肌组织工程的基础研究——卫星细胞培养及鉴定
作者：邬 江 钟世镇 徐达传 李主一
单位：邬江、钟世镇、徐达传 510515 广州市 第一军医大学临床解剖学研究所；李主一 成都军区昆明总医院骨科中心
关键词：卫星细胞；分化；细胞培养；免疫细胞化学
中国临床解剖学杂志CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY1999年 第17卷 第4期 Vol 【摘 要】 目的：为肌组织工程的研究作技术上的准备，建立大鼠肌卫星细胞的培养方法。方法：采用成年Wistar大鼠，利用二步消化法成功地分离出卫星细胞，在体外培养，观察其生长、分化的过程，并用电镜及免疫组化法进行鉴定。结果：二步消化法分离的细胞成活率较高，生长良好，卫星细胞在体外增殖后，最终会经过由单核细胞变为多核细胞的过程，即产生了质的改变。结论：本研究成功地建立了卫星细胞培养体系，a-sarcometric actin 免疫细胞化学鉴定方法对卫星细胞具有特异性。
, 百拇医药
The culture and identification of muscular satellite cells
Wu Jiang,Zhong Shizhen,Xu Dachuan,et al.
Institute of Clinical Anatomy,The First Military Medical University,Guangzhou,510515
Objective:To establish a culture method of muscular satellite cells in vitro and technical preparation for the muscular tissue engineering.Methods:The satellite cell from adult rat′s muscle tissue was isolated by enzyme digestion in vitro,The cell was observed morphologically and identified by immunocytochemistry.Results:The cell isolated by two steps enzyme digestion was satellite cell identified by antibody to α-sarcometric actin,which was a specific antibody for SCs,and the Myotubes presented finally.The satellite cell would always differentiate from mononuclear phase to multinuclear phase in vitro.Conclusion:This study established the cultrue technical for SCs successfully.
, 百拇医药
Key words Satellite cell Differentiation Invitro
动力性瘫痪的修复一直是医学界较为棘手的课题，尽管游离肌肉移植以其动力修复的显著疗效，为外科医生所青睐，然而它对供区的损害及术后受区欠佳的外形和肌力分布又限制其广泛应用。近年来随着细胞生物学的迅猛发展和组织工程的兴起，骨骼肌再生这一古老的话题，重新又回到整复外科的研究日程上，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。在该研究领域中，肌卫星细胞(satellite cells)因其在应激状态下特有的成肌能力而得到重视[1]，故肌卫星细胞的体外培养又是研究肌再生的技术关键；大鼠肌卫星细胞的培养国内还未见报道，本研究成功建立了大鼠肌卫星细胞的培养体系并结合该种细胞独特的分化表现作了鉴定。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM/F12培养基，D′Hanks液，胶原酶，胰蛋白酶(sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；a-sarcometric actin单抗，SABC试剂盒(武汉博士德公司)。
, 百拇医药
1.2 实验动物 成年Wistar大鼠100g～250g(雌雄不限，第一军医大学动物所提供)。
1.3 细胞培养方法 大鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)成功后，无菌条件下取出前肢三头肌，称重，随即用D′Hanks液冲洗3遍，采用酶消化法培养(在Johnson报道的方法[2]基础上作了进一步改进)。
1.3.1 细胞的分离 解剖镜下尽可能剔除脂肪、血管等结缔组织，冲洗1次后，将肌组织块剪碎(以不大于1 mm3为宜)，然后移入离心管中，用D′Hanks液反复吹打3次，每次静置1 min后，均将上层液及其中的漂浮组织除去；加入0.1%胶原酶37℃消化30 min后，500g离心1 min，去上清；再用0.25%胰蛋白酶37℃消化1h之后(其间吹打数次)，加入含10%胎牛血清的培养基中止，反复吹打，500g离心1 min后上清液依次滤过100目、200目、400目不锈钢筛网，重复中止吹打过程4次，滤液收集后250g离心10 min，去上清，细胞团块用10%胎牛血清培养基重悬。
, http://www.100md.com
1.3.2 细胞的纯化、培养 为减少成纤维细胞的污染，将含细胞的培养液行差速贴壁法纯化，纯化后细胞行台盼兰染色计数，以不低于105/mL细胞密度种植于已涂0.01%多聚赖氨酸的培养瓶中，入二氧化碳孵箱中培养，以含10%胎牛血清DMEM/F12培养，每日换液1次。
1.4 形态学观察 每天换液后，在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化，分化融合、肌管形成时间及形态特征。
1.5 电镜和免疫细胞化学鉴定 将进入分化期的细胞，常规处理后行透射电镜和a-sarcometric acin免疫细胞化学检查，采用SABC法，以成纤维细胞和平滑肌细胞作阴性对照。
2 结果
2.1 细胞的形态特征
本研究方法分离的细胞，经台盼兰染色，显示成活率均在95%以上；培养24h后，见大量折光率强的圆形细胞贴壁，且有极个别细胞有小突起(图1)；48h，可见大量的梭形、纺锤形的单核细胞出现，其间混杂少量扁平、多突起、胞浆丰富的成纤维细胞和少量圆形细胞；随培养时间的延长，梭形细胞的数量逐渐增加，其胞浆出现2～3个突起，相互拉网；继续培养，单核细胞相互融合成为多核的肌管(图2)，肌管逐渐粗大、分叉增多(图3)。
, 百拇医药
2.2 电镜和免疫细胞化学特点
电镜检查显示细胞胞浆内有片状、束状的细丝；免疫细胞化学证实这些细丝呈a-sarcometric actin反应阳性(图4)，而成纤维细胞和平滑肌细胞均未见有阳性细丝。
图1 卫星细胞培养1d时的形态(×150) 图2 卫星细胞培养5d时的形态(×150)
图3 卫星细胞培养8d时的形态(×150) 图4 培养细胞的肌动蛋白免疫组化染色(×150)
3 讨论
3.1 细胞分离方法
卫星细胞因其位于基膜和肌细胞膜之间，紧贴肌细胞表面而得名[3]。Bischoff研究证实胶原酶并不能将这类细胞从基膜上消化下来，只有胰蛋白酶和链霉激酶有此能力[4]；本研究中的二步消化法，首先采用胶原酶消化的目的，是充分分散肌纤维以强化下一步胰蛋白酶的作用，实验结果表明分离出来的细胞产量、质量均较满意。
, 百拇医药
3.2 细胞形态、分化特点
虽然卫星细胞的形态与成纤维细胞极为相似，但在镜下仍能显示出有较大的差别。首先成纤维细胞的形态是扁平、多突起的，且其胞浆极其丰富，而卫星细胞则是以梭形、纺锤形为主，相互之间以细丝拉网；其次卫星细胞的分化与其它细胞有本质上的区别，它是单核细胞相互融合、最后形成多核细胞(肌管)的过程，产生了质的改变；分化后肌管的形态、生长发育特点与增殖期比较又有较大的不同；由此可知，如何控好分化的时机亦为肌组织工程研究的关键。
3.3 细胞鉴定特征
已有研究表明中间丝结蛋白是肌细胞的中间丝成分[5]，故传统的方法均采用desmin(结蛋白)抗体进行鉴定；但肌组织块中的血管平滑肌细胞也是成纤维样细胞，而且亦含有结蛋白，以往的研究往往忽略了排除平滑肌细胞的污染，本研究首次成功地采用横纹肌肌动蛋白(a-sarcometric actin)抗体对卫星细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞进行了鉴别。
, 百拇医药
结论：本研究采用二步消化法能培养出大量的卫星细胞，为肌组织工程研究作了材料上的准备和技术的研究，同时采用了特异性较强的鉴定方法。不足之处是：分离出的细胞悬液中含有较多的肌纤维碎片，。对细胞计数产生了一定的干扰，有待进一步改进。
参考文献
1 邬 江，钟世镇，李主一.卫星细胞在骨骼肌再生中的作用.国外医学：创伤与外科基本问题分册，1999，20(1)：3
2 Johnson SE,Allen RE.Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is expressed in activated rat skeletal muscle satellite cells.J Cell Physiol,1993,154:39
3 Yablonka RZ,Quinn LS,Nameroff M.Isolation and colonel analysis of satellite cells from chicken pectoralis muscle.Dev Bio,1987,119:252
, 百拇医药
4 Bischoff R.Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle.Anat Rec,1974,180:645
5 Fishman DA.Monoclonal antibodies to desmin:Evidence for stage dependent intermediate filament immunoreactivity during cardiac and skeletal muscle developent.Ann NY Acad Sci,1985,455:167
(收稿：1998-11-20), http://www.100md.com
单位：邬江、钟世镇、徐达传 510515 广州市 第一军医大学临床解剖学研究所；李主一 成都军区昆明总医院骨科中心
关键词：卫星细胞；分化；细胞培养；免疫细胞化学
中国临床解剖学杂志CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY1999年 第17卷 第4期 Vol 【摘 要】 目的：为肌组织工程的研究作技术上的准备，建立大鼠肌卫星细胞的培养方法。方法：采用成年Wistar大鼠，利用二步消化法成功地分离出卫星细胞，在体外培养，观察其生长、分化的过程，并用电镜及免疫组化法进行鉴定。结果：二步消化法分离的细胞成活率较高，生长良好，卫星细胞在体外增殖后，最终会经过由单核细胞变为多核细胞的过程，即产生了质的改变。结论：本研究成功地建立了卫星细胞培养体系，a-sarcometric actin 免疫细胞化学鉴定方法对卫星细胞具有特异性。
, 百拇医药
The culture and identification of muscular satellite cells
Wu Jiang,Zhong Shizhen,Xu Dachuan,et al.
Institute of Clinical Anatomy,The First Military Medical University,Guangzhou,510515
Objective:To establish a culture method of muscular satellite cells in vitro and technical preparation for the muscular tissue engineering.Methods:The satellite cell from adult rat′s muscle tissue was isolated by enzyme digestion in vitro,The cell was observed morphologically and identified by immunocytochemistry.Results:The cell isolated by two steps enzyme digestion was satellite cell identified by antibody to α-sarcometric actin,which was a specific antibody for SCs,and the Myotubes presented finally.The satellite cell would always differentiate from mononuclear phase to multinuclear phase in vitro.Conclusion:This study established the cultrue technical for SCs successfully.
, 百拇医药
Key words Satellite cell Differentiation Invitro
动力性瘫痪的修复一直是医学界较为棘手的课题，尽管游离肌肉移植以其动力修复的显著疗效，为外科医生所青睐，然而它对供区的损害及术后受区欠佳的外形和肌力分布又限制其广泛应用。近年来随着细胞生物学的迅猛发展和组织工程的兴起，骨骼肌再生这一古老的话题，重新又回到整复外科的研究日程上，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。在该研究领域中，肌卫星细胞(satellite cells)因其在应激状态下特有的成肌能力而得到重视[1]，故肌卫星细胞的体外培养又是研究肌再生的技术关键；大鼠肌卫星细胞的培养国内还未见报道，本研究成功建立了大鼠肌卫星细胞的培养体系并结合该种细胞独特的分化表现作了鉴定。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM/F12培养基，D′Hanks液，胶原酶，胰蛋白酶(sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；a-sarcometric actin单抗，SABC试剂盒(武汉博士德公司)。
, 百拇医药
1.2 实验动物 成年Wistar大鼠100g～250g(雌雄不限，第一军医大学动物所提供)。
1.3 细胞培养方法 大鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)成功后，无菌条件下取出前肢三头肌，称重，随即用D′Hanks液冲洗3遍，采用酶消化法培养(在Johnson报道的方法[2]基础上作了进一步改进)。
1.3.1 细胞的分离 解剖镜下尽可能剔除脂肪、血管等结缔组织，冲洗1次后，将肌组织块剪碎(以不大于1 mm3为宜)，然后移入离心管中，用D′Hanks液反复吹打3次，每次静置1 min后，均将上层液及其中的漂浮组织除去；加入0.1%胶原酶37℃消化30 min后，500g离心1 min，去上清；再用0.25%胰蛋白酶37℃消化1h之后(其间吹打数次)，加入含10%胎牛血清的培养基中止，反复吹打，500g离心1 min后上清液依次滤过100目、200目、400目不锈钢筛网，重复中止吹打过程4次，滤液收集后250g离心10 min，去上清，细胞团块用10%胎牛血清培养基重悬。
, http://www.100md.com
1.3.2 细胞的纯化、培养 为减少成纤维细胞的污染，将含细胞的培养液行差速贴壁法纯化，纯化后细胞行台盼兰染色计数，以不低于105/mL细胞密度种植于已涂0.01%多聚赖氨酸的培养瓶中，入二氧化碳孵箱中培养，以含10%胎牛血清DMEM/F12培养，每日换液1次。
1.4 形态学观察 每天换液后，在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化，分化融合、肌管形成时间及形态特征。
1.5 电镜和免疫细胞化学鉴定 将进入分化期的细胞，常规处理后行透射电镜和a-sarcometric acin免疫细胞化学检查，采用SABC法，以成纤维细胞和平滑肌细胞作阴性对照。
2 结果
2.1 细胞的形态特征
本研究方法分离的细胞，经台盼兰染色，显示成活率均在95%以上；培养24h后，见大量折光率强的圆形细胞贴壁，且有极个别细胞有小突起(图1)；48h，可见大量的梭形、纺锤形的单核细胞出现，其间混杂少量扁平、多突起、胞浆丰富的成纤维细胞和少量圆形细胞；随培养时间的延长，梭形细胞的数量逐渐增加，其胞浆出现2～3个突起，相互拉网；继续培养，单核细胞相互融合成为多核的肌管(图2)，肌管逐渐粗大、分叉增多(图3)。
, 百拇医药
2.2 电镜和免疫细胞化学特点
电镜检查显示细胞胞浆内有片状、束状的细丝；免疫细胞化学证实这些细丝呈a-sarcometric actin反应阳性(图4)，而成纤维细胞和平滑肌细胞均未见有阳性细丝。
图1 卫星细胞培养1d时的形态(×150) 图2 卫星细胞培养5d时的形态(×150)
图3 卫星细胞培养8d时的形态(×150) 图4 培养细胞的肌动蛋白免疫组化染色(×150)
3 讨论
3.1 细胞分离方法
卫星细胞因其位于基膜和肌细胞膜之间，紧贴肌细胞表面而得名[3]。Bischoff研究证实胶原酶并不能将这类细胞从基膜上消化下来，只有胰蛋白酶和链霉激酶有此能力[4]；本研究中的二步消化法，首先采用胶原酶消化的目的，是充分分散肌纤维以强化下一步胰蛋白酶的作用，实验结果表明分离出来的细胞产量、质量均较满意。
, 百拇医药
3.2 细胞形态、分化特点
虽然卫星细胞的形态与成纤维细胞极为相似，但在镜下仍能显示出有较大的差别。首先成纤维细胞的形态是扁平、多突起的，且其胞浆极其丰富，而卫星细胞则是以梭形、纺锤形为主，相互之间以细丝拉网；其次卫星细胞的分化与其它细胞有本质上的区别，它是单核细胞相互融合、最后形成多核细胞(肌管)的过程，产生了质的改变；分化后肌管的形态、生长发育特点与增殖期比较又有较大的不同；由此可知，如何控好分化的时机亦为肌组织工程研究的关键。
3.3 细胞鉴定特征
已有研究表明中间丝结蛋白是肌细胞的中间丝成分[5]，故传统的方法均采用desmin(结蛋白)抗体进行鉴定；但肌组织块中的血管平滑肌细胞也是成纤维样细胞，而且亦含有结蛋白，以往的研究往往忽略了排除平滑肌细胞的污染，本研究首次成功地采用横纹肌肌动蛋白(a-sarcometric actin)抗体对卫星细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞进行了鉴别。
, 百拇医药
结论：本研究采用二步消化法能培养出大量的卫星细胞，为肌组织工程研究作了材料上的准备和技术的研究，同时采用了特异性较强的鉴定方法。不足之处是：分离出的细胞悬液中含有较多的肌纤维碎片，。对细胞计数产生了一定的干扰，有待进一步改进。
参考文献
1 邬 江，钟世镇，李主一.卫星细胞在骨骼肌再生中的作用.国外医学：创伤与外科基本问题分册，1999，20(1)：3
2 Johnson SE,Allen RE.Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is expressed in activated rat skeletal muscle satellite cells.J Cell Physiol,1993,154:39
3 Yablonka RZ,Quinn LS,Nameroff M.Isolation and colonel analysis of satellite cells from chicken pectoralis muscle.Dev Bio,1987,119:252
, 百拇医药
4 Bischoff R.Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle.Anat Rec,1974,180:645
5 Fishman DA.Monoclonal antibodies to desmin:Evidence for stage dependent intermediate filament immunoreactivity during cardiac and skeletal muscle developent.Ann NY Acad Sci,1985,455:167
(收稿：1998-11-20), http://www.100md.com