尤其是血清高胆固醇水平与As程 度呈正相关。
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由于载脂蛋白 E基因多态性与血脂之间，以及血脂异常与冠心病之间的密切联系，载脂蛋白 E基 因多态性与冠心病之间的可能内在联系成为人们关注的热点。近年来有研究表明，在经冠状 动脉 造影证实的冠心病患者及急性心肌梗死患者中，ε4等位基因频率明显升高[9，10] 。本文观察显 示，冠状动脉多支病变组和单支病变组ε4 等位基因频率均明显高于对照组。此外，多 支病变组ε4等位基因频率高于单支病变组，而ε2等位基因频率低于后者，提示 随着ε4等位基因频率的升高，冠状动脉狭窄的严重程度可能进一步加重。Wang等[11 ]研究发现， 冠心病患者ε4 等位基因携带者其冠状动脉病变程度明显加重。随着病变累及大冠状动脉及 其主要分 支血管条数的递增，其ε4等位基因频率呈增加趋势。Lehtinen等[9]报道，ε4 等 位基因与冠状动脉病变 的严重程度具有相关性。冠状动脉三支或三支以上病变者血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固 醇及ε4频率分布均明显高 于一支或二支病变者。这些结果均支持本文的观察结果。其机制可能是ε4 等位基因不仅 与血浆高胆固醇和载脂蛋白 B水平相关，而且还与动脉粥样硬化性损伤有关，但也有一些研 究持相反观点。Kusisto等[12]认为，ε4 等位基因与冠心病的严重性无关。最近 国内有人报 道载脂蛋白E基因多态性与冠状动脉受累数目无关[13]，其原因可能与冠心病危险 因素的多元性以及存在冠心病诊断标准，标本量大小和研究手段的限制等问题有关。
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载脂蛋白E基因多态性是影响个体间血脂水平的内在遗传因素之一，尤其对血浆 胆固醇和载脂蛋白 B水平的影响，并在一定程度上影响冠状动脉病变的严重性。推测ε4 等 位基因频率升高可能对冠状动脉狭窄程度有预测价值，还需在大样本的前瞻性研究中 进一步证实。
[作者简介] 李卫华，女，1968年2月出生，硕士研究生毕 业，现为住院医师。
参考文献
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(此文1999-08-25收到，2000-02-08修回), 百拇医药