急性实验性应激状态下大鼠胃粘膜NOS变化及与胃粘膜损伤的关系

http://www.100md.com 《中国临床心理学杂志》 2000年第4期

     作者：聂时南 李兆申 许国铭 湛先保 屠振兴 龚燕芳

    单位：第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433

    关键词：一氧化氮合酶；胃粘膜损伤；急性应激

    中国临床心理学杂志000408 【摘要】 目的：探讨躯体性及心理性应激状态下大鼠胃粘膜NOS变 化及与胃粘膜损伤发生的关系。方法：采用高压恒流脉冲刺激器复 制胃粘膜损伤模型，将96只雄性SD大鼠随机分为3组：对照组(C)，规则光组(R)及不规则光组(I)，分光光度法检测NOS活性和Nils Lambecht法测 定胃粘膜损伤指数，使用兔源大鼠NOSⅠ，NOSⅡ，NOSⅢ多抗，采用免疫组化方法研究NOS的分布规律。结果：正常情况下NOS活性平稳，心理性 应激后，大鼠胃粘膜NOS活性明显升高(P<0.05)；与对照组比较，R，I组胃粘膜损伤指 数均较高，且I组较R组变化显著(P<0.05)；NOSⅠ，NOSⅢ在3组中均有表达，而NOSⅡ 只在R，I组中表达，且其表达无明显差异(P>0.05)。结论：心 理性应激程度愈高，胃粘膜损伤愈严重，胃粘膜损伤程度及NOS活性变化与心理应激程度关系密切，其分布变化似乎与心理应激程度无关。

    中图分类号：R573 文献标识码：A 文章编号：1005-3611(2000)04-0 221-04

    Relationship between Change of Nitric Qxide Synthase (NOS) in Gastric Mucosa Induced

    by Acute Experimental Stress and Acute Gastric Mucosal Lesion in Rats

    NIE Shi-nan LI Zhao-shen XU Guo-ming

    (Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)

    【Abstract】 Objective: To explore the relationshi p betwe en change of nitric oxide synthase in gastric mucosa and acute gastric mucosal l esion in rats under acute induced stress. Methods: Experim ental stress was induced in rats by impulse stimulator of high voltage and stabl e currency. Ninety-six male SD rats were randomly divided into three groups: con trol, regular and irregular group. NOS activity was measured by spectrophotometr y; degree of injury of gastric mucosa was measured by method of Nils Lambecht im munohistochemistry; and polyantibodies of NOSⅠ，NOSⅡ，NOSⅢ were employed to i nvestigate locations of NOS. Results: NOS activity was sta ble under normal condition but increased significantly upon acute stress inducti on (P<0.05). As compared to the control group, damage to gastric mucosa was observed for both the regular and irregular groups, and the degree of damage wa s found to be more severe in the irregular group (P<0.05). NOSI and NOSⅢ we re found in gastric mucosa of rats under both normal and stress conditions. By c ontrast, NOSⅡ was found only under the stress conditions and there was no relia ble difference between the regular and irregular groups. Conculsion: The degree of increased NOS activity and gastric mucosa damage were p ositively correlated with levels of experimentally induced stress. The location of NOS under stress did not produce any significant impact on the levels of stress response.

    【Key words】 Nitric oxide synthase; Gastric mucosal inju ry; Acute stress

    一氧化氮合酶(NOS)广泛存在于胃粘膜中，它所合成的一氧化氮(NO)作 为一种细胞间及细胞内的信息物质，在机体的病理生理过程中有重要作用，尤其对胃肠道各种活动有重 要意义，如调节胃部的血液循环，胃液分泌及参与粘膜损伤的保护和修复。目前对于NOS与 急性胃粘膜损伤关系的研究，多限于水浸、冷刺激、盐酸、乙醇、烧伤、外伤等躯体应激方 面，对于躯体性和心理性并存应激状态的大鼠胃粘膜NOS变化少见报道。本研究旨在探讨躯 体性和心理性应激状态下胃粘膜损伤与NOS变化的关系，为临床诊断和治疗提供理论依据。

    1 材料和方法

    1.1 主要仪器、试剂及动物

    高压恒流脉冲刺激器为第二军医大学数理教研室研制；UV754型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；RM2035冰冻切片机为瑞典Leica公司产品；EU861 3-V12深低温冰箱为美国Puffer Hubbard公司产品；Universal 16R低温高速离心机为德国Hettich公司产品；TGL-16G台式高速离心机为上海安亭科学仪器厂产品；NOS活性测试盒 购自北京东亚免疫技术研究所；兔源大鼠NOSⅠ，NOSⅡ，NOSⅢ多抗购自Sjgma公司，ABC试剂盒购自华美生物工程公司；pH7.2磷酸钾缓冲液20%(W/V)为本室自己配制；雄性SD大 鼠购自上海计生所西普尔-必凯公司。

    1.2 方法

    雄性SD大鼠96只，体质量180～200g，自然光照，食用标准丸状饲料，饲养与实验隔音隔间 。高压恒流脉冲刺激器作为模型制作的核心部分，它能够同时输出三路光信号和二路电击信号，可发出规则光和非规则光两种光。所谓规则是指光信号与电击的次序和间隔是不 变的，这里是光闪2 s后进行电击。非规则是光与电击的次序与间隔是不同的，即次序不定 ，间隔随机。电击大鼠足爪。氖泡亮时强度为35 Lux，电刺激参数为波宽2 ms，频率250 Hz ，串长1 s，电流3.0 mA。实验分3期顺序进行^[1]。

    1.2.1 适应期1-7 d 此期内每天将每只鼠分别在实验盒内放置25 mi n，动物在第4天可自行钻入实验盒，主要是消除实验盒所造成的应激因素。

    1.2.2 心理性应激形成期8-14 d 动物在第8天随机分3组，每组32 只(每组又分4个亚组，每亚组为8只)：对照(C)组仅给不规则光；规则光(R)组给光后再给电 刺激，光与电间隔恒定；不规则光(Ⅰ)组给光和电刺激的间隔随机。每天给予相同实验，每 次30 min。

    1.2.3 心理性应激记忆期 第15天起各组动物均无电刺激，余同第2期。

    1.3 测定指标

    于实验前10h禁食，分别在给予相应刺激后的第9、11、13及15天取胃粘膜，计算刺激后胃粘 膜损伤指数，因损伤多为点状出血，偶有线状溃疡，故采用Nils Lambecht法(0：无损伤，0 .1：<1 mm,0.2:2-4 mm,0.3:>4 mm)。NOS活性检测用分光光度法，由于氧合血红蛋白(HbO 2)可与NO迅速而不可逆地反应，生成高铁血红蛋白(MG)，因而，通过分光光度法检测形成的 MG，可反映由NOS催化生成的NO量，从而间接测定NOS的活性。具体步骤是：① 取胃粘膜组 织加入40 mmol/L，pH7.2磷酸钾缓冲液(20%W/V)，匀浆器搅拌10000r/min离心，20 min 后取上清液。② 取含CaCl₂，MgCl₂，缬氨酸和血红蛋白的硝酸缓冲液0.8 ml，NADPH 溶液0.8 ml，组织上清液0.6 ml混合，振荡，加入精氨酸溶液0.8 ml立即振荡，UV754型 分光光度计比色，用401和421 nm两波长分别测定，间隔30 s后重测，对照用40 mmol/L，pH 7.2磷酸钾缓冲液。以每克组织每分钟产生一氧化氮1 nmol作为1个NOS活性单位，即nmol/ min/gtissue。免疫组化采用ABC法，结果判断以细胞浆呈清晰棕色为阳性，阳性细跑比例 为：+：阳性细胞数<25%，++：阳性细胞数25%～50%，+++：阳性细胞数>50%。

    2 结果

    2.1 NOS活性变化情况

    正常状态下，NOS活性平稳，应激后酶活性变化明显，与C组比较，从第8天开始，同一时间 点R组即有变化，其中第13，15天较高(P<0.05)，而Ⅰ组从第11天起，活性升高，均 有统计学意义，其中第13，15天升高明显(P<0.01)。虽然R组酶活性各时间点均高于C 组 ，但Ⅰ组酶活性在实验过程中维持在高于R组的水平上(表1)。两应激组总酶活性均显著高于 C组(P<0.01)，而两者相比较，虽I组高于R组，但无统计学意义。

    表1 在不同刺激条件下NOS活性

    (n=8,±s nmol min^-1g^-1)

    第9天

    第11天

    第13 天

    第15天

    对照组

    1.42±1.26

    1.58±0.78

    1.45±1.31

    1.38±0.83

    规则光组

    2.20±1.21

    2.40±1.67

    3.46±2.17^*

    2.46±1.87^*

    不规则光

    组

    2.67±1.45

    2.88±1.15

    3.63±1.30^**

    3.42±1.01^**

    注：* P<0.05，** P<0.01与对照组比较

    2.2 胃粘膜损伤情况

    C组未见损伤，R组损伤指数为16.2±2.68，I组为24.2±0.73，I组损伤明显重于R组(P<0.05)。NOSⅠ，NOSⅢ在C，R，I组中均有表达，NOSⅡ只在R，I组中表达且无显 著性意义(P>0.05，表2)。

    表2 在不同刺激条件下iNOS分布

    表达情况

    阳性率

    +

    ++

    +++

    规则光组(n=32)

    6

    9

    13

    8 7.5%

    不规则光组(n=32)

    8

    10

    12

    93.8%

    3 讨论

    大量的事实说明，心理社会因素是现代社会中重要的应激源，职业的竞争，工作的压力，紧张的生活、工作节奏，人际关系的复杂、拥挤、孤独等等皆可引起应激反应，因此，对 心理性应激所造成的胃粘膜损伤的研究显得尤为重要。

    研究表明：NOS在胃粘膜损伤中起重要作用。NOS主要分为两大类，即依赖钙离子、 钙调素的原生型NOS(cNOS，即NOSⅠ，NOSⅢ)和不依赖钙离子、钙调素的诱生型NOS(iNOS， 即NOSⅡ)。cNOS主要分布于神经元和内皮细跑，具有稳定的活性，持续释放少量NO作为神经递质和起局部血流调节作用，而iNOS正常情况下在细跑内不表达，而在病理状态下如感染时，内毒素(LPS)，TNF和IL-1等都可刺激巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和血管平滑肌细胞等表达iNOS。iNOS可持续大量释放NO。iNOS活性的变化可直接影响NO的生成量和生物效应^[2，3]。NO具有双重作用，可增加胃粘膜血流、刺激胃粘液分泌、细胞保护及杀 灭微生物等，但NO，又可与氧自由基形成过氧亚硝酸盐导致细胞脂质过氧化损伤^[3] 。机体对NO不同性质的调节作用主要是通过机体对不同NOS的精细调控，使NO在不同细胞 内外的不同介质中达到不同的累积程度来实现的。cNOS是通过机体对Ca²⁺水平的控制 使其维持在低水平的持续表达状态，而iNOS则是通过诱导后合成，一旦合成即大量产生NO， 直到底物耗尽，从而导致NO在体内泛滥成灾，产生广泛的损害。iNOS的mRNA半衰期特别长， 一旦诱导合成即可持续长时间翻译、合成iNOS。与cNOS比较，iNOS是引起体内NO过量产生的 主要基础，大量NO可以造成组织和细胞的损害甚至死亡，所以iNOS的诱导合成就成为众多疾 病的发病关键。Keiji Nishida 等^[4]报道在水浸应激大鼠胃粘膜cNOS和iNOS活性的变化与胃粘膜损伤发生有密切的关系，在水浸应激期间发现大鼠胃粘膜损伤发展时，胃粘膜iNOS活性显著增加，相反，cNOS活性在水浸应激损伤的胃粘膜发现是轻度减低的。在消化系统，由cNOS产生的NO有细跑保护作用，而由iNOS产生的过量的NO起细胞毒作用^[5]。由cNOS和iNOS产生的内源性NO在应激胃粘 膜损伤中起重要作用，胃粘膜损伤发生的加强是由于胃粘膜cNOS的过度抑制及胃粘膜iNOS活性维持在正常水平之上。

    在本实验的Ⅱ期，R组与I组所接受的躯体性刺激量相同，但只要刺激参数适宜，两者的血浆皮质酮表现出显著差异，这两者的区别反映了动物内部的神经活动过程不同。光刺激是 视觉信号，电刺激如同水浸，烧伤等均为躯体性刺激，而这些都使大鼠体内内毒素，IL-1 ，IL-6及TNF明显增高并持续很长时间，在其不断刺激下iNOS活性始终处于高水平，而iNOS的增高产生高 浓度NO而致细胞毒作用，从而最终使胃粘膜损伤。从心理学角度看，两者的区别在于R组大鼠 可根据光信号预见电刺激的时间，因为其间隔是恒定的；I组则不能，因此I组动物在实验时较R组更加紧张，I组心理应激程度高于R组。当然也可以认为R组大鼠已建立心理性适应，因光与电刺激间隔恒定，如同建立条件反射，I组则不能。而在心理高度紧张状态下，NOS活 性较高，则其主要构成成份iNOS必然较高，使胃粘膜损伤严重；而另一方面，胃粘膜损伤状态下，各种使iNOS活性增高的细胞如炎症细胞增多，则必然iNOS活性处于较高水平，从而使NOS维持在一个很高的水平。对于应激组间酶活性无明显变化，可能与刺激饱和或酶诱导饱 和状态有关。

    另有研究指出，烧伤及内毒素休克后iNOS表达异常增多^[6，7]，但未指出其表达程 度与烧伤或休克程度之间的关系。在本实验中，虽然I组NOS活性及损伤程度均高于R组，但其分布未见明显差别，这与iNOS催化NO合成后活性迅速下降，其不是因为蛋白的丧失，而似乎是酶催化活性的丧失有关。

    总之，心理性应激程度愈高，胃粘膜损伤愈严重，胃粘膜损伤程度及NOS活性变化与心理应激程度关系密切，但从其分布的变化看似乎不能反应应激程度。

    【基金项目】 97全军医药卫生杰出中青年人才基金资助项目(1996卫科训字95号)

    参 考 文 献

    1，严，进，王春安，叶阿莉，等.躯体性和心理性应激对大鼠血浆皮质酮变化的影 响.心理学报，1991，23(4)：417-425

    2，Herry Y，Lepoivre M，Drapier JC，et al.EPR characterization of mloecular tar gets for NO in mammalian cells and organelles.FASEBJ，1993，7(12)：1124-1134

    3，Knowles RG，Moncada S.Nitric oxide synthase in mammals.Biocham J，1994，2 98(2)：249-258

    4，Nishida K，ohta Y，Ishiguro I.Role of gastric mucosa constitutive and i nducible nitric oxide synthases in the development of stress-induced gastric muc osal lesion in rats.Biochemical and biophysical reasearch communications，1997 ，236(2)，275-279

    5，Konturek SK，Konturek PC.Role of nitric oxide in the digestive system.Diges tion，1995，56(1)：1-13

    6，Cook TH，Bune AJ,Jansen AS，et al.Celluclar localization of inducible nitric oxide synthase in experimental endotoxic shock in rat.Clini Sci,1994,87：179- 184

    7，Sato K，Miyakawak，Takeya M，et al.Immunohistochemical expresion of inducib le nitric oxide synthase in reversible endotoxic shock studied by a novel monocl onal antibody against rat iNOS.J Leukoc Bio,1995,57(1)：36-42

    (收稿日期：2000-03-07)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/29/70/969.htm