牛心包材料脱细胞的初步研究
作者：周建业 胡盛寿 祁国奇 任 兵
单位：
关键词：组织工程学 心脏瓣膜 生物材料
中国循环杂志990326 摘要 目的：对牛心包材料进行了去污剂—酶联合脱细胞研究，为组织工程学方法研制生物瓣提供适合的生物材料。方法：用去污剂—酶四步脱细胞方法脱除牛心包组织的细胞。结果：该方法脱细胞效果良好，且能较好地保持胶原纤维和弹性纤维原有的排列和分布。脱细胞后牛心包材料的厚度、抗拉负荷、伸长率和热皱缩温度只有轻微的减少，而抗拉强度没有变化。结论：去污剂—酶联合脱细胞法效果良好，可用于组织工程的进一步研究。
Primary Research on Cell Extraction From Bovine Pericardium
Zhou Jianye,Hu Shengshou,Qi Guoqi,et al.
, http://www.100md.com
Division of Cardiac Valve,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract Objective:To investigate a method to remove cellular components from bovine pericardial tissue,resulting a scaffold for tissue engineering of heart valve or cardiovascular patch.Methods:A detergent and enzyme extraction was practiced in this study.HE staining was performed to confirm the removal of cells and Von Gieson staining,to show the integrity of collagen and elastin.The changes in tissue shrinkage temperature,and mechanical properties were also studied.Results:The cells were removed effectively from bovine pericardial tissue,while the collagen and elastin were kept intact.The mechanical properties remained unaltered.Only the tissue shrinkage temperature dropped insignificantly.Conclusion:The research work demonstrated an effective procedure to remove cells from bovine pericardial tissue while kept its mechanical properties.The acellular matrix needs to be further evaluated biochemically and ultrastructurally.This approach may eventually lead to the engineering of tissue heart valves repopulated with patients' own cells.
, 百拇医药
Key words Tissue engineering;Heart valve;Biomaterial
目前临床使用的人工心脏瓣膜，不论是机械瓣还是生物瓣，都有其自身无法克服的缺点，因而影响了瓣膜的耐久性和远期疗效。为了制造一种能够自我修复、自身塑形的新型人工瓣膜，国外开始用组织工程的方法，将自体细胞种植在由生物可降解材料制成的支架上，生产出“活的”瓣膜移植物。将这种瓣膜移植物植入体内，活的细胞不仅能抑制周围组织的增生，而且更重要的是能分泌细胞基质以替代降解的支架材料。这些新生的细胞基质按其所处的生物力场顺应性排列，从而最终成为真正的自体瓣膜。这种方法已经在羊体内获得成功[1，2]。
牛心包的主要成分是Ⅰ型胶原，具有抗原性小、生物相容性好、可生物降解等特点，是优良的引导再生支架材料，广泛应用于生物医学工程诸多领域[3]。我们的实验目的是探讨除去牛心包材料中的细胞成分的方法，以及牛心包脱细胞后其胶原纤维作为支架进行细胞培养的可行性。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
牛心包的采集：我们于1998年12月至1999年1月取刚宰杀的黄牛心包120片，迅速剔除脂肪，在清水中漂洗3遍后，置于冰生理盐水中。
脱细胞：根据Courtman的中性去污剂—酶四步脱细胞方法[4]加以改进。
组织学观察：分别从脱细胞前、后的牛心包上裁取一小块心包片，放入10%中性福尔马林中保存。常规石蜡包埋，切片、染色后在显微镜下进行组织学观察。常规苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态；Weigert弹力纤维+Von Gieson结缔组织(ET+VG)染色观察胶原纤维和弹性纤维的分布。
牛心包片厚度及物理性能测试：用特制模具分别从脱细胞前、后的牛心包片上随机裁取试条，在固定两点测定厚度，取平均值。将试条在SANS CMT2502型拉力机上做拉伸试验。通过测试得到抗拉负荷、抗拉强度和伸长率等指标。
, 百拇医药
热皱缩温度的测试：分别从脱细胞前、后的牛心包片上各裁取50 mm×3 mm的试条，以蒸馏水为介质，测定其皱缩温度。
统计学方法：所有数据经SPSS统计软件，采用t检验方法计算P值。以P<0.05为有显著差异，P<0.01为有非常显著差异。
2 结果
组织学观察，新鲜的牛心包组织切片中含有大量的细胞，包括间皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞及毛细血管等，胶原纤维呈波浪状整齐排列，结构较紧凑；弹性纤维结构清晰(图1、图3)。经脱细胞处理的牛心包组织切片中，细胞基本消失，胶原纤维排列较疏松，裂隙增大；而弹性纤维保存良好(图2、图4)。
图1 新鲜牛心包片,胶原纤维呈波浪状平行排列,纤维间见散在的细胞分布,毛细血管周围细胞较多[苏木素伊红(HE)染色,×300]
, 百拇医药
图2 脱细胞处理后的牛心包片,细胞大部分已消失,胶原纤维仍呈波浪状排列,但较疏松(HE染色,×300
图3 新鲜牛心包片胶原纤维 呈波浪状平行排列,弹性纤维结构清晰[Wdigert弹力纤维+Van Gieson结缔组织(ET+VG)染色,×300]
图4 脱细胞后的牛心包,胶原纤维仍呈波浪状平行排列,裂隙较大,弹性纤维保存良好(ET+VG染色,×300)
牛心包材料的厚度及物理性能测试结果见附表，经过脱细胞处理后，牛心包片的厚度及抗拉负荷、伸长率都有轻微的减少和降低(P>0.05)，这种降低无统计学意义；而抗拉强度基本没有改变。
, http://www.100md.com 附表 牛心包材料脱细胞前、后厚度及物理
性能的比较(n=10)
厚度
(mm)
抗拉负荷
(N)
抗拉强度
(mPa)
伸长率
(%)
未处理的牛心包片
0.38±0.10
, http://www.100md.com 20.76±9.28
11.25±5.50
38.6±11.2
脱细胞的牛心包片
0.33±0.01
20.03±6.11
11.30±4.27
37.5±11.1
P
0.191
0.838
0.983
, http://www.100md.com
0.828
脱细胞处理前、后的牛心包热皱缩温度分别为68.95±0.70℃和67.90±0.50℃(标本数4，P=0.055)，有轻微降低，差异也不显著。
3 讨论
牛心包材料以其优良的柔韧性、低抗原性、低钙化率，成为目前异种生物瓣最常用的生物材料。国外也有学者用去污剂法对牛心包和猪主动脉瓣进行了脱细胞的尝试[4，5]。本实验采用的去污剂—酶四步脱细胞方法，利用去污剂对细胞膜脂和脂蛋白的破坏作用及酶对细胞核的水解作用，有效地去除了牛心包组织中的细胞成分。使牛心包的热皱缩温度有所降低，胶原纤维的排列比较疏松，抗拉负荷也有所降低。但降低的幅度非常小，以致于牛心包的抗拉强度没有改变。这与国外的报道是一致的。然而在我们的实验中，牛心包的厚度没有增加，可能是由于我们使用的缓冲体系渗透压较高的缘故。
, http://www.100md.com 牛心包的强度与其胶原纤维的构架是直接相关的，并且由于胶原纤维排列走向的多样性，导致牛心包的强度存在向异性[6]。传统的牛心包瓣用戊二醛固定牛心包做瓣叶，就是利用牛心包的胶原纤维，通过增加其交联程度以达到增加组织强度的目的[7]。我们对牛心包进行脱细胞处理后，其抗拉强度基本保持不变，用它做引导再生瓣膜的支架材料，在机械性能方面是可行的。
这种脱细胞方法引起的生物化学和超微结构的改变还需要进一步的实验阐明。而更具体的脱细胞条件，以及脱细胞的牛心包引导组织再生情况也有待做进一步的探索。(本文图1～4见封三)
参考文献
1 Zund G,Breuer CK,Shinoka T,et al.The in vitro construction of a tissue engineered bioprosthetic heart valve.Eur J Cardiothorac Surg,1997,11:493—497.
, http://www.100md.com
2 Shinoka T,Breuer CK,Tanel RE,et al.Tissue engineering heart valve:valve eaflet replacement study in a lamb model.Ann Thorac Surg,1995,60:S513—S516.
3 张其清.医用组织引导再生材料的发展现状及发展方向综述.中国修复重建外科杂志，1997，11：365—368.
4 Courtman DW,Pereira C,Kashef V,et al.Development of a pericardial acellular matrix biomaterial:Biochemical and mechanical effects of cell extraction.J Biomed Materials Res,1994,28:655—666.
, 百拇医药 5 Bader A,Schilling T,Teebken OE,et al.Tissue engineering of heart valves human endothelial cell seeding of detergent acellularized porcine valves.Eur J Cardiothorac Surg,1998,14:279—284.
6 Sacks MS,Chuong CJ,Moore R.Collagen fiber architecture of bovine pericardium.ASAIO J,1994,40:M632—637.
7 Liao KX,Frater RW,Stevenson-Smith W,et al.Two-dimensional mechanical and ultrastructural correlates of bovine pericardium for prosthetic valves.ASAIO Trans,1991,37:M349—351.
(收稿:1999-01-25 修回:1999-04-05), 百拇医药
单位：
关键词：组织工程学 心脏瓣膜 生物材料
中国循环杂志990326 摘要 目的：对牛心包材料进行了去污剂—酶联合脱细胞研究，为组织工程学方法研制生物瓣提供适合的生物材料。方法：用去污剂—酶四步脱细胞方法脱除牛心包组织的细胞。结果：该方法脱细胞效果良好，且能较好地保持胶原纤维和弹性纤维原有的排列和分布。脱细胞后牛心包材料的厚度、抗拉负荷、伸长率和热皱缩温度只有轻微的减少，而抗拉强度没有变化。结论：去污剂—酶联合脱细胞法效果良好，可用于组织工程的进一步研究。
Primary Research on Cell Extraction From Bovine Pericardium
Zhou Jianye,Hu Shengshou,Qi Guoqi,et al.
, http://www.100md.com
Division of Cardiac Valve,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract Objective:To investigate a method to remove cellular components from bovine pericardial tissue,resulting a scaffold for tissue engineering of heart valve or cardiovascular patch.Methods:A detergent and enzyme extraction was practiced in this study.HE staining was performed to confirm the removal of cells and Von Gieson staining,to show the integrity of collagen and elastin.The changes in tissue shrinkage temperature,and mechanical properties were also studied.Results:The cells were removed effectively from bovine pericardial tissue,while the collagen and elastin were kept intact.The mechanical properties remained unaltered.Only the tissue shrinkage temperature dropped insignificantly.Conclusion:The research work demonstrated an effective procedure to remove cells from bovine pericardial tissue while kept its mechanical properties.The acellular matrix needs to be further evaluated biochemically and ultrastructurally.This approach may eventually lead to the engineering of tissue heart valves repopulated with patients' own cells.
, 百拇医药
Key words Tissue engineering;Heart valve;Biomaterial
目前临床使用的人工心脏瓣膜，不论是机械瓣还是生物瓣，都有其自身无法克服的缺点，因而影响了瓣膜的耐久性和远期疗效。为了制造一种能够自我修复、自身塑形的新型人工瓣膜，国外开始用组织工程的方法，将自体细胞种植在由生物可降解材料制成的支架上，生产出“活的”瓣膜移植物。将这种瓣膜移植物植入体内，活的细胞不仅能抑制周围组织的增生，而且更重要的是能分泌细胞基质以替代降解的支架材料。这些新生的细胞基质按其所处的生物力场顺应性排列，从而最终成为真正的自体瓣膜。这种方法已经在羊体内获得成功[1，2]。
牛心包的主要成分是Ⅰ型胶原，具有抗原性小、生物相容性好、可生物降解等特点，是优良的引导再生支架材料，广泛应用于生物医学工程诸多领域[3]。我们的实验目的是探讨除去牛心包材料中的细胞成分的方法，以及牛心包脱细胞后其胶原纤维作为支架进行细胞培养的可行性。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
牛心包的采集：我们于1998年12月至1999年1月取刚宰杀的黄牛心包120片，迅速剔除脂肪，在清水中漂洗3遍后，置于冰生理盐水中。
脱细胞：根据Courtman的中性去污剂—酶四步脱细胞方法[4]加以改进。
组织学观察：分别从脱细胞前、后的牛心包上裁取一小块心包片，放入10%中性福尔马林中保存。常规石蜡包埋，切片、染色后在显微镜下进行组织学观察。常规苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态；Weigert弹力纤维+Von Gieson结缔组织(ET+VG)染色观察胶原纤维和弹性纤维的分布。
牛心包片厚度及物理性能测试：用特制模具分别从脱细胞前、后的牛心包片上随机裁取试条，在固定两点测定厚度，取平均值。将试条在SANS CMT2502型拉力机上做拉伸试验。通过测试得到抗拉负荷、抗拉强度和伸长率等指标。
, 百拇医药
热皱缩温度的测试：分别从脱细胞前、后的牛心包片上各裁取50 mm×3 mm的试条，以蒸馏水为介质，测定其皱缩温度。
统计学方法：所有数据经SPSS统计软件，采用t检验方法计算P值。以P<0.05为有显著差异，P<0.01为有非常显著差异。
2 结果
组织学观察，新鲜的牛心包组织切片中含有大量的细胞，包括间皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞及毛细血管等，胶原纤维呈波浪状整齐排列，结构较紧凑；弹性纤维结构清晰(图1、图3)。经脱细胞处理的牛心包组织切片中，细胞基本消失，胶原纤维排列较疏松，裂隙增大；而弹性纤维保存良好(图2、图4)。
图1 新鲜牛心包片,胶原纤维呈波浪状平行排列,纤维间见散在的细胞分布,毛细血管周围细胞较多[苏木素伊红(HE)染色,×300]
, 百拇医药
图2 脱细胞处理后的牛心包片,细胞大部分已消失,胶原纤维仍呈波浪状排列,但较疏松(HE染色,×300
图3 新鲜牛心包片胶原纤维 呈波浪状平行排列,弹性纤维结构清晰[Wdigert弹力纤维+Van Gieson结缔组织(ET+VG)染色,×300]
图4 脱细胞后的牛心包,胶原纤维仍呈波浪状平行排列,裂隙较大,弹性纤维保存良好(ET+VG染色,×300)
牛心包材料的厚度及物理性能测试结果见附表，经过脱细胞处理后，牛心包片的厚度及抗拉负荷、伸长率都有轻微的减少和降低(P>0.05)，这种降低无统计学意义；而抗拉强度基本没有改变。
, http://www.100md.com 附表 牛心包材料脱细胞前、后厚度及物理
性能的比较(n=10)
厚度
(mm)
抗拉负荷
(N)
抗拉强度
(mPa)
伸长率
(%)
未处理的牛心包片
0.38±0.10
, http://www.100md.com 20.76±9.28
11.25±5.50
38.6±11.2
脱细胞的牛心包片
0.33±0.01
20.03±6.11
11.30±4.27
37.5±11.1
P
0.191
0.838
0.983
, http://www.100md.com
0.828
脱细胞处理前、后的牛心包热皱缩温度分别为68.95±0.70℃和67.90±0.50℃(标本数4，P=0.055)，有轻微降低，差异也不显著。
3 讨论
牛心包材料以其优良的柔韧性、低抗原性、低钙化率，成为目前异种生物瓣最常用的生物材料。国外也有学者用去污剂法对牛心包和猪主动脉瓣进行了脱细胞的尝试[4，5]。本实验采用的去污剂—酶四步脱细胞方法，利用去污剂对细胞膜脂和脂蛋白的破坏作用及酶对细胞核的水解作用，有效地去除了牛心包组织中的细胞成分。使牛心包的热皱缩温度有所降低，胶原纤维的排列比较疏松，抗拉负荷也有所降低。但降低的幅度非常小，以致于牛心包的抗拉强度没有改变。这与国外的报道是一致的。然而在我们的实验中，牛心包的厚度没有增加，可能是由于我们使用的缓冲体系渗透压较高的缘故。
, http://www.100md.com 牛心包的强度与其胶原纤维的构架是直接相关的，并且由于胶原纤维排列走向的多样性，导致牛心包的强度存在向异性[6]。传统的牛心包瓣用戊二醛固定牛心包做瓣叶，就是利用牛心包的胶原纤维，通过增加其交联程度以达到增加组织强度的目的[7]。我们对牛心包进行脱细胞处理后，其抗拉强度基本保持不变，用它做引导再生瓣膜的支架材料，在机械性能方面是可行的。
这种脱细胞方法引起的生物化学和超微结构的改变还需要进一步的实验阐明。而更具体的脱细胞条件，以及脱细胞的牛心包引导组织再生情况也有待做进一步的探索。(本文图1～4见封三)
参考文献
1 Zund G,Breuer CK,Shinoka T,et al.The in vitro construction of a tissue engineered bioprosthetic heart valve.Eur J Cardiothorac Surg,1997,11:493—497.
, http://www.100md.com
2 Shinoka T,Breuer CK,Tanel RE,et al.Tissue engineering heart valve:valve eaflet replacement study in a lamb model.Ann Thorac Surg,1995,60:S513—S516.
3 张其清.医用组织引导再生材料的发展现状及发展方向综述.中国修复重建外科杂志，1997，11：365—368.
4 Courtman DW,Pereira C,Kashef V,et al.Development of a pericardial acellular matrix biomaterial:Biochemical and mechanical effects of cell extraction.J Biomed Materials Res,1994,28:655—666.
, 百拇医药 5 Bader A,Schilling T,Teebken OE,et al.Tissue engineering of heart valves human endothelial cell seeding of detergent acellularized porcine valves.Eur J Cardiothorac Surg,1998,14:279—284.
6 Sacks MS,Chuong CJ,Moore R.Collagen fiber architecture of bovine pericardium.ASAIO J,1994,40:M632—637.
7 Liao KX,Frater RW,Stevenson-Smith W,et al.Two-dimensional mechanical and ultrastructural correlates of bovine pericardium for prosthetic valves.ASAIO Trans,1991,37:M349—351.
(收稿:1999-01-25 修回:1999-04-05), 百拇医药