周围神经变性过程的免疫组织化学观察
作者：张殿英 姜保国 李贺平 冯传汉
单位：100044 北京市 北京医科大学附属人民医院骨肿瘤科
关键词：周围神经；轴索；雪旺细胞；变性；免疫组织化学
中国临床解剖学杂志CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY1999年 第17卷 第4期 Vol 【摘 要】 目的：用免疫组织化学方法观察周围神经损伤后的结构改变及时相。方法：切断SD大鼠的双侧坐骨神经，用免疫组织化学ABC法，SMI-31轴索染色及S-100雪旺细胞染色观察6h到4周神经远端的结构变化。结果：与以往组织学观察所见不同的是，神经损伤平面近端10 mm范围内，1周内存在酶组织化学损伤性反应，6h起出现轴索的形态学改变。神经损伤平面远端全长1～3周形成密集排列的细胞条索，但S-100染色阴性。结论：采用免疫组织化学的方法能够更早的观察到神经变性的发生，神经损伤近端观察到更广泛的变化，S-100蛋白可能是标示雪旺氏细胞活化或正常雪旺氏细胞的重要观察指标。
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Immunohistochemical study on peripheral nerve degeneration
Zhang Dianying,Jiang Baoguo,Li Heping,et al.
Department of Orthopedics,People′s Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100044
Objective:To observe the structural change and phase of injured peripheral nerve by immunohistochemical stain.Methods:The structural change in proximal and distal stump of sciatic nerve of SD rats from 6 hours to 4 weeks post-transected were studied by immunohistochemical method.Antibody to SMI-31 and S-100 was used to stain the axon and Schwann′s cells respectively.Results:Different from previous report,an enzymical reaction within 10 mm of the proximal end of the transected nerve was found in one week after injury,and the morphological change of axons could be found 6 hours after injury.High density of cell bunch was formed after 1 to 3 weeks of injury in the distal stump,while S-100 stain was negative in Schwann′s cell.Conclusion:Phase of nerve degeneration and change in the proximal end of transected nerve could be found earlier by immunohistochemical study after injury.S-100 may be an important marker for normal or activated Schwann′s cell.
, 百拇医药
Key words Peripheral nerve Axon Schwann′s cell Degeneration I mmunohistaochemical
周围神经损伤后的变性，包括损伤平面近侧端的逆行性变性和远侧端的华勒氏变性，这方面已见诸多报道[1，3]。关于神经切断后变性的起始时间，认识尚不完全一致[1，3]。本文采用雪旺细胞和轴索的免疫组织化学染色，观察神经切断后相应组织结构的改变及其时相。
1 材料和方法：
采用45只雄性SD大鼠，体重300～350g，用0.25%硫贲妥钠(1ml/100g)腹腔给药麻醉，显露双侧坐骨神经，在坐骨结节下1 cm水平切断，并将两断端翻开，分离固定。术后6、12、24、48h、1、2、3、4周，在断端远近侧各切取10 mm长神经，将切取的标本固定于标明方向的纸板上，入10%甲醛固定24h，石蜡包埋，切片厚度为5μm，分别进行HE染色，Luxal fast blue髓鞘染色及免疫组织化学ABC法的S-100雪旺氏细胞染色(1∶400，DAKO公司)，神经轴索SMI-31染色(1∶1000倍，SMI公司)[2]。免疫组织化学染色过程中，一抗在4℃下孵育10h，二抗分别为HRP标记的抗兔和抗鼠IgG(DAKO公司)。显色时间，均为8 min，每组染色过程中都设定一抗阴性对照和正常对照组染色。
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2 实验结果
2.1 SMI-31和S-100在正常周围神经的染色所见
SMI-31染色表现为：轴索染成褐色，着色均匀，横断面呈圆形或椭圆形。纵行切片，轴索边缘平整光滑、粗细均匀、走行连续，并间断形成有规律的迂曲(图1)。S-100染色可见：髓鞘内外轴膜染成褐色，外轴膜浓染，外轴膜外有许多不均质浓染斑点。内外轴膜之间的髓鞘质无明显着色。雪旺细胞核在龙胆紫复染时着蓝色。在纵行切片S-100染色中，可见两个郎飞氏节之间的一个雪旺氏细胞染成均匀的褐色，包绕着不着色的轴索，其中有一个染成浅兰色的细胞核(图2)。
2.2 切断神经纤维近侧段变化的免疫组织化学观察
在神经切断6h，断面附近横切片SMI-31轴索染色较正常神经明显变浅，染色不均匀，轴索呈多形性，中心区浅染，周边明显浓染(图3)，此时S-100染色雪旺细胞着色接近正常。在切断12h，SMI-31染色，纵行切片近断端10 mm节段上轴索染色明显变浅，着色不均匀，失去正常光滑、均一的条带状染色，表现为虫食状走行(图4)，横断切片表现与6h相同，S-100染色，在损伤断面附近2 mm范围(即2-3个郎飞氏节水平)的雪旺细胞明显浓染。在切断24h，断端附近2 mm范围轴索已崩解成碎片和小的片段，横断切片有1/4的轴索已变为浓染的碎片或中空的戒指环状结构。在48h上述变化近1/2断面，此时雪旺细胞核增至正常的2倍，胞浆和内外轴膜染色趋于浅染。在一周时，近段的虫食状改变趋于恢复，近于正常轴索的SMI-31染色状态，同时，近断端处变性纤维之间出现着色均匀、细小、光滑的新生轴索，纵行切片有许多水平方向生长的细的轴索，此时新生轴索存在部位雪旺氏细胞的染色又趋于正常。2～4周时，新生轴索间充填着大量浅兰色细胞核，中间部位的轴索在细胞核间迂曲盘绕，边缘的轴索仍按水平方向生长。
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2.3 神经切断后远侧段变化的免疫组织化学观察
在神经切断6h，整段轴索染色变浅，着色不均，明显萎缩变细，横断面轴索呈多形性改变，中心染色浅，边缘浓，已散在的存在轴索消失的改变(图5)，此时雪旺细胞S-100染色不均，模糊，着色面积无变化。在12～24h，胞核增大为正常的1倍，胞浆深染，内外轴膜染色也加深，胞浆区域扩大为正常的1倍，此时轴索已变为浓染的碎片和小的片段，横断面已有1/3不存在轴索染色而表现为中空的环状结构，纵行切片部分轴索已消失，表现为长段无着色区的空泡。在切断48h组，已无连续的轴索染色相，纵行切片出现轴索走行路径上浓染的碎片和片段，横断切片大部分为中空的环状结构，此时胞浆S-100染色趋于消失，内外轴膜染色也呈明显变浅，浅兰色细胞核增长至正常的2倍。一周时，已无轴索染色相，雪旺细胞浆和胞膜染色相也消失，呈现出密集排列的浅兰色细胞核围成的条带(图6)。2～3周时，细胞核条带间隙明显变窄，4周时，间隙宽度变为一周时的1/3，中间充满着浅兰色的物质，此阶段见不到任何褐染的轴索和雪旺氏细胞染色相。
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图1 正常神经轴索的SMI-31染色表现，包括横断和纵行切片染色(×400)
图2 正常神经雪旺细胞S-100染色表现(×400)
图3 神经切断6小时近端2 mm范围轴索的SMI-31染色表现(×400)
图4 神经切断12小时近端10 mm范围轴索SMI-31染色表现(×400)
图5 神经切断6小时远端轴索的SMI-31染色表现(×400)
图6 神经切断1周时轴索SMI-31染色表现(×400) 3 讨论
早在1852年，Waller就描述了神经断裂后远段的变性过程，此后众多学者通过组织学光镜、电镜观察研究周围神经变性时的结构变化。本文用免疫组织化学方法，重点观察神经轴索和雪旺细胞在神经切断后的变化情况。
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周围神经切断后，近侧端的变化被称为逆行性变性。一般认为，轴索开始变化的时间是12～48h，变性涉及的长度为1～3个郎飞氏节[1，3]。本文SMI-31染色的结果表明，在切断6h已经可以见到近侧段端2 mm范围内的轴索碎片。一方面从酶组织化学方面进一步证实了近端变化的范围，同时，观察到轴索变性开始时间提前到损伤后6h。另外，在神经切断后的1周内，近端约10 mm范围内观察到轴索SMI-31染色变浅，这是一个新的提示，我们暂时用神经切断后轴浆外漏来解决这一现象。与轴索的反应相对应的雪旺细胞在近侧断端2 mm范围内呈现出12～24h浓染，48h着色变浅，但细胞核数量增倍，一周后恢复至正常染色的过程，可以认为是一个从变性到再生开始的过程。
在采用S-100蛋白染色过程中，我们发现：在神经变性过程中，雪旺氏细胞增生早期，S-100蛋白表达的染色相是增强的，但在远端随着轴索的完全变性消失，雪旺氏细胞中S-100蛋白染色逐渐减弱最终表达消失。而在近端，除上述改变外，新生轴索出现时，雪旺氏细胞S-100染色又重新出现，我们认为：S-100蛋白可能是标示雪旺氏细胞活化或正常雪旺氏细胞的重要观察指标。Antonio的实验结果也曾观察到这一点[4]。Ramobotti观察到S-100蛋白的表达与神经微丝和Ca2+的参与有重要的关系[5]。
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神经切断后远侧段的变性研究甚多，雪旺细胞在神经损伤的远端经历2～4周，数量倍增形成Bungner氏带，也已被很多学者公认。本文在龙胆紫复染切片上也见到了这种现象。但这些增殖的雪旺细胞在S-100染色中不着色。另一组实验则显示，神经切断后立即缝合，2周后远端的雪旺细胞呈S-100染色阳性[6]。说明雪旺细胞在神经修复中有一个从准备期到功能期的过程。这一过程中新生轴索与雪旺细胞活化的先后关系及内在联系有待进一步研究。
参考文献
1 张培林主编.神经解剖学.人民卫生出版社，1987，165-181
2 Rohnstone M.Localisation of microtubulc-associated protein 1B phosphorylation sites recognised by monoclaonal antibody SMI-31.J-Neurochem,1997,Oct;69(4):1417
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3 朱盛修主编.现代显微外科学.长沙.湖南科技出版社，1994.161-170
4 Antonio Spreca.Immunocytochemical localization of S-100 protein in degenerating and regenerating rat sciatic nerves.The Journal of Histochemistry,1989,37(4):441
5 Rambotti-MG.Detection of S-100b protein in Triton cytoskeletons:an immunocytochemical study on cultured Schwann cells.J-Histochem-Cytochem,1990,Nov;38(11):1583
6 姜保国，吉田泰二.周围神经小间隙动脉套接的免疫组织化学观察.中华显微外科杂志，1998，21(1)：39
(收稿：1998-09-14), 百拇医药
单位：100044 北京市 北京医科大学附属人民医院骨肿瘤科
关键词：周围神经；轴索；雪旺细胞；变性；免疫组织化学
中国临床解剖学杂志CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY1999年 第17卷 第4期 Vol 【摘 要】 目的：用免疫组织化学方法观察周围神经损伤后的结构改变及时相。方法：切断SD大鼠的双侧坐骨神经，用免疫组织化学ABC法，SMI-31轴索染色及S-100雪旺细胞染色观察6h到4周神经远端的结构变化。结果：与以往组织学观察所见不同的是，神经损伤平面近端10 mm范围内，1周内存在酶组织化学损伤性反应，6h起出现轴索的形态学改变。神经损伤平面远端全长1～3周形成密集排列的细胞条索，但S-100染色阴性。结论：采用免疫组织化学的方法能够更早的观察到神经变性的发生，神经损伤近端观察到更广泛的变化，S-100蛋白可能是标示雪旺氏细胞活化或正常雪旺氏细胞的重要观察指标。
, http://www.100md.com
Immunohistochemical study on peripheral nerve degeneration
Zhang Dianying,Jiang Baoguo,Li Heping,et al.
Department of Orthopedics,People′s Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100044
Objective:To observe the structural change and phase of injured peripheral nerve by immunohistochemical stain.Methods:The structural change in proximal and distal stump of sciatic nerve of SD rats from 6 hours to 4 weeks post-transected were studied by immunohistochemical method.Antibody to SMI-31 and S-100 was used to stain the axon and Schwann′s cells respectively.Results:Different from previous report,an enzymical reaction within 10 mm of the proximal end of the transected nerve was found in one week after injury,and the morphological change of axons could be found 6 hours after injury.High density of cell bunch was formed after 1 to 3 weeks of injury in the distal stump,while S-100 stain was negative in Schwann′s cell.Conclusion:Phase of nerve degeneration and change in the proximal end of transected nerve could be found earlier by immunohistochemical study after injury.S-100 may be an important marker for normal or activated Schwann′s cell.
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Key words Peripheral nerve Axon Schwann′s cell Degeneration I mmunohistaochemical
周围神经损伤后的变性，包括损伤平面近侧端的逆行性变性和远侧端的华勒氏变性，这方面已见诸多报道[1，3]。关于神经切断后变性的起始时间，认识尚不完全一致[1，3]。本文采用雪旺细胞和轴索的免疫组织化学染色，观察神经切断后相应组织结构的改变及其时相。
1 材料和方法：
采用45只雄性SD大鼠，体重300～350g，用0.25%硫贲妥钠(1ml/100g)腹腔给药麻醉，显露双侧坐骨神经，在坐骨结节下1 cm水平切断，并将两断端翻开，分离固定。术后6、12、24、48h、1、2、3、4周，在断端远近侧各切取10 mm长神经，将切取的标本固定于标明方向的纸板上，入10%甲醛固定24h，石蜡包埋，切片厚度为5μm，分别进行HE染色，Luxal fast blue髓鞘染色及免疫组织化学ABC法的S-100雪旺氏细胞染色(1∶400，DAKO公司)，神经轴索SMI-31染色(1∶1000倍，SMI公司)[2]。免疫组织化学染色过程中，一抗在4℃下孵育10h，二抗分别为HRP标记的抗兔和抗鼠IgG(DAKO公司)。显色时间，均为8 min，每组染色过程中都设定一抗阴性对照和正常对照组染色。
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2 实验结果
2.1 SMI-31和S-100在正常周围神经的染色所见
SMI-31染色表现为：轴索染成褐色，着色均匀，横断面呈圆形或椭圆形。纵行切片，轴索边缘平整光滑、粗细均匀、走行连续，并间断形成有规律的迂曲(图1)。S-100染色可见：髓鞘内外轴膜染成褐色，外轴膜浓染，外轴膜外有许多不均质浓染斑点。内外轴膜之间的髓鞘质无明显着色。雪旺细胞核在龙胆紫复染时着蓝色。在纵行切片S-100染色中，可见两个郎飞氏节之间的一个雪旺氏细胞染成均匀的褐色，包绕着不着色的轴索，其中有一个染成浅兰色的细胞核(图2)。
2.2 切断神经纤维近侧段变化的免疫组织化学观察
在神经切断6h，断面附近横切片SMI-31轴索染色较正常神经明显变浅，染色不均匀，轴索呈多形性，中心区浅染，周边明显浓染(图3)，此时S-100染色雪旺细胞着色接近正常。在切断12h，SMI-31染色，纵行切片近断端10 mm节段上轴索染色明显变浅，着色不均匀，失去正常光滑、均一的条带状染色，表现为虫食状走行(图4)，横断切片表现与6h相同，S-100染色，在损伤断面附近2 mm范围(即2-3个郎飞氏节水平)的雪旺细胞明显浓染。在切断24h，断端附近2 mm范围轴索已崩解成碎片和小的片段，横断切片有1/4的轴索已变为浓染的碎片或中空的戒指环状结构。在48h上述变化近1/2断面，此时雪旺细胞核增至正常的2倍，胞浆和内外轴膜染色趋于浅染。在一周时，近段的虫食状改变趋于恢复，近于正常轴索的SMI-31染色状态，同时，近断端处变性纤维之间出现着色均匀、细小、光滑的新生轴索，纵行切片有许多水平方向生长的细的轴索，此时新生轴索存在部位雪旺氏细胞的染色又趋于正常。2～4周时，新生轴索间充填着大量浅兰色细胞核，中间部位的轴索在细胞核间迂曲盘绕，边缘的轴索仍按水平方向生长。
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2.3 神经切断后远侧段变化的免疫组织化学观察
在神经切断6h，整段轴索染色变浅，着色不均，明显萎缩变细，横断面轴索呈多形性改变，中心染色浅，边缘浓，已散在的存在轴索消失的改变(图5)，此时雪旺细胞S-100染色不均，模糊，着色面积无变化。在12～24h，胞核增大为正常的1倍，胞浆深染，内外轴膜染色也加深，胞浆区域扩大为正常的1倍，此时轴索已变为浓染的碎片和小的片段，横断面已有1/3不存在轴索染色而表现为中空的环状结构，纵行切片部分轴索已消失，表现为长段无着色区的空泡。在切断48h组，已无连续的轴索染色相，纵行切片出现轴索走行路径上浓染的碎片和片段，横断切片大部分为中空的环状结构，此时胞浆S-100染色趋于消失，内外轴膜染色也呈明显变浅，浅兰色细胞核增长至正常的2倍。一周时，已无轴索染色相，雪旺细胞浆和胞膜染色相也消失，呈现出密集排列的浅兰色细胞核围成的条带(图6)。2～3周时，细胞核条带间隙明显变窄，4周时，间隙宽度变为一周时的1/3，中间充满着浅兰色的物质，此阶段见不到任何褐染的轴索和雪旺氏细胞染色相。
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图1 正常神经轴索的SMI-31染色表现，包括横断和纵行切片染色(×400)
图2 正常神经雪旺细胞S-100染色表现(×400)
图3 神经切断6小时近端2 mm范围轴索的SMI-31染色表现(×400)
图4 神经切断12小时近端10 mm范围轴索SMI-31染色表现(×400)
图5 神经切断6小时远端轴索的SMI-31染色表现(×400)
图6 神经切断1周时轴索SMI-31染色表现(×400) 3 讨论
早在1852年，Waller就描述了神经断裂后远段的变性过程，此后众多学者通过组织学光镜、电镜观察研究周围神经变性时的结构变化。本文用免疫组织化学方法，重点观察神经轴索和雪旺细胞在神经切断后的变化情况。
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周围神经切断后，近侧端的变化被称为逆行性变性。一般认为，轴索开始变化的时间是12～48h，变性涉及的长度为1～3个郎飞氏节[1，3]。本文SMI-31染色的结果表明，在切断6h已经可以见到近侧段端2 mm范围内的轴索碎片。一方面从酶组织化学方面进一步证实了近端变化的范围，同时，观察到轴索变性开始时间提前到损伤后6h。另外，在神经切断后的1周内，近端约10 mm范围内观察到轴索SMI-31染色变浅，这是一个新的提示，我们暂时用神经切断后轴浆外漏来解决这一现象。与轴索的反应相对应的雪旺细胞在近侧断端2 mm范围内呈现出12～24h浓染，48h着色变浅，但细胞核数量增倍，一周后恢复至正常染色的过程，可以认为是一个从变性到再生开始的过程。
在采用S-100蛋白染色过程中，我们发现：在神经变性过程中，雪旺氏细胞增生早期，S-100蛋白表达的染色相是增强的，但在远端随着轴索的完全变性消失，雪旺氏细胞中S-100蛋白染色逐渐减弱最终表达消失。而在近端，除上述改变外，新生轴索出现时，雪旺氏细胞S-100染色又重新出现，我们认为：S-100蛋白可能是标示雪旺氏细胞活化或正常雪旺氏细胞的重要观察指标。Antonio的实验结果也曾观察到这一点[4]。Ramobotti观察到S-100蛋白的表达与神经微丝和Ca2+的参与有重要的关系[5]。
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神经切断后远侧段的变性研究甚多，雪旺细胞在神经损伤的远端经历2～4周，数量倍增形成Bungner氏带，也已被很多学者公认。本文在龙胆紫复染切片上也见到了这种现象。但这些增殖的雪旺细胞在S-100染色中不着色。另一组实验则显示，神经切断后立即缝合，2周后远端的雪旺细胞呈S-100染色阳性[6]。说明雪旺细胞在神经修复中有一个从准备期到功能期的过程。这一过程中新生轴索与雪旺细胞活化的先后关系及内在联系有待进一步研究。
参考文献
1 张培林主编.神经解剖学.人民卫生出版社，1987，165-181
2 Rohnstone M.Localisation of microtubulc-associated protein 1B phosphorylation sites recognised by monoclaonal antibody SMI-31.J-Neurochem,1997,Oct;69(4):1417
, http://www.100md.com
3 朱盛修主编.现代显微外科学.长沙.湖南科技出版社，1994.161-170
4 Antonio Spreca.Immunocytochemical localization of S-100 protein in degenerating and regenerating rat sciatic nerves.The Journal of Histochemistry,1989,37(4):441
5 Rambotti-MG.Detection of S-100b protein in Triton cytoskeletons:an immunocytochemical study on cultured Schwann cells.J-Histochem-Cytochem,1990,Nov;38(11):1583
6 姜保国，吉田泰二.周围神经小间隙动脉套接的免疫组织化学观察.中华显微外科杂志，1998，21(1)：39
(收稿：1998-09-14), 百拇医药