人参皂甙Rb1、Rg1增强原代培养鼠胚脊髓运动神经元活力的实验研究
作者：潘树义 余 磊 刘大庸 蒋立新 秦建强
单位：510515 广州市 第一军医大学临床解剖学研究所
关键词：人参皂甙Rb1；Rg1；脊髓；运动神经元；细胞活力
中国临床解剖学杂志CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY1999年 第17卷 第4期 Vol 【摘 要】 目的：探讨人参皂甙Rb1、Rg1对脊髓运动神经元活力的影响。方法：以鼠胚脊髓运动神经元原代培养的实验模型，实验组分别加入100μmol*L-1浓度的Rb1和Rg1，用MTT法观察其对细胞活力的影响。结果：人参皂甙Rb1、Rg1均可增强培养鼠胚脊运动神经元活力。对脊髓运动神经元有保护作用。结论：人参皂甙Rb1、Rg1对周围神经损伤的修复起促进作用。
, http://www.100md.com
The experimental study on the effects of Panax saponin Rb1 and Rg1 on the motorneuron in vitro
Pan Shuyi,Yu Lei,Liu Dayong,et al.
Institute of Clinical Anatomy,The First Military Medical University,Guangzhou,510515
Objective:To investigate the effect of Panax saponin Rg1 and Rb1 on the cell vitality of rat embryos spinal motomeuron in vitro.Methods:100μ mol.L-1 of Panax saponin Rg1 and Rb1 was added to the culture medium of spinal motorneuron from SD rat embryos.The effects of Rb1 and Rg1 on the cell vitality were measured by the method MTT.Results:The result showed that the Rg1 and Rb1 can increase the cell vitality and protect the cell of motomeuron from injury.Conclusions:Panax saponin Rg1 and Rb1 should be able to promote the regeneration of injured peripheral nerve.
, 百拇医药
Key words Panax saponin Motorneuron Cell vitality
周围神经损伤的修复是神经外科领域的重要课题。目前临床手术的成功率和精确性已达到相当高程度，但周围神经损伤后的修复始终不理想。其主要原因是轴突断伤以后，可引起神经元胞体死亡，远端轴突发生Wallen′s变性，近端轴突不能再生。据报道切断4周小鼠坐骨神经可使10%相应脊髓灰质运动神经元死亡。由于神经元数量的绝对减少，其相应功能将永久消失。人参皂甙Rb1、Rg1是人参的主要成份，其对中枢神经系统的作用已多有报道[1]。本研究拟通过体外脊髓运动神经元培养技术，以MTT法从细胞水平观察Rb1、Rg1对脊髓运动神经元的作用，旨在为临床治疗周围神经损伤寻找有效药物。
1 材料和方法
1.1 实验材料
, 百拇医药
1.1.1 药物 人参皂甙Rb1、Rg1(由长春白求恩医科大学提供)
1.1.2 试剂 DMEM/F12(Sigma公司产品)
D-Hank′s(Sigma公司产品)
胰酶(Sigma公司产品)
MTT(Sigma公司产品)
胎牛血清(杭州四季清公司产品)
二甲基亚砜(广州医药公司产品)(DMSO)
1.1.3 动物 清洁级SD雌性鼠，孕期21d，由第一军医大学实验动物中心提供
, 百拇医药 1.1.4 仪器 ∑960酶标仪
1.2 方法
1.2.1 脊髓运动神经元的原代培养 鼠胚脊髓运动神经元的原代培养，取受孕15d的雌性大鼠，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌操作取入胎鼠，置于无菌的培养皿中。解剖显微镜下分离取脊髓，切除其背侧1/3，留脊髓腹侧2/3，D-Hank′s液冲洗3遍，将其剪成糜状。用预先配制的0.125%胰酶，37℃消化30 min，其间每隔5 min用吸管轻轻吹打10次。以含10%胎牛血清的培养基1∶1量中止消化，经200目金属网过滤，将滤液离心(1000r/ min)10 min，去上清，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，以2×106*mL-1密度接种于预先涂有鼠尾胶的96孔培养板中(每孔0.3 mL)。将细胞置于37℃，5%CO2孵箱中培养[2]。
, 百拇医药
1.2.2 实验条件的控制 培养24h后，实验组分别加入人参皂甙Rb1、Rg1(0.1 mmol.L-1)，对照组加入无血清培养基。72h后，加入含阿糖胞苷培养基(10μmol.L-1)培养24h，以抑制非神经细胞继续增殖，一般每3d换液一次。接种第10d可进行MTT检测[3]。
1.2.3 MTT分析法原理 MTT即溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑氮，可与活的细胞内琥珀酸脱氢酶相结合，而不与死亡细胞发生反应。目前MTT法是一种快速、简洁反映细胞活力的酶分析方法[4]。
1.2.4 MTT分析法操作 对将要进行MTT法检测的细胞，用吸管小心吸去培养液，每孔加入MTT溶液(浓度5g*L-1)50μL，37℃、5%湿化CO2反应4h后，加入溶剂二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，室温下微孔板放在震荡器上震荡10 min，成色产物溶解后用960酶标仪检测OD值[5](λ=570nm)。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Rb1、Rg1对原代培养脊髓运动神经元生长的影响
形态学观察发现，接种的细胞最初呈圆形，2h几乎全部贴壁；4h大部分细胞开始聚集成一个个细胞团；少部分细胞已有突起长出，相差显微镜下，细胞呈强折光的胞体；24h距离较近细胞突起已交织成网，48h神经细胞突起网络全部建立。培养第3d，加入阿糖胞苷后，非神经细胞的生长受到抑制，但神经细胞不受影响。实验组与对照组比较，加入Rb1、Rg1后，神经细胞胞体的折光性强，神经突起网络密集(图1，2)。
图1 培养第3d时实验组神经细胞生长情况
图2 培养第3d时对照组神经细胞生长情况
, 百拇医药
2.2 实验组与对照组OD值比较
实验组与对照组成色产物充分溶解以后，经∑960酶标仪(λ=570nm)测定，得到如下结果(附表)。
附表 实验组与对照组OD值比较 Group
OD值(
±s)
Sig
Rb1
0.125±0.021*
0.002
Rg1
, 百拇医药
0.132±0.017#
0.002
control
0.076±0.037
0.607
P*<0.05(Rb1 vs control) P#<0.05(Rg1 vs control) P*#>0.05(Rb1 vs Rg1) 数据经方差分析，Rb1和Rg1明显提高OD值(P*<0.05, P#<0.05)而Rb1和Rg1之间则没有明显区别(P*#>0.05)，表明Rb1和Rg1有明显的增强脊髓运动细胞活性作用。
, http://www.100md.com
3 讨论
人参皂甙Rb1和Rg1是人参的主要成份。人参的药理作用十分广泛，仅其对神经系统作用，国内外每年都有大量报道。但这些研究偏重于中枢神经系统[6]；研究的范围从人参的促智抗衰老、保护大脑皮层运动神经元作用到人参的抗中枢神经细胞的凋亡机制的探讨等，成显果著。人参对脊髓前角运动神经元、脊神经节感觉神经元是否有类似其对中枢运动神经的保护和营养作用，作用机制又如何都需进一步探讨。Rb1是人参二醇组皂甙，Rg1是人参三醇组皂甙，从目前现有的报道看，此二种人参皂甙单体对中枢神经系统作用最为明显，已作为人参最有效的成份进行实验研究。神经细胞培养是神经科学研究的重要方法之一。本实验通过体外培养鼠胚脊髓腹侧运动神经元模型，观察了Rb1和Rg1的作用，发现Rb1和Rg1可能增强脊髓运动细胞活力，说明人参对神经系统的作用并不限于中枢神经系统，其对周围神经系统也有类似神经营养因子样作用。由于脊髓运动神经元是锥体系统的“最后公路”，周围神经的损伤，导致相应节段脊髓运动神经元的绝对减少；本研究提示，人参皂甙对周围神经损伤有治疗作用，为周围神经损伤后的修复提供了一条途径。另外，人参皂甙单体约有20余种，除Rb1和Rg1之外的其他人参皂甙单体对周围神经系统是否有作用，以及其作用机制都将是我们的研究目标。
, 百拇医药
参考文献
1 刘 闵，张均田.人参皂甙Rb1和Rg1对原代培养与神经细胞的保护作用.药学学报，1995，30(9)：674
2 薛庆善，冯武鸣.神经组织的体外培养方法.解剖科学进展，1996，2(4)：349
3 李君庆，张香阁，张均田.人参皂甙Rg1抗神经细胞凋亡作用机制的研究.药学学报，1997，32(6)：406
4 温汉平，王小宁，孙华蕴，等.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法.中华肿瘤杂志，1993，15(6)：470
5 梁 谋，吴 波，赵明伦.MTT法检测抗癌药物敏感性的探讨.中国药理学通报，1993，9(3)：206
6 Rajendlra K,Sharma and Jay Kalra.Ginsenosides and Potent and Selective inhibitors of some Calmodulin-Dependent phosphodiesterase isozymes.Biochemistry,1993,32:4975
(收稿：1998-12-22), http://www.100md.com
单位：510515 广州市 第一军医大学临床解剖学研究所
关键词：人参皂甙Rb1；Rg1；脊髓；运动神经元；细胞活力
中国临床解剖学杂志CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY1999年 第17卷 第4期 Vol 【摘 要】 目的：探讨人参皂甙Rb1、Rg1对脊髓运动神经元活力的影响。方法：以鼠胚脊髓运动神经元原代培养的实验模型，实验组分别加入100μmol*L-1浓度的Rb1和Rg1，用MTT法观察其对细胞活力的影响。结果：人参皂甙Rb1、Rg1均可增强培养鼠胚脊运动神经元活力。对脊髓运动神经元有保护作用。结论：人参皂甙Rb1、Rg1对周围神经损伤的修复起促进作用。
, http://www.100md.com
The experimental study on the effects of Panax saponin Rb1 and Rg1 on the motorneuron in vitro
Pan Shuyi,Yu Lei,Liu Dayong,et al.
Institute of Clinical Anatomy,The First Military Medical University,Guangzhou,510515
Objective:To investigate the effect of Panax saponin Rg1 and Rb1 on the cell vitality of rat embryos spinal motomeuron in vitro.Methods:100μ mol.L-1 of Panax saponin Rg1 and Rb1 was added to the culture medium of spinal motorneuron from SD rat embryos.The effects of Rb1 and Rg1 on the cell vitality were measured by the method MTT.Results:The result showed that the Rg1 and Rb1 can increase the cell vitality and protect the cell of motomeuron from injury.Conclusions:Panax saponin Rg1 and Rb1 should be able to promote the regeneration of injured peripheral nerve.
, 百拇医药
Key words Panax saponin Motorneuron Cell vitality
周围神经损伤的修复是神经外科领域的重要课题。目前临床手术的成功率和精确性已达到相当高程度，但周围神经损伤后的修复始终不理想。其主要原因是轴突断伤以后，可引起神经元胞体死亡，远端轴突发生Wallen′s变性，近端轴突不能再生。据报道切断4周小鼠坐骨神经可使10%相应脊髓灰质运动神经元死亡。由于神经元数量的绝对减少，其相应功能将永久消失。人参皂甙Rb1、Rg1是人参的主要成份，其对中枢神经系统的作用已多有报道[1]。本研究拟通过体外脊髓运动神经元培养技术，以MTT法从细胞水平观察Rb1、Rg1对脊髓运动神经元的作用，旨在为临床治疗周围神经损伤寻找有效药物。
1 材料和方法
1.1 实验材料
, 百拇医药
1.1.1 药物 人参皂甙Rb1、Rg1(由长春白求恩医科大学提供)
1.1.2 试剂 DMEM/F12(Sigma公司产品)
D-Hank′s(Sigma公司产品)
胰酶(Sigma公司产品)
MTT(Sigma公司产品)
胎牛血清(杭州四季清公司产品)
二甲基亚砜(广州医药公司产品)(DMSO)
1.1.3 动物 清洁级SD雌性鼠，孕期21d，由第一军医大学实验动物中心提供
, 百拇医药 1.1.4 仪器 ∑960酶标仪
1.2 方法
1.2.1 脊髓运动神经元的原代培养 鼠胚脊髓运动神经元的原代培养，取受孕15d的雌性大鼠，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌操作取入胎鼠，置于无菌的培养皿中。解剖显微镜下分离取脊髓，切除其背侧1/3，留脊髓腹侧2/3，D-Hank′s液冲洗3遍，将其剪成糜状。用预先配制的0.125%胰酶，37℃消化30 min，其间每隔5 min用吸管轻轻吹打10次。以含10%胎牛血清的培养基1∶1量中止消化，经200目金属网过滤，将滤液离心(1000r/ min)10 min，去上清，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，以2×106*mL-1密度接种于预先涂有鼠尾胶的96孔培养板中(每孔0.3 mL)。将细胞置于37℃，5%CO2孵箱中培养[2]。
, 百拇医药
1.2.2 实验条件的控制 培养24h后，实验组分别加入人参皂甙Rb1、Rg1(0.1 mmol.L-1)，对照组加入无血清培养基。72h后，加入含阿糖胞苷培养基(10μmol.L-1)培养24h，以抑制非神经细胞继续增殖，一般每3d换液一次。接种第10d可进行MTT检测[3]。
1.2.3 MTT分析法原理 MTT即溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑氮，可与活的细胞内琥珀酸脱氢酶相结合，而不与死亡细胞发生反应。目前MTT法是一种快速、简洁反映细胞活力的酶分析方法[4]。
1.2.4 MTT分析法操作 对将要进行MTT法检测的细胞，用吸管小心吸去培养液，每孔加入MTT溶液(浓度5g*L-1)50μL，37℃、5%湿化CO2反应4h后，加入溶剂二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，室温下微孔板放在震荡器上震荡10 min，成色产物溶解后用960酶标仪检测OD值[5](λ=570nm)。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Rb1、Rg1对原代培养脊髓运动神经元生长的影响
形态学观察发现，接种的细胞最初呈圆形，2h几乎全部贴壁；4h大部分细胞开始聚集成一个个细胞团；少部分细胞已有突起长出，相差显微镜下，细胞呈强折光的胞体；24h距离较近细胞突起已交织成网，48h神经细胞突起网络全部建立。培养第3d，加入阿糖胞苷后，非神经细胞的生长受到抑制，但神经细胞不受影响。实验组与对照组比较，加入Rb1、Rg1后，神经细胞胞体的折光性强，神经突起网络密集(图1，2)。
图1 培养第3d时实验组神经细胞生长情况
图2 培养第3d时对照组神经细胞生长情况
, 百拇医药
2.2 实验组与对照组OD值比较
实验组与对照组成色产物充分溶解以后，经∑960酶标仪(λ=570nm)测定，得到如下结果(附表)。
附表 实验组与对照组OD值比较 Group
OD值(
±s)Sig
Rb1
0.125±0.021*
0.002
Rg1
, 百拇医药
0.132±0.017#
0.002
control
0.076±0.037
0.607
P*<0.05(Rb1 vs control) P#<0.05(Rg1 vs control) P*#>0.05(Rb1 vs Rg1) 数据经方差分析，Rb1和Rg1明显提高OD值(P*<0.05, P#<0.05)而Rb1和Rg1之间则没有明显区别(P*#>0.05)，表明Rb1和Rg1有明显的增强脊髓运动细胞活性作用。
, http://www.100md.com
3 讨论
人参皂甙Rb1和Rg1是人参的主要成份。人参的药理作用十分广泛，仅其对神经系统作用，国内外每年都有大量报道。但这些研究偏重于中枢神经系统[6]；研究的范围从人参的促智抗衰老、保护大脑皮层运动神经元作用到人参的抗中枢神经细胞的凋亡机制的探讨等，成显果著。人参对脊髓前角运动神经元、脊神经节感觉神经元是否有类似其对中枢运动神经的保护和营养作用，作用机制又如何都需进一步探讨。Rb1是人参二醇组皂甙，Rg1是人参三醇组皂甙，从目前现有的报道看，此二种人参皂甙单体对中枢神经系统作用最为明显，已作为人参最有效的成份进行实验研究。神经细胞培养是神经科学研究的重要方法之一。本实验通过体外培养鼠胚脊髓腹侧运动神经元模型，观察了Rb1和Rg1的作用，发现Rb1和Rg1可能增强脊髓运动细胞活力，说明人参对神经系统的作用并不限于中枢神经系统，其对周围神经系统也有类似神经营养因子样作用。由于脊髓运动神经元是锥体系统的“最后公路”，周围神经的损伤，导致相应节段脊髓运动神经元的绝对减少；本研究提示，人参皂甙对周围神经损伤有治疗作用，为周围神经损伤后的修复提供了一条途径。另外，人参皂甙单体约有20余种，除Rb1和Rg1之外的其他人参皂甙单体对周围神经系统是否有作用，以及其作用机制都将是我们的研究目标。
, 百拇医药
参考文献
1 刘 闵，张均田.人参皂甙Rb1和Rg1对原代培养与神经细胞的保护作用.药学学报，1995，30(9)：674
2 薛庆善，冯武鸣.神经组织的体外培养方法.解剖科学进展，1996，2(4)：349
3 李君庆，张香阁，张均田.人参皂甙Rg1抗神经细胞凋亡作用机制的研究.药学学报，1997，32(6)：406
4 温汉平，王小宁，孙华蕴，等.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法.中华肿瘤杂志，1993，15(6)：470
5 梁 谋，吴 波，赵明伦.MTT法检测抗癌药物敏感性的探讨.中国药理学通报，1993，9(3)：206
6 Rajendlra K,Sharma and Jay Kalra.Ginsenosides and Potent and Selective inhibitors of some Calmodulin-Dependent phosphodiesterase isozymes.Biochemistry,1993,32:4975
(收稿：1998-12-22), http://www.100md.com