sFas与sFasL在自身免疫疾病中的意义
作者：余奇文 张冬青 李宁丽 马安伦 张勇 顾越英 周光炎
单位：余奇文(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；张冬青(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；李宁丽(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；马安伦(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；张勇(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；周光炎(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)
关键词：自身免疫疾病；细胞凋亡；可溶性Fas；可溶性FasL；DNA，单链
中华风湿病学杂志000605 【摘 要】 目的 研究sFas与sFasL在系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫疾病中的意义及抗单链DNA(ssDNA)抗体与sFas和sFasL介导凋亡的相关性。方法 采用夹心ELISA方法检测31例SLE病人，32例类风湿关节炎(RA)病人，20例1型糖尿病(IDDM)病人及5例多发性硬化病(MS)病人血清中sFas与sFasL含量及抗ssDNA抗体水平。结果 在SLE、RA、IDDM及MS患者血清中的sFas含量(pg/ml)分别为2 881±1 653，988±696，1 352±413，1 540±566，明显高于正常对照(P<0.002)，SLE病人sFas含量高于RA，MS，IDDM病人。SLE、RA患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为535±431、1 238±1 184，明显高于正常对照(P<0.02)，MS、IDDM患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为251±140，211±73，低于正常对照(P>0.05)。在SLE、RA病人中，高浓度sFasL者伴有高浓度sFas。在SLE病人中，所有抗ssDNA抗体阳性者均伴有高浓度sFas，所有抗sFas阴性者，ssDNA抗体也为阴性。结论 在SLE等疾病中sFas水平明显高于正常人，可作为疾病进展与治疗效果的判断指标。抗ssDNA抗体与sFas具有关联性。sFas与sFasL在疾病中的相互作用及动态变化有待进一步研究。
, http://www.100md.com
Soluble Fas and soluble Fas ligand in autoimmune diseases
YU Qiwen ZHANG Dongqing LI Ningli
(Shanghai Institute of Immunology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,China)
【Abstract】 Objective To assess the level of soluble Fas (sFas) and soluble Fas ligand (sFasL) in the sera of patients with systemic lupus erythematosus (SLE),rheumatoid arthritis (RA),multiple sclerosis (MS)and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM).Method The level of sFas and sFasL was determined by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.Anti-ssDNA (single stranded-DNA) was detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay.Results The level of sFas in patients with SLE,RA,IDDM and MS was significantly higher than that in healthy individuals.It was interesting that among these autoimmune diseases,the level of sFas in the sera of patients with SLE was dramatically higher than that of the other diseases.The high level of sFasL accompanied by sFas was found in the sera of SLE and RA patients.In the sera of patients with SLE,the anti-ssDNA antibody always accompanied by high concentration of sFas and,by contrast,no anti-ssDNA antibody was found in all the patients in whose sera no sFas was found.In patients with IDDM,the sFasL level of the serum was significantly lower than that of the serum of healthy donors.Conclusion Serum sFas level of patients with SLE,RA,MS and IDDM is higher than that of healthy individuals.These results indicate that the sFas level can be used as a marker of disease progress and relaxing after treatment with the medicine.It is also demonstrated that there is relationship between the level of anti-ssDNA antibody and sFas.The level and significance of serum sFas and sFasL in these autoimmune disease patients are under investigation.
, 百拇医药
【Key words】 Autoimmune diseases; Apoptosis; Soluble Fas; Soluble FasL; DNA，single stranded
细胞凋亡是细胞启动自杀程序后的一种死亡形式，在维持细胞正常死亡与分裂之间的平衡中起重要作用。已证实诱导细胞凋亡的信号传递受体配体对有三组，为Fas(CD95)/FasL，TNF/TNFR1和TRAIL(Apo-2L)/DR4，DR5。人类许多疾病如肿瘤，自身免疫疾病及变性疾病均与细胞凋亡有关。研究表明：Fas细胞膜外区即可溶性Fas(sFas)在自身免疫疾病中的异常表达可改变Fas与FasL对细胞凋亡的正常调控，从而导致淋巴细胞活性改变并影响T、B淋巴细胞间的相互调控[1]。
还有文献[2]报道，活化的外周血T细胞培养上清中含有sFasL，并在某些自身免疫疾病中呈上升趋势。本文报道系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、多发性硬化病(MS)、1型糖尿病(IDDM)等病人血清中sFas与sFasL的含量变化及sFas与sFasL相互关系，研究sFas及sFasL与疾病的关系，并观察凋亡细胞产生的变性DNA引发自身抗DNA抗体及其与凋亡的关系。
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表1 SLE等病人血清中sFas与sFasL含量之关系 组别
例数
高sFas与正常sFasL组
正常sFas与高sFasL组
高sFas与高sFasL组
正常sFas与正常sFasL组
例数
%
例数
%
例数
%
, 百拇医药
例数
%
SLE
31
14
45.2
0
0
13
41.9
4
12.9
RA
32
, 百拇医药
6
18.8
4
12.5
8
25.0
14
43.8
MS
5
1
20.0
0
0
, http://www.100md.com
1
20.0
3
60.0
IDDM
20
10
50.0
1
5.0
1
5.0
8
40.0
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 血清标本：SLE病人31例，男性12例，女性19例，年龄为15～55岁；RA病人32例，男性12例，女性20例，年龄为22～61岁；MS病人5例，男1例，女4例；IDDM病人20例，男性9例，女性11例，年龄为31～57岁；以上标本分别来源于瑞金医院，仁济医院，上海光华医院及上海市第一人民医院，所有病例均符合临床诊断标准。正常血清取自本校大学生体检正常者。
1.2 试剂：sFas试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司进口分装；sFasL试剂盒，法国Diaclone产品；ssDNA试剂盒，上海第二医科大学制备。
1.3 方法：血清标本作1∶5稀释用于sFas测定，作1∶3稀释用于sFasL测定，作1∶40稀释用于ssDNA测定，采用夹心ABC-ELISA方法，具体按说明书操作。
1.4 统计学处理：结果经计算机处理，采用t检验。
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2 结 果
20名正常人血清sFas与sFasL含量分别为(782±251) pg/ml与(259±113) pg/ml。
SLE、RA、MS、IDDM患者血清sFas含量(pg/ml)分别为2 881±1 653、988±696、1 352±413、1 540±566，明显高于正常对照(P<0.002)，SLE病人sFas含量高于RA、MS、IDDM病人。SLE、RA患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为535±431、1 382±1 184，明显高于正常对照(P<0.02)，MS、IDDM患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为251±140、211±73，低于正常对照(P>0.05)。
为研究不同疾病sFas与sFasL之间的关系，我们进一步把病人分为高sFas与正常sFasL组，正常sFas与高sFasL组，高sFas与高sFasL组，正常sFas与正常sFasL组。以大于正常值2s作为高浓度分组参考值，结果见表1。
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抗ssDNA抗体浓度按说明书公式计算，结果以大于30%为阳性。SLE病人的抗ssDNA抗体与sFas、sFasL结果见表2。表2 SLE病人血清sFas sFasL及
抗ssDNA抗体检测结果(
±s) 组别
例数
sFaspg/ml
sFasLpg/ml
抗ssDNA抗体%
SLE病人
31
2 881±1 653
, http://www.100md.com
535±431
36.2±21.0
正常对照
20
782±251
259±113
12.2±2.5
P值
<0.001
<0.02
<0.001
3 讨 论
, 百拇医药 Cheng等[3]首先报道了在风湿性疾病中sFas水平增高，并提出sFas的变化与淋巴细胞活性以及增生有关。现已证实T细胞sFasL高表达，尤以活化的T细胞，而B细胞，巨噬细胞，NK细胞以表达Fas为主。活化的B细胞Fas高表达，并因此对表达FasL的T细胞杀伤作用敏感。在SLE疾病中，可能由于Fas mRNA转录突变子造成mRNA编码的Fas分子缺失穿膜区，使Fas以可溶性分泌形式(sFas)存在。高浓度的sFas造成对sFasL的封闭，使正常的免疫下调机制失效，进而造成自身反应性T细胞和B细胞增多，产生侵犯性的自身抗体及自身杀伤细胞。我们的研究发现，在SLE病人血清中含有高水平的sFas，结果与国外文献[4]报道一致。SLE病人经类固醇治疗后sFas呈下降趋势，说明sFas可作为疾病进展与治疗效果的指标。血清sFas浓度增高现象同样在以Th1型自身免疫疾病如RA，IDDM及MS中存在，说明sFas增高并非SLE独有。
膜FasL可致表达Fas的细胞凋亡，而sFasL则抑制Fas-sFasL介导的细胞凋亡[5]。本文在sFasL检测中发现，SLE等病人血清中，高浓度sFas伴有高浓度sFasL(表1)。说明sFasL协同sFas抑制膜FasL所致的细胞凋亡的产生，使自身反应细胞得以存在，从而加深自身免疫程度。但是，也有部分病人的sFasL未见升高，并且在IDDM病人血清中sFasL水平低于正常人。FasL还存在于一些免疫豁免组织如眼球、角膜、睾丸等等，诱导入侵该组织的自身反应细胞自发凋亡，使得机体免遭免疫自我攻击。正常胰岛也表达FasL，起到自我保护作用，IDDM病人血清中sFasL的降低使得机体不能有效地抑制T效应细胞对胰岛细胞的攻击，从而造成胰岛损伤而致病。膜FasL与sFasL在细胞凋亡中的细节还有待进一步探索。了解其机制并采用干预治疗可能成为治疗自身免疫疾病的一个新方法。
, 百拇医药
Frankfurt等[6]基于凋亡过程伴随细胞DNA变性，产生单链DNA(ssDNA)之原理，用抗ssDNA单抗建立了凋亡细胞标志检测的新方法。凋亡细胞所产生的变性DNA刺激机体产生抗DNA抗体可能是SLE自身免疫机制之一。我们在检测sFas与sFasL的同时检测了SLE病人血清中抗ssDNA自身抗体水平，发现在所有16例抗ssDNA抗体阳性者伴有高浓度sFas。在仅有的4例sFas阴性者中ssDNA也为阴性。说明ssDNA抗体的产生与细胞凋亡具有关联性。但是，这种关联性在RA、IDDM及MS中不明显。凋亡细胞的种类及细胞凋亡的程度与ssDNA抗体产生的关系尚待进一步研究。
基金项目：上海市教委重点学科资助项目 (S990202)
作者单位：顾越英(仁济医院风湿科)
参 考 文 献
1，郭磊.细胞凋亡在自身免疫发病机制中的作用.国外医学免疫学分册，1999，22：17-21.
, http://www.100md.com
2，Tanaka M,Ttai T,Adachi M,et al.Downregulation of Fas ligand by shedding.Nat Med,1998,4:31-36.
3，Cheng J,Zhou T,Liu C,et al.Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule.Science,1994,263:1759-1762.
4，Nozawa K,Kayagaki N,Tokano Y,et al.Soluble Fas and soluble Fas ligand in rheumatic disease.Arthritis Rheum,1997,40:1126-1129.
5，Suda T,Hashimoto,Tanaka M,et al.Membrane Fas ligand kills human peripheral blood T lymphocytes and soluble Fas ligand blocks the killing.J Exp Med,1997,186:2045-2050.
6，Frankfurt OS,Robb JA,Sugarbaker EV,et al.Monoclonal antibody to single-stranded DNA is a specific and sensitive cellular marker of apoptosis.Exp Cell Res,1996,226:387-391.
收稿日期：2000-03-17, 百拇医药
单位：余奇文(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；张冬青(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；李宁丽(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；马安伦(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；张勇(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)；周光炎(上海第二医科大学上海市免疫学研究所 200025)
关键词：自身免疫疾病；细胞凋亡；可溶性Fas；可溶性FasL；DNA，单链
中华风湿病学杂志000605 【摘 要】 目的 研究sFas与sFasL在系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫疾病中的意义及抗单链DNA(ssDNA)抗体与sFas和sFasL介导凋亡的相关性。方法 采用夹心ELISA方法检测31例SLE病人，32例类风湿关节炎(RA)病人，20例1型糖尿病(IDDM)病人及5例多发性硬化病(MS)病人血清中sFas与sFasL含量及抗ssDNA抗体水平。结果 在SLE、RA、IDDM及MS患者血清中的sFas含量(pg/ml)分别为2 881±1 653，988±696，1 352±413，1 540±566，明显高于正常对照(P<0.002)，SLE病人sFas含量高于RA，MS，IDDM病人。SLE、RA患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为535±431、1 238±1 184，明显高于正常对照(P<0.02)，MS、IDDM患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为251±140，211±73，低于正常对照(P>0.05)。在SLE、RA病人中，高浓度sFasL者伴有高浓度sFas。在SLE病人中，所有抗ssDNA抗体阳性者均伴有高浓度sFas，所有抗sFas阴性者，ssDNA抗体也为阴性。结论 在SLE等疾病中sFas水平明显高于正常人，可作为疾病进展与治疗效果的判断指标。抗ssDNA抗体与sFas具有关联性。sFas与sFasL在疾病中的相互作用及动态变化有待进一步研究。
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Soluble Fas and soluble Fas ligand in autoimmune diseases
YU Qiwen ZHANG Dongqing LI Ningli
(Shanghai Institute of Immunology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,China)
【Abstract】 Objective To assess the level of soluble Fas (sFas) and soluble Fas ligand (sFasL) in the sera of patients with systemic lupus erythematosus (SLE),rheumatoid arthritis (RA),multiple sclerosis (MS)and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM).Method The level of sFas and sFasL was determined by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.Anti-ssDNA (single stranded-DNA) was detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay.Results The level of sFas in patients with SLE,RA,IDDM and MS was significantly higher than that in healthy individuals.It was interesting that among these autoimmune diseases,the level of sFas in the sera of patients with SLE was dramatically higher than that of the other diseases.The high level of sFasL accompanied by sFas was found in the sera of SLE and RA patients.In the sera of patients with SLE,the anti-ssDNA antibody always accompanied by high concentration of sFas and,by contrast,no anti-ssDNA antibody was found in all the patients in whose sera no sFas was found.In patients with IDDM,the sFasL level of the serum was significantly lower than that of the serum of healthy donors.Conclusion Serum sFas level of patients with SLE,RA,MS and IDDM is higher than that of healthy individuals.These results indicate that the sFas level can be used as a marker of disease progress and relaxing after treatment with the medicine.It is also demonstrated that there is relationship between the level of anti-ssDNA antibody and sFas.The level and significance of serum sFas and sFasL in these autoimmune disease patients are under investigation.
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【Key words】 Autoimmune diseases; Apoptosis; Soluble Fas; Soluble FasL; DNA，single stranded
细胞凋亡是细胞启动自杀程序后的一种死亡形式，在维持细胞正常死亡与分裂之间的平衡中起重要作用。已证实诱导细胞凋亡的信号传递受体配体对有三组，为Fas(CD95)/FasL，TNF/TNFR1和TRAIL(Apo-2L)/DR4，DR5。人类许多疾病如肿瘤，自身免疫疾病及变性疾病均与细胞凋亡有关。研究表明：Fas细胞膜外区即可溶性Fas(sFas)在自身免疫疾病中的异常表达可改变Fas与FasL对细胞凋亡的正常调控，从而导致淋巴细胞活性改变并影响T、B淋巴细胞间的相互调控[1]。
还有文献[2]报道，活化的外周血T细胞培养上清中含有sFasL，并在某些自身免疫疾病中呈上升趋势。本文报道系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、多发性硬化病(MS)、1型糖尿病(IDDM)等病人血清中sFas与sFasL的含量变化及sFas与sFasL相互关系，研究sFas及sFasL与疾病的关系，并观察凋亡细胞产生的变性DNA引发自身抗DNA抗体及其与凋亡的关系。
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表1 SLE等病人血清中sFas与sFasL含量之关系 组别
例数
高sFas与正常sFasL组
正常sFas与高sFasL组
高sFas与高sFasL组
正常sFas与正常sFasL组
例数
%
例数
%
例数
%
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例数
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SLE
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41.9
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RA
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6
18.8
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1 资料与方法
1.1 血清标本：SLE病人31例，男性12例，女性19例，年龄为15～55岁；RA病人32例，男性12例，女性20例，年龄为22～61岁；MS病人5例，男1例，女4例；IDDM病人20例，男性9例，女性11例，年龄为31～57岁；以上标本分别来源于瑞金医院，仁济医院，上海光华医院及上海市第一人民医院，所有病例均符合临床诊断标准。正常血清取自本校大学生体检正常者。
1.2 试剂：sFas试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司进口分装；sFasL试剂盒，法国Diaclone产品；ssDNA试剂盒，上海第二医科大学制备。
1.3 方法：血清标本作1∶5稀释用于sFas测定，作1∶3稀释用于sFasL测定，作1∶40稀释用于ssDNA测定，采用夹心ABC-ELISA方法，具体按说明书操作。
1.4 统计学处理：结果经计算机处理，采用t检验。
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2 结 果
20名正常人血清sFas与sFasL含量分别为(782±251) pg/ml与(259±113) pg/ml。
SLE、RA、MS、IDDM患者血清sFas含量(pg/ml)分别为2 881±1 653、988±696、1 352±413、1 540±566，明显高于正常对照(P<0.002)，SLE病人sFas含量高于RA、MS、IDDM病人。SLE、RA患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为535±431、1 382±1 184，明显高于正常对照(P<0.02)，MS、IDDM患者血清sFasL含量(pg/ml)分别为251±140、211±73，低于正常对照(P>0.05)。
为研究不同疾病sFas与sFasL之间的关系，我们进一步把病人分为高sFas与正常sFasL组，正常sFas与高sFasL组，高sFas与高sFasL组，正常sFas与正常sFasL组。以大于正常值2s作为高浓度分组参考值，结果见表1。
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抗ssDNA抗体浓度按说明书公式计算，结果以大于30%为阳性。SLE病人的抗ssDNA抗体与sFas、sFasL结果见表2。表2 SLE病人血清sFas sFasL及
抗ssDNA抗体检测结果(
±s) 组别例数
sFaspg/ml
sFasLpg/ml
抗ssDNA抗体%
SLE病人
31
2 881±1 653
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535±431
36.2±21.0
正常对照
20
782±251
259±113
12.2±2.5
P值
<0.001
<0.02
<0.001
3 讨 论
, 百拇医药 Cheng等[3]首先报道了在风湿性疾病中sFas水平增高，并提出sFas的变化与淋巴细胞活性以及增生有关。现已证实T细胞sFasL高表达，尤以活化的T细胞，而B细胞，巨噬细胞，NK细胞以表达Fas为主。活化的B细胞Fas高表达，并因此对表达FasL的T细胞杀伤作用敏感。在SLE疾病中，可能由于Fas mRNA转录突变子造成mRNA编码的Fas分子缺失穿膜区，使Fas以可溶性分泌形式(sFas)存在。高浓度的sFas造成对sFasL的封闭，使正常的免疫下调机制失效，进而造成自身反应性T细胞和B细胞增多，产生侵犯性的自身抗体及自身杀伤细胞。我们的研究发现，在SLE病人血清中含有高水平的sFas，结果与国外文献[4]报道一致。SLE病人经类固醇治疗后sFas呈下降趋势，说明sFas可作为疾病进展与治疗效果的指标。血清sFas浓度增高现象同样在以Th1型自身免疫疾病如RA，IDDM及MS中存在，说明sFas增高并非SLE独有。
膜FasL可致表达Fas的细胞凋亡，而sFasL则抑制Fas-sFasL介导的细胞凋亡[5]。本文在sFasL检测中发现，SLE等病人血清中，高浓度sFas伴有高浓度sFasL(表1)。说明sFasL协同sFas抑制膜FasL所致的细胞凋亡的产生，使自身反应细胞得以存在，从而加深自身免疫程度。但是，也有部分病人的sFasL未见升高，并且在IDDM病人血清中sFasL水平低于正常人。FasL还存在于一些免疫豁免组织如眼球、角膜、睾丸等等，诱导入侵该组织的自身反应细胞自发凋亡，使得机体免遭免疫自我攻击。正常胰岛也表达FasL，起到自我保护作用，IDDM病人血清中sFasL的降低使得机体不能有效地抑制T效应细胞对胰岛细胞的攻击，从而造成胰岛损伤而致病。膜FasL与sFasL在细胞凋亡中的细节还有待进一步探索。了解其机制并采用干预治疗可能成为治疗自身免疫疾病的一个新方法。
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Frankfurt等[6]基于凋亡过程伴随细胞DNA变性，产生单链DNA(ssDNA)之原理，用抗ssDNA单抗建立了凋亡细胞标志检测的新方法。凋亡细胞所产生的变性DNA刺激机体产生抗DNA抗体可能是SLE自身免疫机制之一。我们在检测sFas与sFasL的同时检测了SLE病人血清中抗ssDNA自身抗体水平，发现在所有16例抗ssDNA抗体阳性者伴有高浓度sFas。在仅有的4例sFas阴性者中ssDNA也为阴性。说明ssDNA抗体的产生与细胞凋亡具有关联性。但是，这种关联性在RA、IDDM及MS中不明显。凋亡细胞的种类及细胞凋亡的程度与ssDNA抗体产生的关系尚待进一步研究。
基金项目：上海市教委重点学科资助项目 (S990202)
作者单位：顾越英(仁济医院风湿科)
参 考 文 献
1，郭磊.细胞凋亡在自身免疫发病机制中的作用.国外医学免疫学分册，1999，22：17-21.
, http://www.100md.com
2，Tanaka M,Ttai T,Adachi M,et al.Downregulation of Fas ligand by shedding.Nat Med,1998,4:31-36.
3，Cheng J,Zhou T,Liu C,et al.Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule.Science,1994,263:1759-1762.
4，Nozawa K,Kayagaki N,Tokano Y,et al.Soluble Fas and soluble Fas ligand in rheumatic disease.Arthritis Rheum,1997,40:1126-1129.
5，Suda T,Hashimoto,Tanaka M,et al.Membrane Fas ligand kills human peripheral blood T lymphocytes and soluble Fas ligand blocks the killing.J Exp Med,1997,186:2045-2050.
6，Frankfurt OS,Robb JA,Sugarbaker EV,et al.Monoclonal antibody to single-stranded DNA is a specific and sensitive cellular marker of apoptosis.Exp Cell Res,1996,226:387-391.
收稿日期：2000-03-17, 百拇医药