普伐他汀对HepG2细胞纤溶酶原激活物抑制物-1分泌的影响
作者：陈良华 龚兰生 陆国平 吴春芳
单位：
关键词：普伐他汀 纤溶酶原激活物抑制物1 动脉粥样硬化
中国循环杂志990316 摘要 目的：研究普伐他汀(pravastatin)是否能抑制肝细胞分泌纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)。方法：β型转化生长因子(TGF-β)作为PAI-1的刺激剂。先观察时间曲线，即分成3组：无TGF-β组、TGF-β组与普伐他汀加TGF-β组(普伐他汀终浓度20 μg/L)，培养6、12、24、48小时。另使用不同终浓度的普伐他汀分别加入HepG2细胞培养液中，培养48小时观察量效曲线。应用发色底物法、酶联免疫吸附测定技术分别测定上清液中的PAI-1活性及PAI-1抗原水平。结果：20 μg/L普伐他汀培养不同时间与单独TGF-β刺激时，PAI-1抗原分泌无明显降低，而不同浓度的普伐他汀培养48小时对PAI-1抗原分泌也无影响。PAI-1活性改变同PAI-1抗原。结论：普伐他汀不能抑制肝细胞PAI-1的分泌。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制与PAI-1分泌可能没有关系。
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Effect of Pravastatin on Secretion of Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 in HepG2 Cells
Chen Lianghua*，Gong Lansheng,Lu Guoping,et al.
Department of Cardiology,Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University,Shanghai(200025)
Abstract Objective:To examine whether pravastatin can inhibit the secretion of plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1).Methods:We used the transforming growth factor β(TGF-β)as a stimulator of PAI-1 secretion.To observe time-dependent effect,3 groups were studied including no TGF-β group,TGF-β group and pravastatin plus TGF-β group,which cultured for 6、12、24、48 h(final concentration of pravastatin 20 μg/L).In addition,different concentrations of pravastatin were added to cultured HepG2 cells for 48 h to observe dose-dependent effect.PAI-1 activity and antigen in supernatent of HepG2 cells were measured by chromogenic assay and enzyme linked immunosorbent assay,respectively.Results:Pravastatin 20 μg/L cultured for different durations did not decrease PAI-1 antigen secretion in comparison with single TGF-β stimulation.Different concentrations of pravastatin did not inhibit the secretion of PAI-1 antigen when cultured for 48 h either.The changes of PAI-1 activity were similar to those of PAI-1 antigen.Conclusion:Pravastatin can not inhibit the secretion of PAI-1 in hepatic cells and the inhibition of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase may not be related to the secretion of PAI-1.
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Key words Pravastatin;Plasminogen activator inhibitor type l;Atherosclerosis
血浆纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)水平升高被认为是胰岛素抵抗综合征(X综合征)的主要成员之一，PAI-1水平的调节与脂质代谢等存在某种发病学上的关联[1]。有研究表明，调脂药吉非贝齐[2]及烟酸[3]能抑制人肝肿瘤细胞系HepG2细胞PAI-1的分泌。普伐他汀(pravastatin)是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，作用机制不同于上述两种药物，本研究于1996年10月～1997年2月观察普伐他汀是否对肝细胞分泌PAI-1有所影响。HepG2细胞是一种高度分化的人肝脏肿瘤细胞系，就激活剂和拮抗剂对PAI-1分泌的影响来说能模拟体内肝细胞[2]。
1 材料与方法
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材料 HepG2细胞由上海市内分泌研究所提供，β型转化生长因子(TGF-β)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)由美国GIBCOBRL公司提供，普伐他汀原料由上海施贵宝制药有限公司赠送，PAI-1抗原测定试剂盒购自美国DIAGNOSTICA STAGO公司，PAI-1活性测定试剂盒购自上海实业第一医科大学生物技术有限公司。
方法 细胞培养：HepG2细胞在培养瓶中用DMEM(辅以10%小牛血清)进行培养，细胞融合成致密单层后在无血清DMEM中培养6小时，然后以磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，再在无血清DMEM中培养，进行各种条件刺激，其中TGF-β有研究表明能刺激HepG2细胞分泌PAI-1，可作为刺激剂，终浓度为5 ng/ml[1]。普伐他汀用无血清DMEM稀释，终浓度依据文献报道的体内药物代谢动力学确定[2]。先观察时间曲线，即分成3组：无β型转化生长因子组(无TGF-β组)、β型转化生长因子组(TGF-β组)、普伐他汀+β型转化生长因子组(普伐他汀加TGF-β组)(普伐他汀终浓度20 μg/L)，培养6、12、24、48小时。另使用普伐他汀终浓度1、5、10、20、30 μg/L分别加入细胞培养液中，同时加TGF-β 5 ng/ml，培养48小时观察量效曲线。各种条件刺激完成后，收集上清液并离心除去细胞碎片进行PAI-1活性及抗原测定。每个条件刺激均培养5瓶细胞。PAI-1活性及抗原测定：参照有关试剂盒说明书，PAI-1活性用发色底物法测定，PAI-1抗原则用酶联免疫吸附测定技术测定。
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统计学分析：所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用t检验。P<0.05有显著性差异。
2 结果
HepG2细胞上清液中PAI-1抗原浓度的改变：HepG2细胞无血清DMEM培养6小时后，PAI-1抗原释放7.2±1.1 ng/ml，而TGF-β(5 ng/ml)加入DMEM中PAI-1抗原含量升高至35.9±2.5 ng/ml，培养12、24、48小时，PAI-1抗原含量逐渐升高，但24小时与48小时时两者无差别，即24小时TGF-β刺激效应达到最大。而普伐他汀20 μg/L加入DMEM，其PAI-1抗原含量与单独TGF-β刺激均无显著性差异，具体情况见表1。
表1 3组HepG2细胞上清液中纤溶酶原激活物抑制物-1
, 百拇医药
抗原浓度变化的时间效应(ng/ml，±s) 组别
纤溶酶原激活物抑制物-1抗原浓度
6小时
12小时
24小时
48小时
无β型转化生长因子组
7.2±1.1
12.4±1.8
28.3±2.4
31.1±4.2
, 百拇医药
β型转化生长因子组
35.9±2.5*
42.1±3.2*
47.1±2.8*
44.6±2.7*
普伐他汀+β型转化
生长因子组
32.1±4.9*
41.3±4.0*
45.5±2.4*
, 百拇医药
46.5±2.3*
注：与无β型转化生长因子组比较*P<0.01；普伐他汀+β型转化生长因子组与β型转化生长因子组间比较无显著差异。普伐他汀浓度20 μg/L
普伐他汀分别以1、5、10、20、30 μg/L加入到DMEM中培养48小时，PAI-1抗原含量分别为46.3±2.8 ng/ml、46.7±2.6 ng/ml、42.1±3.4 ng/ml、46.5±2.3 ng/ml、44.5±4.4 ng/ml，与单独TGF-β刺激48小时(PAI-1抗原含量44.6±2.7 ng/ml)比较无显著性变化。
HepG2细胞上清液中DAI-1活性变化：普伐他汀20 μg/L培养不同时间引起的PAI-1活性改变(表2)
表2 3组HepG2细胞培养液中纤溶酶原激活物抑制物-1
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活性改变的时间效应(Au/ml,±s) 组别
纤溶酶原激活物抑制物-1活性
6小时
12小时
24小时
48小时
无β型转化生长因子组
3.2±1.0
6.2±1.3
14.2±2.3
15.4±3.1
, 百拇医药
β型转化生长因子组
15.2±3.4*
20.4±4.0*
22.5±4.1*
21.8±3.7*
普伐他汀+β型转化
生长因子组
14.9±3.6*
19.2±3.8*
21.9±4.0*
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21.6±4.1△
注：与无β型转化生长因子组比较*P<0.01；与无β型转化生长因子组比较△P<0.05；普伐他汀+β型转化生长因子组与β型转化生长因子组间比较无显著差异。普伐他汀浓度20 μg/L
从表2可见，普伐他汀20 μg/L并不改变TGF-β刺激HepG2细胞引起的PAI-1活性。PAI-1活性变化与PAI-1抗原一致，提示在此类条件下分泌的PAI-1抗原是以活性形式存在的。
另外我们应用逆转录多聚酶链式反应观察HepG2细胞PAI-1核糖核酸改变，亦表明普伐他汀并不能抑制HepG2细胞PAI-1核糖核酸表达(结果未显示)。
3 讨论
, 百拇医药
血浆PAI-1水平升高是动脉粥样硬化及冠心病的危险因素[1]。早有研究表明吉非贝齐能降低急性心肌梗塞存活者的血浆PAI-1水平而减少死亡率[4]。1992年Fujii等[2]观察到在不改变脂类成份的情况下，吉非贝齐直接加入到培养液中，可使HepG2细胞基础PAI-1分泌降低43%，TGF-β刺激24小时引起的PAI-1水平减少39%，PAI-1核糖核酸也呈现类似情形。1995年同一研究小组证实烟酸也可降低HepG2细胞TGF-β刺激后PAI-1抗原及核糖核酸的表达水平[3]。显然这种效应并不是调脂作用引起的，其机制尚不明了。
羟甲基戊二酰辅酶A还原酶是胆固醇合成过程中的限速酶，与PAI-1核糖核酸共存在肝细胞内[5]，而肝细胞可能是血浆PAI-1一个重要的来源，是否肝细胞内胆固醇代谢途径与纤溶系统存在某种细胞学上的联系，还不清楚。Reihner等[6]发现当普伐他汀体外浓度为0.5～1.0 μg/L时，体外培养的人肝微粒体中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶活性大约降低5%。本研究结果表明普伐他汀并不象吉非贝齐与烟酸那样能降低HepG2细胞TGF-β刺激后PAI-1抗原的分泌，逆转录多聚酶链式反应结果也证实PAI-1核糖核酸表达呈类似情形，即在不改变培养液脂质的情况下抑制肝细胞内胆固醇生成途径并不能改变PAI-1的合成及分泌，肝细胞内羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制与PAI-1分泌可能没有关系。
, 百拇医药
参考文献
1 Juvan-Vague I,Alessi MC.Plasminogen activator inhibitor l and atherothrombosis.Thromb Haemostas,1993,70:138—143.
2 Fujii S,Sobel BE.Direct effects of gemfibrozil on the fibrinolytic system:diminution of synthesis of plasminogen activator inhibitor type l.Circulation,1992,85:1888—1893.
3 Brown SL,Sobel BE,Fujii S.Attenuation of the synthesis of plasminogen activator inhibitor type 1 by niacin:a potential link between lipid lowering and fibrinolysis.Circulation,1995,92:767—772.
, http://www.100md.com
4 Anderson P,Smith P,Sejeflot I,et al.Effects of gemfibrozil on lipids and haemostasis after myocardial infarction.Thromb Haemostas,1990,63:174—177.
5 Rea TJ,DeMattos RB,Pape ME.Hepatic expression of genes regulating lipid metabolism in rabbits.J Lipid Res,1993,34:1901—1910.
6 Reihner E,Rudling M,Stahnberg D,et al.Influence of pravastatin,a specific inhibitor of HMG-CoA reductase,on hepatic metabolism of cholesterol.N Engl J Med,1990,323:224—228.
(收稿：1998-12-03 修回：1999-03-22), http://www.100md.com
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关键词：普伐他汀 纤溶酶原激活物抑制物1 动脉粥样硬化
中国循环杂志990316 摘要 目的：研究普伐他汀(pravastatin)是否能抑制肝细胞分泌纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)。方法：β型转化生长因子(TGF-β)作为PAI-1的刺激剂。先观察时间曲线，即分成3组：无TGF-β组、TGF-β组与普伐他汀加TGF-β组(普伐他汀终浓度20 μg/L)，培养6、12、24、48小时。另使用不同终浓度的普伐他汀分别加入HepG2细胞培养液中，培养48小时观察量效曲线。应用发色底物法、酶联免疫吸附测定技术分别测定上清液中的PAI-1活性及PAI-1抗原水平。结果：20 μg/L普伐他汀培养不同时间与单独TGF-β刺激时，PAI-1抗原分泌无明显降低，而不同浓度的普伐他汀培养48小时对PAI-1抗原分泌也无影响。PAI-1活性改变同PAI-1抗原。结论：普伐他汀不能抑制肝细胞PAI-1的分泌。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制与PAI-1分泌可能没有关系。
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Effect of Pravastatin on Secretion of Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 in HepG2 Cells
Chen Lianghua*，Gong Lansheng,Lu Guoping,et al.
Department of Cardiology,Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University,Shanghai(200025)
Abstract Objective:To examine whether pravastatin can inhibit the secretion of plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1).Methods:We used the transforming growth factor β(TGF-β)as a stimulator of PAI-1 secretion.To observe time-dependent effect,3 groups were studied including no TGF-β group,TGF-β group and pravastatin plus TGF-β group,which cultured for 6、12、24、48 h(final concentration of pravastatin 20 μg/L).In addition,different concentrations of pravastatin were added to cultured HepG2 cells for 48 h to observe dose-dependent effect.PAI-1 activity and antigen in supernatent of HepG2 cells were measured by chromogenic assay and enzyme linked immunosorbent assay,respectively.Results:Pravastatin 20 μg/L cultured for different durations did not decrease PAI-1 antigen secretion in comparison with single TGF-β stimulation.Different concentrations of pravastatin did not inhibit the secretion of PAI-1 antigen when cultured for 48 h either.The changes of PAI-1 activity were similar to those of PAI-1 antigen.Conclusion:Pravastatin can not inhibit the secretion of PAI-1 in hepatic cells and the inhibition of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase may not be related to the secretion of PAI-1.
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Key words Pravastatin;Plasminogen activator inhibitor type l;Atherosclerosis
血浆纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)水平升高被认为是胰岛素抵抗综合征(X综合征)的主要成员之一，PAI-1水平的调节与脂质代谢等存在某种发病学上的关联[1]。有研究表明，调脂药吉非贝齐[2]及烟酸[3]能抑制人肝肿瘤细胞系HepG2细胞PAI-1的分泌。普伐他汀(pravastatin)是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，作用机制不同于上述两种药物，本研究于1996年10月～1997年2月观察普伐他汀是否对肝细胞分泌PAI-1有所影响。HepG2细胞是一种高度分化的人肝脏肿瘤细胞系，就激活剂和拮抗剂对PAI-1分泌的影响来说能模拟体内肝细胞[2]。
1 材料与方法
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材料 HepG2细胞由上海市内分泌研究所提供，β型转化生长因子(TGF-β)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)由美国GIBCOBRL公司提供，普伐他汀原料由上海施贵宝制药有限公司赠送，PAI-1抗原测定试剂盒购自美国DIAGNOSTICA STAGO公司，PAI-1活性测定试剂盒购自上海实业第一医科大学生物技术有限公司。
方法 细胞培养：HepG2细胞在培养瓶中用DMEM(辅以10%小牛血清)进行培养，细胞融合成致密单层后在无血清DMEM中培养6小时，然后以磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，再在无血清DMEM中培养，进行各种条件刺激，其中TGF-β有研究表明能刺激HepG2细胞分泌PAI-1，可作为刺激剂，终浓度为5 ng/ml[1]。普伐他汀用无血清DMEM稀释，终浓度依据文献报道的体内药物代谢动力学确定[2]。先观察时间曲线，即分成3组：无β型转化生长因子组(无TGF-β组)、β型转化生长因子组(TGF-β组)、普伐他汀+β型转化生长因子组(普伐他汀加TGF-β组)(普伐他汀终浓度20 μg/L)，培养6、12、24、48小时。另使用普伐他汀终浓度1、5、10、20、30 μg/L分别加入细胞培养液中，同时加TGF-β 5 ng/ml，培养48小时观察量效曲线。各种条件刺激完成后，收集上清液并离心除去细胞碎片进行PAI-1活性及抗原测定。每个条件刺激均培养5瓶细胞。PAI-1活性及抗原测定：参照有关试剂盒说明书，PAI-1活性用发色底物法测定，PAI-1抗原则用酶联免疫吸附测定技术测定。
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统计学分析：所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用t检验。P<0.05有显著性差异。2 结果
HepG2细胞上清液中PAI-1抗原浓度的改变：HepG2细胞无血清DMEM培养6小时后，PAI-1抗原释放7.2±1.1 ng/ml，而TGF-β(5 ng/ml)加入DMEM中PAI-1抗原含量升高至35.9±2.5 ng/ml，培养12、24、48小时，PAI-1抗原含量逐渐升高，但24小时与48小时时两者无差别，即24小时TGF-β刺激效应达到最大。而普伐他汀20 μg/L加入DMEM，其PAI-1抗原含量与单独TGF-β刺激均无显著性差异，具体情况见表1。
表1 3组HepG2细胞上清液中纤溶酶原激活物抑制物-1
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抗原浓度变化的时间效应(ng/ml，
±s) 组别纤溶酶原激活物抑制物-1抗原浓度
6小时
12小时
24小时
48小时
无β型转化生长因子组
7.2±1.1
12.4±1.8
28.3±2.4
31.1±4.2
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β型转化生长因子组
35.9±2.5*
42.1±3.2*
47.1±2.8*
44.6±2.7*
普伐他汀+β型转化
生长因子组
32.1±4.9*
41.3±4.0*
45.5±2.4*
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46.5±2.3*
注：与无β型转化生长因子组比较*P<0.01；普伐他汀+β型转化生长因子组与β型转化生长因子组间比较无显著差异。普伐他汀浓度20 μg/L
普伐他汀分别以1、5、10、20、30 μg/L加入到DMEM中培养48小时，PAI-1抗原含量分别为46.3±2.8 ng/ml、46.7±2.6 ng/ml、42.1±3.4 ng/ml、46.5±2.3 ng/ml、44.5±4.4 ng/ml，与单独TGF-β刺激48小时(PAI-1抗原含量44.6±2.7 ng/ml)比较无显著性变化。
HepG2细胞上清液中DAI-1活性变化：普伐他汀20 μg/L培养不同时间引起的PAI-1活性改变(表2)
表2 3组HepG2细胞培养液中纤溶酶原激活物抑制物-1
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活性改变的时间效应(Au/ml,
±s) 组别纤溶酶原激活物抑制物-1活性
6小时
12小时
24小时
48小时
无β型转化生长因子组
3.2±1.0
6.2±1.3
14.2±2.3
15.4±3.1
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β型转化生长因子组
15.2±3.4*
20.4±4.0*
22.5±4.1*
21.8±3.7*
普伐他汀+β型转化
生长因子组
14.9±3.6*
19.2±3.8*
21.9±4.0*
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21.6±4.1△
注：与无β型转化生长因子组比较*P<0.01；与无β型转化生长因子组比较△P<0.05；普伐他汀+β型转化生长因子组与β型转化生长因子组间比较无显著差异。普伐他汀浓度20 μg/L
从表2可见，普伐他汀20 μg/L并不改变TGF-β刺激HepG2细胞引起的PAI-1活性。PAI-1活性变化与PAI-1抗原一致，提示在此类条件下分泌的PAI-1抗原是以活性形式存在的。
另外我们应用逆转录多聚酶链式反应观察HepG2细胞PAI-1核糖核酸改变，亦表明普伐他汀并不能抑制HepG2细胞PAI-1核糖核酸表达(结果未显示)。
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血浆PAI-1水平升高是动脉粥样硬化及冠心病的危险因素[1]。早有研究表明吉非贝齐能降低急性心肌梗塞存活者的血浆PAI-1水平而减少死亡率[4]。1992年Fujii等[2]观察到在不改变脂类成份的情况下，吉非贝齐直接加入到培养液中，可使HepG2细胞基础PAI-1分泌降低43%，TGF-β刺激24小时引起的PAI-1水平减少39%，PAI-1核糖核酸也呈现类似情形。1995年同一研究小组证实烟酸也可降低HepG2细胞TGF-β刺激后PAI-1抗原及核糖核酸的表达水平[3]。显然这种效应并不是调脂作用引起的，其机制尚不明了。
羟甲基戊二酰辅酶A还原酶是胆固醇合成过程中的限速酶，与PAI-1核糖核酸共存在肝细胞内[5]，而肝细胞可能是血浆PAI-1一个重要的来源，是否肝细胞内胆固醇代谢途径与纤溶系统存在某种细胞学上的联系，还不清楚。Reihner等[6]发现当普伐他汀体外浓度为0.5～1.0 μg/L时，体外培养的人肝微粒体中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶活性大约降低5%。本研究结果表明普伐他汀并不象吉非贝齐与烟酸那样能降低HepG2细胞TGF-β刺激后PAI-1抗原的分泌，逆转录多聚酶链式反应结果也证实PAI-1核糖核酸表达呈类似情形，即在不改变培养液脂质的情况下抑制肝细胞内胆固醇生成途径并不能改变PAI-1的合成及分泌，肝细胞内羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制与PAI-1分泌可能没有关系。
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参考文献
1 Juvan-Vague I,Alessi MC.Plasminogen activator inhibitor l and atherothrombosis.Thromb Haemostas,1993,70:138—143.
2 Fujii S,Sobel BE.Direct effects of gemfibrozil on the fibrinolytic system:diminution of synthesis of plasminogen activator inhibitor type l.Circulation,1992,85:1888—1893.
3 Brown SL,Sobel BE,Fujii S.Attenuation of the synthesis of plasminogen activator inhibitor type 1 by niacin:a potential link between lipid lowering and fibrinolysis.Circulation,1995,92:767—772.
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4 Anderson P,Smith P,Sejeflot I,et al.Effects of gemfibrozil on lipids and haemostasis after myocardial infarction.Thromb Haemostas,1990,63:174—177.
5 Rea TJ,DeMattos RB,Pape ME.Hepatic expression of genes regulating lipid metabolism in rabbits.J Lipid Res,1993,34:1901—1910.
6 Reihner E,Rudling M,Stahnberg D,et al.Influence of pravastatin,a specific inhibitor of HMG-CoA reductase,on hepatic metabolism of cholesterol.N Engl J Med,1990,323:224—228.
(收稿：1998-12-03 修回：1999-03-22), http://www.100md.com