实验性心肌梗塞心肌肌浆网钙释放通道变化
作者：祝宝华 张寄南 马文珠 杨国平
单位：
关键词：心肌梗塞 肌浆网 钙释放通道
中国循环杂志990311 摘要 目的：探讨急性心肌梗塞心肌肌浆网钙释放通道的变化。方法：将兔分为急性心肌梗塞组和对照组，急性心肌梗塞组结扎兔冠状动脉左前降支6小时后制成急性心肌梗塞模型，用氚标记的兰尼定(3H-ryanodine)对心肌肌浆网钙释放通道进行放射配基分析。结果：兔实验性急性心肌梗塞梗塞区心肌肌浆网钙释放通道总结合位点数(Bmax值)较对照组显著降低(93.91±9.68 fmol/mg.pro比155.74±23.50 fmol/mg.pro，P<0.01)；两组心肌肌浆网钙释放通道平衡解离常数(Kd值)无显著变化(P>0.05)。结论：急性心肌梗塞时心肌肌浆网钙释放通道密度降低，而其亲和力则无改变。
, 百拇医药
The Change of Calcium Release Channel in Cardiac Sarcoplasmic Reticulum
During Acute Myocardial Infarction
Zhu Baohua**,Zhang Jinan,Ma Wenzhu,et al.
Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing(210029),Jiangsu
Abstract Objective:To study the change of calcium release channel in cardiac sarcoplasmic reticulum in the infarcted myocardium during acute myocardial infarction.Methods:The model of acute myocardial infarction was made by liganding the rabbit left anterior descending artery.3H-ryanodine was used as radioligand to analyze calcium release channel in cardiac sarcoplasmic reticulum.Results:①The Bmax value of ryanodine receptor in acute mycardial infarction group was decreased significantly than that of control group(93.91±9.68 fmol/mg.pro vs 155.74±23.50 fmol/mg.pro,p<0.01)；②There was difference of Kd value between the two groups(p>0.05).Conclusion:The ryanodine receptor density decreased significanly in infarcted mycardium.But there is no change of the affility between the ryanodine and calcium release channel of sarcoplasmic reticulum.
, 百拇医药
Key words Myocardial infarction;Sarcoplasmic reticulum;Calcium release channel
心肌缺血时细胞内游离钙浓度升高，胞内游离钙浓度升高与心肌缺血及再灌注损伤的病理过程密切相关，且缺血时心肌细胞内钙超载是心肌细胞从可逆性损伤到不可逆性损伤的关键[1]。心肌肌浆网是胞内的钙库，通过肌浆网钙释放通道〔又称为兰尼定(ryanodine)受体〕将肌浆网内贮存的钙释放进入胞浆[2]。因此，本研究通过结扎兔冠状动脉左前降支制成急性心肌梗塞模型，以氚标记的兰尼定(3H-ryanodine)为放射配基，探讨急性心肌梗塞时肌浆网钙释放通道的变化。
1 材料和方法
材料 1996年10月取新西兰兔雌雄不拘共12只，平均体重2.5 kg(南京医科大学动物中心提供)，分为急性心肌梗塞组(n=6)和对照组(n=6)。试剂为3H-ryanodine(放射比活性3 441 GBq/mmol)，为英国Amersham公司产品，二-丙烷磺酸(MOPS)及ryanodine为美国Sigma公司产品。
, http://www.100md.com
方法 ①急性心肌梗塞模型的建立：取新西兰兔麻醉后固定，沿左侧肋骨、胸骨交界处剪断肋骨，切开心包。分离左前降支冠状动脉并结扎，随之关闭缝合6小时后产生急性心肌梗塞模型为急性心肌梗塞组。对照组只进行开胸手术而不结扎冠状动脉。用心肌肌钙蛋白I单克隆抗体通过酶联法动态测定两组兔外周血清肌钙蛋白I含量[3]。②心肌匀浆的制备：处死实验用兔并在4℃生理盐水中去除心房、大血管及右心室，去除残血，根据冠状血管支配范围及光镜观察确定梗塞心肌的范围。取梗塞区心肌组织剪碎后分别按1∶20加10%蔗糖和10 mmol/L二-丙烷磺酸〔酸碱度(pH)=7.4〕，用高速组织匀浆器(Tekmar德国)匀浆3次，每次20秒，间隙30秒。取部分匀浆用Lowry法蛋白定量[4]，其余则作3H-ryanodine结合试验用。③肌浆网钙释放通道特异性结合试验：用Darling法[1]加以改进。总结合管中分别加入不同浓度(0.25～40.00 nmol/L)的3H-ryanodine，反应体系为10 mmol/L二-丙烷磺酸(pH=7.4)，1 mol/L KCl，1 mmol/L乙二醇双醚四乙酸(EGTA)，1 mmol/L CaCl2，心肌匀浆蛋白含量为200 μg；非特异性结合管在上述总结合管反应介质的基础上加10 μmol/L的非标记ryanodine。每个浓度点均做双复管，37℃振荡90分钟，用4℃ Tris-HCl缓冲液迅速中止反应，快速通过Whatman GF/C玻纤膜并用4℃缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl)5 ml×3冲洗，滤膜烘干后置于闪烁液5 ml中，静置平衡12小时，用Beckman 1000型液闪仪测定放射性。
, http://www.100md.com
统计学方法 结果以
±s表示，用t检验比较两组均数的差异。P<0.05为有显著差异。
2 结果
2.1 急性心肌梗塞组与对照组兔血清心肌肌钙蛋白I的变化
急性心肌梗塞组结扎冠状动脉左前降支6小时兔血清心肌肌钙蛋白I较对照组开始上升(18.11±6.90 ng/ml比1.88±0.69 ng/ml,P<0.01)，持续72小时。
2.2 急性心肌梗塞组梗塞区心肌及对照组正常心肌肌浆网钙释放通道结合试验
如图1所示，两组心肌肌浆网钙释放通道饱和曲线可见：随着3H-ryanodine浓度的升高特异性结合在10 nmol/L时呈饱和趋势，非特异性结合占总结合的比率<20%。对游离放射配基浓度的对数LogF与特异性结合作图得到一直线，即Scatchard图(图2)：其斜率即为平衡解离常数(Kd值)，由直线在横座标上的载距得到受体总结合位点数(Bmax值)。兔梗塞区心肌与正常心肌肌浆网钙释放通道Bmax值及Kd值：急性心肌梗塞组梗塞区心肌肌浆网钙释放通道Bmax值较对照组显著下降(93.91±9.68 fmol/mg.pro比155.74±23.50 fmol/mg.pro，P<0.01)；Kd值无显著变化(梗塞区1.10±0.19 nmol/L，对照组0.90±0.38 nmol/L，P>0.05)。
, 百拇医药
图1 心肌肌浆网钙释放通道饱合曲线
图2 心肌肌浆网钙释放通道Scatchard图
3 讨论
心肌缺血损伤与细胞内游离钙浓度升高密切相关，心肌肌浆网是胞内最主要的钙库，位于肌浆网终末池的钙释放通道将肌浆网贮存的大量钙释放进入胞浆[2]。Hohl等[5]实验结果已间接提示心肌缺血后肌浆网钙释放能力下降。因此，探讨心肌缺血时肌浆网钙释放通道的变化对了解心肌缺血损伤的病理及防治具有重要意义。由于通过离心提纯的肌浆网可能会导致肌浆网钙释放通道活性的丧失，用缺血心肌提纯的肌浆网可能不代表全部的心肌肌浆网，本文直接用心肌匀浆测定心肌缺血时肌浆网钙释放通道的变化。因ryanodine只特异地结合于肌浆网钙释放通道，故肌浆网钙释放通道又称为ryanodine受体，这就为直接利用心肌匀浆进行肌浆网钙释放通道的放射配基分析提供了可行性。从正常兔心肌匀浆肌浆网钙释放通道饱和曲线及Scatchard线可见3H-ryanodine与肌浆网钙释放通道的结合呈可饱和、可逆性及特异性结合等特点，因而可用3H-ryanodine在心肌匀浆中对心肌肌浆网钙释放通道进行放射配基分析。
, 百拇医药
本实验通过结扎兔在体心脏冠状动脉左前降支模拟急性心肌梗塞模型，血清心肌肌钙蛋白I亚单位测定是反映心肌缺血损伤的特异指标[3]。结扎6小时后兔血清心肌肌钙蛋白I显著升高，结合梗塞区心肌组织光镜检查结果说明兔急性心肌梗塞模型模拟成功。两组兔3H-ryanodine放射配基分析可见：缺血使3H-ryanodine与心肌肌浆网钙释放通道结合量明显下降，提示缺血区肌浆网钙释放通道密度下降。Kd值无变化，提示其亲合力无改变。和本实验结果相一致：Darling等[1]用提纯的心肌肌浆网的研究结果亦提示缺血时心肌肌浆网钙释放通道的Bmax值下降。本实验采用心肌匀浆作3H-ryanodine放射配基分析，排除了肌浆网提纯过程可能造成的影响，同样发现心肌匀浆肌浆网钙释放通道在心肌缺血时密度下降。
心肌梗塞时心肌肌浆网钙释放通道的Bmax值下降与心肌梗塞使心肌肌浆网钙释放通道数目减少相关，此外，亦可能与心肌梗塞时心肌细胞内酸中毒[6]、三磷酸腺苷含量下降[7]所致的肌浆网钙释放通道的功能状态改变相关。
, 百拇医药
参考文献
1 Darling EM,Lai FA,Meissner G.Effects of regional ischemia on the ryanodine-sensitive Ca2+ release channel of canine cardiac sarcoplasmic reticulum.J Mol Cell Cardiol,1992,24:1179—1188.
2 祝宝华，张寄南，马文珠.肌浆网基因表达与心血管疾病.国外医学.心血管病分册，1997，25：3—6.
3 张寄南，杨国平，苏恩本，等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究.中华心血管病杂志，1997，25：379—382.
4 Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265—268.
, http://www.100md.com
5 Hohl CM,Garleb AA,Altschuld RA.Effects of simulated ischemia and reperfusion on the sarcoplasmic reticulum of digitonin-lysed cardiomyocyte.Circ Res,1992,70:716—723.
6 Meissner G,Henderson JS.Rapid calcium release from cardiac sarcoplasmic reticulum resicles is dependent on Ca2+ and is modulated by Mg2+,adenime nucleotide and calmodulin.J Biol Chem,1987,267:3065—3073.
7 Holmberg SR,Williams AJ.The cardiac sarcoplasmic reticulum calcium release channel:modulation of ryanodine binding and single-channel activity.Biochim Biophys Acta,1990,1022:187—193.
(收稿：1998-12-08 修回：1999-02-08), 百拇医药
单位：
关键词：心肌梗塞 肌浆网 钙释放通道
中国循环杂志990311 摘要 目的：探讨急性心肌梗塞心肌肌浆网钙释放通道的变化。方法：将兔分为急性心肌梗塞组和对照组，急性心肌梗塞组结扎兔冠状动脉左前降支6小时后制成急性心肌梗塞模型，用氚标记的兰尼定(3H-ryanodine)对心肌肌浆网钙释放通道进行放射配基分析。结果：兔实验性急性心肌梗塞梗塞区心肌肌浆网钙释放通道总结合位点数(Bmax值)较对照组显著降低(93.91±9.68 fmol/mg.pro比155.74±23.50 fmol/mg.pro，P<0.01)；两组心肌肌浆网钙释放通道平衡解离常数(Kd值)无显著变化(P>0.05)。结论：急性心肌梗塞时心肌肌浆网钙释放通道密度降低，而其亲和力则无改变。
, 百拇医药
The Change of Calcium Release Channel in Cardiac Sarcoplasmic Reticulum
During Acute Myocardial Infarction
Zhu Baohua**,Zhang Jinan,Ma Wenzhu,et al.
Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing(210029),Jiangsu
Abstract Objective:To study the change of calcium release channel in cardiac sarcoplasmic reticulum in the infarcted myocardium during acute myocardial infarction.Methods:The model of acute myocardial infarction was made by liganding the rabbit left anterior descending artery.3H-ryanodine was used as radioligand to analyze calcium release channel in cardiac sarcoplasmic reticulum.Results:①The Bmax value of ryanodine receptor in acute mycardial infarction group was decreased significantly than that of control group(93.91±9.68 fmol/mg.pro vs 155.74±23.50 fmol/mg.pro,p<0.01)；②There was difference of Kd value between the two groups(p>0.05).Conclusion:The ryanodine receptor density decreased significanly in infarcted mycardium.But there is no change of the affility between the ryanodine and calcium release channel of sarcoplasmic reticulum.
, 百拇医药
Key words Myocardial infarction;Sarcoplasmic reticulum;Calcium release channel
心肌缺血时细胞内游离钙浓度升高，胞内游离钙浓度升高与心肌缺血及再灌注损伤的病理过程密切相关，且缺血时心肌细胞内钙超载是心肌细胞从可逆性损伤到不可逆性损伤的关键[1]。心肌肌浆网是胞内的钙库，通过肌浆网钙释放通道〔又称为兰尼定(ryanodine)受体〕将肌浆网内贮存的钙释放进入胞浆[2]。因此，本研究通过结扎兔冠状动脉左前降支制成急性心肌梗塞模型，以氚标记的兰尼定(3H-ryanodine)为放射配基，探讨急性心肌梗塞时肌浆网钙释放通道的变化。
1 材料和方法
材料 1996年10月取新西兰兔雌雄不拘共12只，平均体重2.5 kg(南京医科大学动物中心提供)，分为急性心肌梗塞组(n=6)和对照组(n=6)。试剂为3H-ryanodine(放射比活性3 441 GBq/mmol)，为英国Amersham公司产品，二-丙烷磺酸(MOPS)及ryanodine为美国Sigma公司产品。
, http://www.100md.com
方法 ①急性心肌梗塞模型的建立：取新西兰兔麻醉后固定，沿左侧肋骨、胸骨交界处剪断肋骨，切开心包。分离左前降支冠状动脉并结扎，随之关闭缝合6小时后产生急性心肌梗塞模型为急性心肌梗塞组。对照组只进行开胸手术而不结扎冠状动脉。用心肌肌钙蛋白I单克隆抗体通过酶联法动态测定两组兔外周血清肌钙蛋白I含量[3]。②心肌匀浆的制备：处死实验用兔并在4℃生理盐水中去除心房、大血管及右心室，去除残血，根据冠状血管支配范围及光镜观察确定梗塞心肌的范围。取梗塞区心肌组织剪碎后分别按1∶20加10%蔗糖和10 mmol/L二-丙烷磺酸〔酸碱度(pH)=7.4〕，用高速组织匀浆器(Tekmar德国)匀浆3次，每次20秒，间隙30秒。取部分匀浆用Lowry法蛋白定量[4]，其余则作3H-ryanodine结合试验用。③肌浆网钙释放通道特异性结合试验：用Darling法[1]加以改进。总结合管中分别加入不同浓度(0.25～40.00 nmol/L)的3H-ryanodine，反应体系为10 mmol/L二-丙烷磺酸(pH=7.4)，1 mol/L KCl，1 mmol/L乙二醇双醚四乙酸(EGTA)，1 mmol/L CaCl2，心肌匀浆蛋白含量为200 μg；非特异性结合管在上述总结合管反应介质的基础上加10 μmol/L的非标记ryanodine。每个浓度点均做双复管，37℃振荡90分钟，用4℃ Tris-HCl缓冲液迅速中止反应，快速通过Whatman GF/C玻纤膜并用4℃缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl)5 ml×3冲洗，滤膜烘干后置于闪烁液5 ml中，静置平衡12小时，用Beckman 1000型液闪仪测定放射性。
, http://www.100md.com
统计学方法 结果以
±s表示，用t检验比较两组均数的差异。P<0.05为有显著差异。2 结果
2.1 急性心肌梗塞组与对照组兔血清心肌肌钙蛋白I的变化
急性心肌梗塞组结扎冠状动脉左前降支6小时兔血清心肌肌钙蛋白I较对照组开始上升(18.11±6.90 ng/ml比1.88±0.69 ng/ml,P<0.01)，持续72小时。
2.2 急性心肌梗塞组梗塞区心肌及对照组正常心肌肌浆网钙释放通道结合试验
如图1所示，两组心肌肌浆网钙释放通道饱和曲线可见：随着3H-ryanodine浓度的升高特异性结合在10 nmol/L时呈饱和趋势，非特异性结合占总结合的比率<20%。对游离放射配基浓度的对数LogF与特异性结合作图得到一直线，即Scatchard图(图2)：其斜率即为平衡解离常数(Kd值)，由直线在横座标上的载距得到受体总结合位点数(Bmax值)。兔梗塞区心肌与正常心肌肌浆网钙释放通道Bmax值及Kd值：急性心肌梗塞组梗塞区心肌肌浆网钙释放通道Bmax值较对照组显著下降(93.91±9.68 fmol/mg.pro比155.74±23.50 fmol/mg.pro，P<0.01)；Kd值无显著变化(梗塞区1.10±0.19 nmol/L，对照组0.90±0.38 nmol/L，P>0.05)。
, 百拇医药
图1 心肌肌浆网钙释放通道饱合曲线
图2 心肌肌浆网钙释放通道Scatchard图
3 讨论
心肌缺血损伤与细胞内游离钙浓度升高密切相关，心肌肌浆网是胞内最主要的钙库，位于肌浆网终末池的钙释放通道将肌浆网贮存的大量钙释放进入胞浆[2]。Hohl等[5]实验结果已间接提示心肌缺血后肌浆网钙释放能力下降。因此，探讨心肌缺血时肌浆网钙释放通道的变化对了解心肌缺血损伤的病理及防治具有重要意义。由于通过离心提纯的肌浆网可能会导致肌浆网钙释放通道活性的丧失，用缺血心肌提纯的肌浆网可能不代表全部的心肌肌浆网，本文直接用心肌匀浆测定心肌缺血时肌浆网钙释放通道的变化。因ryanodine只特异地结合于肌浆网钙释放通道，故肌浆网钙释放通道又称为ryanodine受体，这就为直接利用心肌匀浆进行肌浆网钙释放通道的放射配基分析提供了可行性。从正常兔心肌匀浆肌浆网钙释放通道饱和曲线及Scatchard线可见3H-ryanodine与肌浆网钙释放通道的结合呈可饱和、可逆性及特异性结合等特点，因而可用3H-ryanodine在心肌匀浆中对心肌肌浆网钙释放通道进行放射配基分析。
, 百拇医药
本实验通过结扎兔在体心脏冠状动脉左前降支模拟急性心肌梗塞模型，血清心肌肌钙蛋白I亚单位测定是反映心肌缺血损伤的特异指标[3]。结扎6小时后兔血清心肌肌钙蛋白I显著升高，结合梗塞区心肌组织光镜检查结果说明兔急性心肌梗塞模型模拟成功。两组兔3H-ryanodine放射配基分析可见：缺血使3H-ryanodine与心肌肌浆网钙释放通道结合量明显下降，提示缺血区肌浆网钙释放通道密度下降。Kd值无变化，提示其亲合力无改变。和本实验结果相一致：Darling等[1]用提纯的心肌肌浆网的研究结果亦提示缺血时心肌肌浆网钙释放通道的Bmax值下降。本实验采用心肌匀浆作3H-ryanodine放射配基分析，排除了肌浆网提纯过程可能造成的影响，同样发现心肌匀浆肌浆网钙释放通道在心肌缺血时密度下降。
心肌梗塞时心肌肌浆网钙释放通道的Bmax值下降与心肌梗塞使心肌肌浆网钙释放通道数目减少相关，此外，亦可能与心肌梗塞时心肌细胞内酸中毒[6]、三磷酸腺苷含量下降[7]所致的肌浆网钙释放通道的功能状态改变相关。
, 百拇医药
参考文献
1 Darling EM,Lai FA,Meissner G.Effects of regional ischemia on the ryanodine-sensitive Ca2+ release channel of canine cardiac sarcoplasmic reticulum.J Mol Cell Cardiol,1992,24:1179—1188.
2 祝宝华，张寄南，马文珠.肌浆网基因表达与心血管疾病.国外医学.心血管病分册，1997，25：3—6.
3 张寄南，杨国平，苏恩本，等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究.中华心血管病杂志，1997，25：379—382.
4 Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265—268.
, http://www.100md.com
5 Hohl CM,Garleb AA,Altschuld RA.Effects of simulated ischemia and reperfusion on the sarcoplasmic reticulum of digitonin-lysed cardiomyocyte.Circ Res,1992,70:716—723.
6 Meissner G,Henderson JS.Rapid calcium release from cardiac sarcoplasmic reticulum resicles is dependent on Ca2+ and is modulated by Mg2+,adenime nucleotide and calmodulin.J Biol Chem,1987,267:3065—3073.
7 Holmberg SR,Williams AJ.The cardiac sarcoplasmic reticulum calcium release channel:modulation of ryanodine binding and single-channel activity.Biochim Biophys Acta,1990,1022:187—193.
(收稿：1998-12-08 修回：1999-02-08), 百拇医药