一种分离衰老红细胞的方法：生物素标记法基本原理及其应用
作者：姚伟娟
单位：姚伟娟(北京医科大学物理教研室北京 100083)
关键词：生物素化；红细胞；衰老；生存期；生化特性
中国血液变学杂志000203 摘要 生物素标记法是近年来发展起来的一种分离衰老红细胞的技术。其基本原理是用生物素(NHS-Biotin)标记一定量的红细胞，使之参与血液循环，并在体衰老，利用biotin与抗生物素蛋白(avidin)之间的高亲和力，分离带有标记的、具有特定年龄的红细胞。实验证明这种技术能够精确获得不同特定年龄的红细胞亚群。该技术在临床中可取代51Cr标记法进行红细胞年龄的测定，并用来进行红细胞在体衰老过程中生物物理、生物化学特性的改变。
中图分类号
A METHOD OF SEPARATING SENESCENT ERYTHROCYTES:
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THE PRINCIPLE OF BIOTINYLATION AND ITS APPLICATIONS
Reviewsed by Yao Weijuan
(Department of Medical Physics,Beijing Medical University,10083)
Abstract Biotinylation is a new technique which has been developed in recent years to separate senescent erythrocytes.Its principle is as follows:red blood cells(RBCs) are labeled with NHS-Biotin,participated in the circulation and ages in vivo.Using the high affinity between biotin and avidin,the labeled RBCs with specific ages are separated.Experiments show that this technique can enable people to precisely get the subpopulations of RBCs with different specific ages.In clinical,it can take place of 51 Cr-labeling to measure the RBC′s life span.Furthermore,it can be used to study the biophysical and biochemical changes in the process of RBC′s senescence in vivo.
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Keywords biotin erythrocytes senescence life span biochemical characteristics
研究红细胞生存期(life span)内的在体衰老过程，对于进一步认识红细胞在正常生理状态下的发生、发展、老化、死亡的过程及病理状态红细胞的变异，阐明红细胞生命过程的机理，相关疾病的诊断治疗，提高输血效率，延长血库中血液保存期等有十分重要的基础和临床意义，各国学者对此做了大量的研究工作，并提出了许多假设。然而，由于缺乏一种分离特定年龄红细胞的方法，这方面的研究受到了阻碍。通常，人们使用物理技术来分离特定的红细胞亚群，这些技术的主要依据是：衰老红细胞的密度、体积、表面电荷和渗透脆性等物理特性与年轻红细胞相比发生了较大的变化。但是，由于使用这些技术进行的研究并不能得到一致的结论，它们都受到了不同程度的质疑[1]。在1987年，Suzuki和Dale[2]首次提出了用生物素标记红细胞进行合格内生存、体外恢复的方法，证明了这种方法能精确地获取不同年龄红细胞亚群，使研究红细胞在衰老过程中生物化学、生物物理特性的变化成为可能。之后，许多学者对此法进行了改进和研究，并运用这一方法研究了红细胞的衰老问题，本文将对其进行综述。
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1 生物素标记法的基本原理
如图1所示，使用体内注射苯肼[3]、苯肼盐酸盐[4]或多次失血的方法造成兔子贫血，出现网织红细胞增多症，使得动物休内的年轻红细胞比例增多。取一定量的血，用NHS-Biotin(脂溶性，N-Hydroxysuccinimidobiotin)对其进行体外标记，再将标记了的红细胞重新注入体内，这样，带有biotin标记的红细胞参与了血液循环，并随着时间的推移逐渐衰老。一定的时间间隔后，取血(既有标记的红细胞又有未标记的红细胞)，利用生物素与卵白素avidin之间的高亲合力，使带有生物素标记的红细胞与覆盖有avidin的凝胶特异结合，从而鼗带有标记的、具有特定年龄的红细胞从全血中分离出来。
图1 兔红细胞的标记与恢复
许多学者对这个方法进行了改进。首先，从实验动物上，使用狗[5-8]来取代常用的兔子。其主要原因是，狗的红细胞寿命约为115天，红细胞的随机清除率低，这与人红细胞的生存特性非常相似(人的红细胞寿命大约为120天)，而兔红细胞不仅寿命短(约为50-70天)，且具有年龄依赖的高随机消除率。不仅如此，由于狗的血量比兔子大，所以使用狗更能满足实验的需要。其次，将体外标记变为体内标记[5,6,9,10]。即直接将一定的NHS-Biotin注入动物血液中，这样至少能比体外标记法多标记3-4倍的红细胞(体内标记～100%，体外标记～25-30%)[6]，这对许多衰老研究来说是非常重要的。因为对衰老红细胞进行生化分析常需要较多的细胞数，而在标记后的一个生命周期的后期，循环血液中存在的衰老标记红细胞已相对很少，使研究不能进行。第三，从分离方法上，有的学者采用聚苯乙烯珠(polystyrenebeads)作为分离载体[2-4]，它们与标记红细胞特异结合后，通过离心的方法将其与未标记的红细胞分离；有的学者有杉磁珠(magnetic microbeads)[5,6,11]，与标记红细胞特异结合后，在磁场中与未标记红细胞分离；还有的采用聚苯乙烯珠微生物培养皿(polystyrene microbiologic petric dish)[12]，这种方法比前两者操作更简便，未标记红细胞的非特异结合水平很低。
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2 生物素标记法的可行性
人们不禁会有许多疑问，为什么要使用NHS-Biotin作为标记物?标记后的红细胞重新注入体内后是否与未标记红细胞具有相同的生存能力，是否一进入体内就会被体内的免疫系统消除?体外分离的红细胞中是否会有较多的示标记红细胞的“污染”?各国学者对此进行了深入的研究。
2.1 生物素作为标记物的可行性(suitability of biotin as labeling substance)
在不同的生物和分析系统中，avidin-biotin复合物已经成为非常有用的中介物[13]，其原因可归纳为：(1)avidin和biotin之间非常强的亲合力(1015M-1)，使有极端条件下可保证稳定连接：(2)可以将biotin连接到许多探针或配体上，而不改变它们的生物活性和生理特性；(3)存在许多商品化的生物素化药品以及含avidin的探针。就本方法来讲，不仅可以用覆盖avidin的珠分离标记红细胞[2]，也可用FITC-avidin(荧光标记物)来检测标记红细胞，并用流式细胞计(flow cytometry)进行定量分析[10,12]。从实验中可以看到，虽然标记100天或60天后全血中的标记红细胞的个数已经很派，但是由于流式细胞计或FACS可分析记录单个细胞，即使荧光强度的测量值到后期已经很低，FACS仍能可靠地将标记红细胞和未标记红细胞区分开来[7]。
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Magnani M.等[14]用NHS-Biotin(与红细胞膜蛋白的氨基结合)和biotin hydrazide(可引起红细胞膜的酰基氧化)使红细胞生物素化。通过比较发现，用NHS-Biotin进行标记具有更高的体外恢复率(>90%)，并在循环中24小时不受损害。相反，biotin hydrazide标记的细胞恢复率仅为5-30%，24小时内几乎消失。此外，在biotin的NHS衍生物中还有一种NHS-LC-biotin(sulphosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoate，具有2.2nm的臂，溶于水，结合于膜蛋白)。在体外实验中，这种衍生物细胞恢复率和每个细胞结合的分子数方面近似于或好于NHS-Biotin，而在体内实验中，它虽然具有24小时的循环生存时间，但几天后带有长臂的NHS-biotin就会丢失，这可能是由于血浆中的biotinidase造成的。Cavill等[15]和Hudson等[16]也同样发现用NHS-LC-biotin标记的红细胞在成人体内7天后消失和在婴儿体内3-4周后消失 。Hoffmann-Fezer等[10]使用了NHS-LC-biotin、溶于水的NHS-Biotin(Bxbiotin-WS)和溶于脂的Bxbiotin作为标记物，发现在体外，前两者都能很好地标记红细胞，但在体内仅4周后，它们标记的红细胞都成了未标记红细胞。Hoffmann-Fezer等[9]还使用自己合成的C-BNHS(Caproylamidobiotin-N-hydroxysuccinimide)进行标记，实验表明它与NHS-Biotin具有同样的效果。他们认为商品化的NHS-Biotin纯度不高，用于大型实验较昂贵，而合成的C-BNHS的产量较高，与红细胞孵育后不会引起大量红细胞的棘化，所以使用C-BNHS较好。但是同样由于NHS-Biotin的商品化，以及它在体内不会出现再利用的现象[2,10]目前仍常使用NHS-Biotin。
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2.2 溶剂的毒性(solvenn toxicity)
由于NHS-Biotin是脂溶性物质，只能用脂类物质来溶解，从而不可避免地带来了在标记过程中脂类物质对红细胞及动物体的毒副作用。在体外标记实验中，常用DMF(N.N-Dimethyl-formamide)来作为溶剂[2,7,10]。DMF的毒性通过测量清洗标记红细胞后的上清液中DMF的浓度来确定。Hoffmann-Fezer等[7]用气相色谱法测得上清液中DMF浓度远远低于由生理毒性动力模型计算的工作场所暴露在10ppmDMF气体中的剂量，因此，用DMF溶解NHS-Biotin标记红细胞并经过清洗后，再将红细胞注入动物体内，不会发生危险。在体内标记实验中，常用DMSO(Dimethyl sulfoxide)和DMA(Dimethylacetamide)[6,8]，虽然DMSO的毒性被描述过(狗LD50=2.5g/kg)，但它与DMA相比毒性较低，而且作为NHS-Biotin的溶剂效果更好。在实验中，通常给动物注射atropine sulfate来抵消DMSO的潜在的负作用。
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2.3 生物素标记的红细胞的生存能力(survival of the biotin-labeled red cels)
Suzuki等[2]发现将NHS-Biotin与红细胞共同孵育会引起红细胞的棘化，在用succinylated BSA处理后，阻止了红细胞的形变，使之保持与对照红细胞相同的形态。Cavill等[15]用NHS-LC-biotin和51Cr标记，测量19人的红细胞体积，发现两种标记之间没有差异。将红细胞同时标记上NHS-Biotin和14C，并用14C标记对照红细胞，在一定时间间隔内监外周血中生物素标记和14C标记的红细胞的百分数，发现两种标记的红细胞具有相同的生存能力[2,6]。Russo等[12]用流式细胞计证明了标记红细胞具有正常的生存周期。
由于51Cr是常用的测定红细胞生存寿命的一种方法[17]，有的学者[7,8]采用51Cr和NHS-Biotin同时标记红细胞，使用计数器和流式细胞计测量循环中红细胞的百分数，他们发现两种方法标记的红细胞百分数是平行变化的，并且在标记后60天(狗)或20-30天(鼠，兔)内，红细胞的生存百分数呈线性变化，随后呈对数变化趋势。用线性模型和对数模型对观察到的结果进行回归分析，发现红细胞的生存曲线更接近于直接[7,9,10,18]，而后期出现的对数趋可能是由于多次取血造成的标记红细胞的丢失所致[10]。用回归方程来计算动物和人红细胞的生存年龄[7,10,18]，如：狗的红细胞平均生存时间t=93天，小鼠红细胞的平均生存时间在44-52天之间t50=23.9天，这些结果与其它方法测定的年龄相似。这说明了生物素标记的红细胞在体内血液循环中并没有被清除掉，而是与未标记红细胞一样具有正常的寿命。
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综上所述，用NHSBiotin标记红细胞后并不影响红细胞的正常生理机能，同时使获取不同年龄阶段的红细胞成为可能。由于这种方法的简便易行，各国学者利用它做了大量的工作，其中包括对红细胞生命周期的测定，红细胞在体衰老过程中生物物理、生物化学特性的改变。
3 生物素标记法的应用
3.1 对密度梯度离心法的质疑[19]
密度梯度离心许多年来一直是用来分离衰老红细胞亚群的标准方法，然而却没有一种对它进行定量估计的技术，它的可靠性一直受珍人们的怀疑。Dale等用NHS-Biotin对兔红细胞进行体内标记，大约90%的循环红细胞被标记，这些年龄随机分布的红细胞在体内衰老。在标记50天后，循环血中被标记细胞是寿命大于50天的衰老细胞，而未标记细胞则为较年轻细胞。此时，利用Percoll/hypaque对全血进行密度梯度离心，检测每个密度分布上的biotin阳性细胞数。结果发现，密度最大的红细胞亚群中biotin阳性细胞所占百分数仅为全血中阳性细胞百分数的2-3倍，这说明密度最大的红细胞亚群并没有包括足够多的衰老红细胞用来进行与衰老有关的生化研究。
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3.2 对红细胞生存周期的测定
在胎儿和婴儿期，贫血是非常严重的问题，为了研究贫血的生理和病生理过程并评价输血和erythropoientin治疗的反应，测量循环中红细胞的生存期将是必要的[18]。而一般常用的方法是用51Cr对红细胞进行标记，但51Cr的辐射性会给病人带来不利的影响。正如上述中所列举的例子说明生物素标记法很稳定，可以测定红细胞的生存周期，尤其是不会对动物休或人体造成辐射损伤，因此这种方法有很好的应用前景。Franco等[20]用此法研究了镰刀型红细胞的衰老过程，标记的镰刀型红细胞在标记后4-6天内密度增加，随后密度变化较小，不含胎儿血红蛋白(HbF)的镰刀型红细胞生命周期仅为2周，而含HbF的镰刀型红细胞生命周期为6-8周。
3.3 对衰老红细胞流变特性的研究[3]
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Waugh等用NHS-Biotin标记兔红细胞，获得不同年龄红细胞亚群。通过微吸管的测量发现，衰老红细胞具有正常的膜弹性。随着年龄的增加，红细胞表面积和体只逐渐减小：第50天的红细胞表面积、体积较对照红细胞少10.5%和8.4%，较第8天的表面少11.6%，而表面积/体积比变化不大，平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)的增加说明红细胞在衰老过程中脱水。用激光衍射仪测得红细胞的变形能力降低，这可能是由于红细胞表面积减小和脱水造成的。将这些结果与用密度梯度离心得到的密度最大的人红细胞相比，二者相似。这都说明红细胞在衰老过程中表面积的丢失和脱水是其显著的特性。
3.4 对在体衰老的红细胞生物化学特性的研究
Suzuki和Dale[4]用体外标记的方法，分析了年龄在50-60天内的兔红细胞的生化参数：2，3-二磷酸甘油酸盐和谷胱甘肽水平，以及一些与糖酵解和磷酸己糖通路相联系的酶活性都不随年龄改变，而ATP浓度却增加了大约75%。对这一问题，Dale和Norenberg[12]解释说，虽然衰老的兔红细胞具有正常的腺苷酸合成能力(即具有正常的adenosine kinase水平)，然而AMP脱氨酶(降解腺苷酸的关键酶)水平却降低，这样造成了衰老红细胞中ATP的聚集。Zimran等[21]通过分离成熟中的网织红细胞并用生物素标记，对兔红细胞在体衰老过程中酶的变化作了全面的研究，他们观察到了六种年龄依赖的酶活性衰减的双向变化模式，这六种酶分别为：醛缩酶、谷草转氨酶、萄萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、嘧啶-5′-核酸酶和丙酮酸激酶，同时也观察到13种酶的活性不随红细胞年龄的改变而改变。Jindal等[22]则发现，兔红细胞浆中的蛋白激酶C(PKC)，cAMP依赖的激酶(PKA)和酪蛋白激酶Ⅰ型、Ⅱ型(CKI，Ⅱ)的活性在8周的生命周期中降低了2-4倍。膜连接的酪氨酸激酶有一定或不降低，而膜连接的CKI活性却增加了8倍。相反地，包括乳酸脱氢酶、磷酸甘油酸盐激酶(phosphoglycerate kinase)、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶在内的胞浆酶的活性却没有改变。这些结果表明衰老中的红细胞正逐渐丢失蛋白激酶的活性。由于蛋白激酶可引起红细胞骨架蛋白的磷酸化，从而对骨架蛋白的相互作用产生深刻的影响，所以蛋白激酶在红细胞功能中发挥重要作用，激酶水平的降低可能会对红细胞的生存产生重要的影响。
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Suzuki和Dale[23]发现衰老的红细胞中α-spectrin与β-spectrin的比与ankyrin一样都正常，4.1a/4.1b有所改变但4.1的总量并没有改变，膜上没有出现大分子量的聚集蛋白，表明兔红细胞的衰老并没有伴随着蛋白水解或膜成份的谷胱甘肽酶催化的交联。Retting等[8]用狗作为实验动物，发现年龄≥112天的红细胞中与膜骨架相互作用的band 3比照组红细胞少25%，说明band 3与膜骨架之间的正常连接可能被破坏。有趣的是，41/4.1b比值在第58天时最大(狗红细胞寿命为115天)，说明这个比值对览别年龄短的红细胞群有用，但对狗的衰老红细胞来说并不十分灵敏。他们观察到，狗的衰老红细胞中含的膜结合(变性)Hb升高，表面结合的自身IgG增加了7倍。Christian等[5]也同样发现，狗的红细胞年龄在104到110天时，使用[125]I标记的羊抗狗IgG(SAD-IgG)检测到的自身IgG比对照红细胞有3倍的增加，而且增加的IgG不是由于对生物素的免疫反应造成的。Dale等[25]却发现兔红细胞在60天的生命周期内结合的IgG为正常水平，可见IgG聚集并不是兔红细胞衰老过程的一部分。
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总之，生物素标记法具有很强的实用性，在研究红细胞的衰老过程中必将发挥越来越重要的作用。近年来文宗曜和Shu Chien等[25]提出了一种抗体诱导的红细胞衰老的动物模型，由于抗体—抗原反应仅作用于红细胞表面，对动物的造血机能损伤魏小。用此模型研究红细胞流变特性随生命周期的变化规律，他们发现生命的流变特性前半周期变化缓慢，后半周期变化迅速。我们将用上述的生物素标记法，对该模型进行对比研究，从而这一模型作出正确评价。
参考文献
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(2000年2月29日收稿), 百拇医药
单位：姚伟娟(北京医科大学物理教研室北京 100083)
关键词：生物素化；红细胞；衰老；生存期；生化特性
中国血液变学杂志000203 摘要 生物素标记法是近年来发展起来的一种分离衰老红细胞的技术。其基本原理是用生物素(NHS-Biotin)标记一定量的红细胞，使之参与血液循环，并在体衰老，利用biotin与抗生物素蛋白(avidin)之间的高亲和力，分离带有标记的、具有特定年龄的红细胞。实验证明这种技术能够精确获得不同特定年龄的红细胞亚群。该技术在临床中可取代51Cr标记法进行红细胞年龄的测定，并用来进行红细胞在体衰老过程中生物物理、生物化学特性的改变。
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Reviewsed by Yao Weijuan
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Abstract Biotinylation is a new technique which has been developed in recent years to separate senescent erythrocytes.Its principle is as follows:red blood cells(RBCs) are labeled with NHS-Biotin,participated in the circulation and ages in vivo.Using the high affinity between biotin and avidin,the labeled RBCs with specific ages are separated.Experiments show that this technique can enable people to precisely get the subpopulations of RBCs with different specific ages.In clinical,it can take place of 51 Cr-labeling to measure the RBC′s life span.Furthermore,it can be used to study the biophysical and biochemical changes in the process of RBC′s senescence in vivo.
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研究红细胞生存期(life span)内的在体衰老过程，对于进一步认识红细胞在正常生理状态下的发生、发展、老化、死亡的过程及病理状态红细胞的变异，阐明红细胞生命过程的机理，相关疾病的诊断治疗，提高输血效率，延长血库中血液保存期等有十分重要的基础和临床意义，各国学者对此做了大量的研究工作，并提出了许多假设。然而，由于缺乏一种分离特定年龄红细胞的方法，这方面的研究受到了阻碍。通常，人们使用物理技术来分离特定的红细胞亚群，这些技术的主要依据是：衰老红细胞的密度、体积、表面电荷和渗透脆性等物理特性与年轻红细胞相比发生了较大的变化。但是，由于使用这些技术进行的研究并不能得到一致的结论，它们都受到了不同程度的质疑[1]。在1987年，Suzuki和Dale[2]首次提出了用生物素标记红细胞进行合格内生存、体外恢复的方法，证明了这种方法能精确地获取不同年龄红细胞亚群，使研究红细胞在衰老过程中生物化学、生物物理特性的变化成为可能。之后，许多学者对此法进行了改进和研究，并运用这一方法研究了红细胞的衰老问题，本文将对其进行综述。
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1 生物素标记法的基本原理
如图1所示，使用体内注射苯肼[3]、苯肼盐酸盐[4]或多次失血的方法造成兔子贫血，出现网织红细胞增多症，使得动物休内的年轻红细胞比例增多。取一定量的血，用NHS-Biotin(脂溶性，N-Hydroxysuccinimidobiotin)对其进行体外标记，再将标记了的红细胞重新注入体内，这样，带有biotin标记的红细胞参与了血液循环，并随着时间的推移逐渐衰老。一定的时间间隔后，取血(既有标记的红细胞又有未标记的红细胞)，利用生物素与卵白素avidin之间的高亲合力，使带有生物素标记的红细胞与覆盖有avidin的凝胶特异结合，从而鼗带有标记的、具有特定年龄的红细胞从全血中分离出来。
图1 兔红细胞的标记与恢复
许多学者对这个方法进行了改进。首先，从实验动物上，使用狗[5-8]来取代常用的兔子。其主要原因是，狗的红细胞寿命约为115天，红细胞的随机清除率低，这与人红细胞的生存特性非常相似(人的红细胞寿命大约为120天)，而兔红细胞不仅寿命短(约为50-70天)，且具有年龄依赖的高随机消除率。不仅如此，由于狗的血量比兔子大，所以使用狗更能满足实验的需要。其次，将体外标记变为体内标记[5,6,9,10]。即直接将一定的NHS-Biotin注入动物血液中，这样至少能比体外标记法多标记3-4倍的红细胞(体内标记～100%，体外标记～25-30%)[6]，这对许多衰老研究来说是非常重要的。因为对衰老红细胞进行生化分析常需要较多的细胞数，而在标记后的一个生命周期的后期，循环血液中存在的衰老标记红细胞已相对很少，使研究不能进行。第三，从分离方法上，有的学者采用聚苯乙烯珠(polystyrenebeads)作为分离载体[2-4]，它们与标记红细胞特异结合后，通过离心的方法将其与未标记的红细胞分离；有的学者有杉磁珠(magnetic microbeads)[5,6,11]，与标记红细胞特异结合后，在磁场中与未标记红细胞分离；还有的采用聚苯乙烯珠微生物培养皿(polystyrene microbiologic petric dish)[12]，这种方法比前两者操作更简便，未标记红细胞的非特异结合水平很低。
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2 生物素标记法的可行性
人们不禁会有许多疑问，为什么要使用NHS-Biotin作为标记物?标记后的红细胞重新注入体内后是否与未标记红细胞具有相同的生存能力，是否一进入体内就会被体内的免疫系统消除?体外分离的红细胞中是否会有较多的示标记红细胞的“污染”?各国学者对此进行了深入的研究。
2.1 生物素作为标记物的可行性(suitability of biotin as labeling substance)
在不同的生物和分析系统中，avidin-biotin复合物已经成为非常有用的中介物[13]，其原因可归纳为：(1)avidin和biotin之间非常强的亲合力(1015M-1)，使有极端条件下可保证稳定连接：(2)可以将biotin连接到许多探针或配体上，而不改变它们的生物活性和生理特性；(3)存在许多商品化的生物素化药品以及含avidin的探针。就本方法来讲，不仅可以用覆盖avidin的珠分离标记红细胞[2]，也可用FITC-avidin(荧光标记物)来检测标记红细胞，并用流式细胞计(flow cytometry)进行定量分析[10,12]。从实验中可以看到，虽然标记100天或60天后全血中的标记红细胞的个数已经很派，但是由于流式细胞计或FACS可分析记录单个细胞，即使荧光强度的测量值到后期已经很低，FACS仍能可靠地将标记红细胞和未标记红细胞区分开来[7]。
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Magnani M.等[14]用NHS-Biotin(与红细胞膜蛋白的氨基结合)和biotin hydrazide(可引起红细胞膜的酰基氧化)使红细胞生物素化。通过比较发现，用NHS-Biotin进行标记具有更高的体外恢复率(>90%)，并在循环中24小时不受损害。相反，biotin hydrazide标记的细胞恢复率仅为5-30%，24小时内几乎消失。此外，在biotin的NHS衍生物中还有一种NHS-LC-biotin(sulphosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoate，具有2.2nm的臂，溶于水，结合于膜蛋白)。在体外实验中，这种衍生物细胞恢复率和每个细胞结合的分子数方面近似于或好于NHS-Biotin，而在体内实验中，它虽然具有24小时的循环生存时间，但几天后带有长臂的NHS-biotin就会丢失，这可能是由于血浆中的biotinidase造成的。Cavill等[15]和Hudson等[16]也同样发现用NHS-LC-biotin标记的红细胞在成人体内7天后消失和在婴儿体内3-4周后消失 。Hoffmann-Fezer等[10]使用了NHS-LC-biotin、溶于水的NHS-Biotin(Bxbiotin-WS)和溶于脂的Bxbiotin作为标记物，发现在体外，前两者都能很好地标记红细胞，但在体内仅4周后，它们标记的红细胞都成了未标记红细胞。Hoffmann-Fezer等[9]还使用自己合成的C-BNHS(Caproylamidobiotin-N-hydroxysuccinimide)进行标记，实验表明它与NHS-Biotin具有同样的效果。他们认为商品化的NHS-Biotin纯度不高，用于大型实验较昂贵，而合成的C-BNHS的产量较高，与红细胞孵育后不会引起大量红细胞的棘化，所以使用C-BNHS较好。但是同样由于NHS-Biotin的商品化，以及它在体内不会出现再利用的现象[2,10]目前仍常使用NHS-Biotin。
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2.2 溶剂的毒性(solvenn toxicity)
由于NHS-Biotin是脂溶性物质，只能用脂类物质来溶解，从而不可避免地带来了在标记过程中脂类物质对红细胞及动物体的毒副作用。在体外标记实验中，常用DMF(N.N-Dimethyl-formamide)来作为溶剂[2,7,10]。DMF的毒性通过测量清洗标记红细胞后的上清液中DMF的浓度来确定。Hoffmann-Fezer等[7]用气相色谱法测得上清液中DMF浓度远远低于由生理毒性动力模型计算的工作场所暴露在10ppmDMF气体中的剂量，因此，用DMF溶解NHS-Biotin标记红细胞并经过清洗后，再将红细胞注入动物体内，不会发生危险。在体内标记实验中，常用DMSO(Dimethyl sulfoxide)和DMA(Dimethylacetamide)[6,8]，虽然DMSO的毒性被描述过(狗LD50=2.5g/kg)，但它与DMA相比毒性较低，而且作为NHS-Biotin的溶剂效果更好。在实验中，通常给动物注射atropine sulfate来抵消DMSO的潜在的负作用。
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2.3 生物素标记的红细胞的生存能力(survival of the biotin-labeled red cels)
Suzuki等[2]发现将NHS-Biotin与红细胞共同孵育会引起红细胞的棘化，在用succinylated BSA处理后，阻止了红细胞的形变，使之保持与对照红细胞相同的形态。Cavill等[15]用NHS-LC-biotin和51Cr标记，测量19人的红细胞体积，发现两种标记之间没有差异。将红细胞同时标记上NHS-Biotin和14C，并用14C标记对照红细胞，在一定时间间隔内监外周血中生物素标记和14C标记的红细胞的百分数，发现两种标记的红细胞具有相同的生存能力[2,6]。Russo等[12]用流式细胞计证明了标记红细胞具有正常的生存周期。
由于51Cr是常用的测定红细胞生存寿命的一种方法[17]，有的学者[7,8]采用51Cr和NHS-Biotin同时标记红细胞，使用计数器和流式细胞计测量循环中红细胞的百分数，他们发现两种方法标记的红细胞百分数是平行变化的，并且在标记后60天(狗)或20-30天(鼠，兔)内，红细胞的生存百分数呈线性变化，随后呈对数变化趋势。用线性模型和对数模型对观察到的结果进行回归分析，发现红细胞的生存曲线更接近于直接[7,9,10,18]，而后期出现的对数趋可能是由于多次取血造成的标记红细胞的丢失所致[10]。用回归方程来计算动物和人红细胞的生存年龄[7,10,18]，如：狗的红细胞平均生存时间t=93天，小鼠红细胞的平均生存时间在44-52天之间t50=23.9天，这些结果与其它方法测定的年龄相似。这说明了生物素标记的红细胞在体内血液循环中并没有被清除掉，而是与未标记红细胞一样具有正常的寿命。
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综上所述，用NHSBiotin标记红细胞后并不影响红细胞的正常生理机能，同时使获取不同年龄阶段的红细胞成为可能。由于这种方法的简便易行，各国学者利用它做了大量的工作，其中包括对红细胞生命周期的测定，红细胞在体衰老过程中生物物理、生物化学特性的改变。
3 生物素标记法的应用
3.1 对密度梯度离心法的质疑[19]
密度梯度离心许多年来一直是用来分离衰老红细胞亚群的标准方法，然而却没有一种对它进行定量估计的技术，它的可靠性一直受珍人们的怀疑。Dale等用NHS-Biotin对兔红细胞进行体内标记，大约90%的循环红细胞被标记，这些年龄随机分布的红细胞在体内衰老。在标记50天后，循环血中被标记细胞是寿命大于50天的衰老细胞，而未标记细胞则为较年轻细胞。此时，利用Percoll/hypaque对全血进行密度梯度离心，检测每个密度分布上的biotin阳性细胞数。结果发现，密度最大的红细胞亚群中biotin阳性细胞所占百分数仅为全血中阳性细胞百分数的2-3倍，这说明密度最大的红细胞亚群并没有包括足够多的衰老红细胞用来进行与衰老有关的生化研究。
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3.2 对红细胞生存周期的测定
在胎儿和婴儿期，贫血是非常严重的问题，为了研究贫血的生理和病生理过程并评价输血和erythropoientin治疗的反应，测量循环中红细胞的生存期将是必要的[18]。而一般常用的方法是用51Cr对红细胞进行标记，但51Cr的辐射性会给病人带来不利的影响。正如上述中所列举的例子说明生物素标记法很稳定，可以测定红细胞的生存周期，尤其是不会对动物休或人体造成辐射损伤，因此这种方法有很好的应用前景。Franco等[20]用此法研究了镰刀型红细胞的衰老过程，标记的镰刀型红细胞在标记后4-6天内密度增加，随后密度变化较小，不含胎儿血红蛋白(HbF)的镰刀型红细胞生命周期仅为2周，而含HbF的镰刀型红细胞生命周期为6-8周。
3.3 对衰老红细胞流变特性的研究[3]
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Waugh等用NHS-Biotin标记兔红细胞，获得不同年龄红细胞亚群。通过微吸管的测量发现，衰老红细胞具有正常的膜弹性。随着年龄的增加，红细胞表面积和体只逐渐减小：第50天的红细胞表面积、体积较对照红细胞少10.5%和8.4%，较第8天的表面少11.6%，而表面积/体积比变化不大，平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)的增加说明红细胞在衰老过程中脱水。用激光衍射仪测得红细胞的变形能力降低，这可能是由于红细胞表面积减小和脱水造成的。将这些结果与用密度梯度离心得到的密度最大的人红细胞相比，二者相似。这都说明红细胞在衰老过程中表面积的丢失和脱水是其显著的特性。
3.4 对在体衰老的红细胞生物化学特性的研究
Suzuki和Dale[4]用体外标记的方法，分析了年龄在50-60天内的兔红细胞的生化参数：2，3-二磷酸甘油酸盐和谷胱甘肽水平，以及一些与糖酵解和磷酸己糖通路相联系的酶活性都不随年龄改变，而ATP浓度却增加了大约75%。对这一问题，Dale和Norenberg[12]解释说，虽然衰老的兔红细胞具有正常的腺苷酸合成能力(即具有正常的adenosine kinase水平)，然而AMP脱氨酶(降解腺苷酸的关键酶)水平却降低，这样造成了衰老红细胞中ATP的聚集。Zimran等[21]通过分离成熟中的网织红细胞并用生物素标记，对兔红细胞在体衰老过程中酶的变化作了全面的研究，他们观察到了六种年龄依赖的酶活性衰减的双向变化模式，这六种酶分别为：醛缩酶、谷草转氨酶、萄萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、嘧啶-5′-核酸酶和丙酮酸激酶，同时也观察到13种酶的活性不随红细胞年龄的改变而改变。Jindal等[22]则发现，兔红细胞浆中的蛋白激酶C(PKC)，cAMP依赖的激酶(PKA)和酪蛋白激酶Ⅰ型、Ⅱ型(CKI，Ⅱ)的活性在8周的生命周期中降低了2-4倍。膜连接的酪氨酸激酶有一定或不降低，而膜连接的CKI活性却增加了8倍。相反地，包括乳酸脱氢酶、磷酸甘油酸盐激酶(phosphoglycerate kinase)、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶在内的胞浆酶的活性却没有改变。这些结果表明衰老中的红细胞正逐渐丢失蛋白激酶的活性。由于蛋白激酶可引起红细胞骨架蛋白的磷酸化，从而对骨架蛋白的相互作用产生深刻的影响，所以蛋白激酶在红细胞功能中发挥重要作用，激酶水平的降低可能会对红细胞的生存产生重要的影响。
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Suzuki和Dale[23]发现衰老的红细胞中α-spectrin与β-spectrin的比与ankyrin一样都正常，4.1a/4.1b有所改变但4.1的总量并没有改变，膜上没有出现大分子量的聚集蛋白，表明兔红细胞的衰老并没有伴随着蛋白水解或膜成份的谷胱甘肽酶催化的交联。Retting等[8]用狗作为实验动物，发现年龄≥112天的红细胞中与膜骨架相互作用的band 3比照组红细胞少25%，说明band 3与膜骨架之间的正常连接可能被破坏。有趣的是，41/4.1b比值在第58天时最大(狗红细胞寿命为115天)，说明这个比值对览别年龄短的红细胞群有用，但对狗的衰老红细胞来说并不十分灵敏。他们观察到，狗的衰老红细胞中含的膜结合(变性)Hb升高，表面结合的自身IgG增加了7倍。Christian等[5]也同样发现，狗的红细胞年龄在104到110天时，使用[125]I标记的羊抗狗IgG(SAD-IgG)检测到的自身IgG比对照红细胞有3倍的增加，而且增加的IgG不是由于对生物素的免疫反应造成的。Dale等[25]却发现兔红细胞在60天的生命周期内结合的IgG为正常水平，可见IgG聚集并不是兔红细胞衰老过程的一部分。
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总之，生物素标记法具有很强的实用性，在研究红细胞的衰老过程中必将发挥越来越重要的作用。近年来文宗曜和Shu Chien等[25]提出了一种抗体诱导的红细胞衰老的动物模型，由于抗体—抗原反应仅作用于红细胞表面，对动物的造血机能损伤魏小。用此模型研究红细胞流变特性随生命周期的变化规律，他们发现生命的流变特性前半周期变化缓慢，后半周期变化迅速。我们将用上述的生物素标记法，对该模型进行对比研究，从而这一模型作出正确评价。
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(2000年2月29日收稿), 百拇医药