谷氨酰胺在胃肠手术患者外周血单个核细胞中的代谢及其对抗氧化能力的影响
作者：杨俊涛 王正国 朱佩芳
单位：杨俊涛 第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科；王正国 朱佩芳 第三军医大学大坪医院野战外科研究所 第四研究室(重庆 400042)
关键词：
谷氨酰胺在胃肠手术患者外周血单个核细胞 中的代谢及其对抗氧化能力的影响
谷氨酰胺(glutamine, Gln)是合成体内抗氧化剂—还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)的前体物质。研究表明，手术创伤后出现免疫抑制的同时常伴有体内Gln含量的显著降低。本实验旨在评价补充Gln能否维持胃肠手术患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)内GSH水平和减少其脂质过氧化反应，并探讨其可能的机理。
, 百拇医药
方 法
(一)对象与分组：胃、十二指肠溃疡患者14例，男11例，女3例，年龄27～60岁。全部患者均行择期胃大部切除术，术中将鼻空肠饲管送入空肠。实验分为Gln组(n=7)和Non-Gln组(n=7)。术后采用外周静脉营养支持(含氮量0.20 g·kg-1·d-1，热量108.78 kJ·kg-1·d-1，糖脂比1∶1)1周，同时Gln组于术后第2d开始经肠内补充Gln溶液(0.3 g·kg-1·d-1)，Non-Gln组则经肠内补充等氮和等能量的其他氨基酸替代Gln。分别于术前、术后第1 d和第6 d采血3次，用Ficoll分离液制备PBMC悬液。
(二)检测指标及方法：(1)Gln含量：PBMC沉淀加入HClO4终止代谢，超声破膜处理后加入K2CO3，4℃离心收集上清样本，用反相高效液相法进行测定。(2)Gln的利用率：用RPMI 1640培养液(含2mmol/L Gln)调整PBMC浓度，在植物血凝素存在下，37℃体积分数为5%CO2培养24h，收集上清，按前述方法测定培养前后培养液中的Gln含量，以Gln在培养液中的消失率表示利用率。(3)谷氨酰胺酶(glutaminase, GA)活性，PBMC沉淀加入匀浆液，超声破膜制备细胞匀浆液，37℃下酶反应30min，加入96%预冷甲醇并置冰浴中冷却，离心取上清用于Gln和谷氨酸的高效液相测定。以每分钟谷氨酸的产量来计算酶活性。(4)GSH水平：PBMC沉淀加入5%三氯醋酸，超声破膜，冰浴30 min，离心取上清后用荧光光度法进行测定。(5)丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平：PBMC沉淀加入1/24mol/L H2SO4，10%磷钨酸，静置10min，离心弃上清，沉淀中加入双蒸水混悬后，按硫代巴比妥酸荧光法进行测定。
, 百拇医药
结 果
手术患者PBMC内Gln含量、Gln利用率和GA活性见表1；GSH、MDA水平见表2。
表1 胃肠手术患者PBMC内Gln含量、Gln利用率、GA活性的变化
Tab 1 The changes of Gln content, GA activity and rate of Gln utilization in PBMC from gastrointestinal surgical patients(
±s)
Group
, http://www.100md.com
PBMC
Gln content
(nmol/107 cells)
Rate of Gln utilization(nmol/106cells·24h-1)
GA activity
(nmol/min·mg-1 protein)
Preoperative
Non=Gln
3.15±0.87
, 百拇医药
112.71±25.48
36.54±10.13
Gln
2.96±0.52
107.57±32.35
33.13±8.89
Postoperative day1
Non=Gln
2.37±0.60
179.86±30.41**
61.34±13.25**
, http://www.100md.com
Gln
2.43±0.68
183.43±36.01**
54.37±13.40**
Postoperaive day6
Non=Gln
2.11±0.56*
141.57±22.32*
41.63±9.20
Gln
3.41±0.91##
, http://www.100md.com
190.86±41.04**##
58.24±14.56**#
*P<0.05，**P<0.01，vs preoperave; ＃P<0.05，＃＃P<0.01，vs Non-Gln 讨 论
Gln在PBMC中有很高的利用率，而GA作为PBMC内Gln代谢的起始酶和关键酶，其活性也是衡量PBMC利用Gln的重要指标。近年来的研究表明，大手术患者血浆Gln水平明显降低，但是否会引起PBMC内Gln含量及代谢变化，目前研究甚少。本研究发现，术后PBMC对Gln的利用率加快，GA活性升高；但若不补充Gln，细胞内Gln含量将逐渐减少，导致GA活性及Gln利用率下降；肠内补充Gln，能有效地维持PBMC内Gln的正常含量，提高PBMC内Gln的代谢水平平。
GSH是由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的三肽复合物，其中谷氨酸来源于Gln。因此，术后血浆及细胞内Gln水平下降极有可能成为GSH合成的限速因素，其结果是机体抗氧化能力持续降低；术后补充Gln，维持了PBMC内Gln的正常含量，并提高了细胞内Gln的代谢水平，从而为GSH的合成提供了有利条件。本实验观察到，术后PBMC内GSH浓度明显下降，MDA含量明显增加，表明细胞内脂质过氧化反应增强，GSH消耗增加或/GSH产生减少。术后第6 d，Gln组PBMC内GSH、MDA水平较术前已无显著差异，而Non-Gln组差异明显。结果提示，补充Gln能维持术后PBMC内GSH正常含量，增强其抗氧化损伤能力。
, 百拇医药
表2 胃肠手术患者PBMC内GSH和MDA水平的变化
Tab 2 The changes of GSH, MDA levels in PBMC from
gastrointestinal surgical patients (±s)
Group
PBMC
GSH level
(nmol/107 cells)
, 百拇医药
MDA level
(nmol/107 cells)
Preoperative
Non-Gln
12.86±3.04
2.39±0.89
Gln
13.37±3.89
3.04±1.06
Postoperative day 1
Non-Gln
, 百拇医药
8.49±3.51*
4.86±1.79**
Gln
7.98±2.91*
5.85±1.40**
Postoperative day 6
Non-Gln
9.19±2.20*
4.23±1.57*
Gln
12.64±3.06＃
4.12±1.28
*P<0.05，**P<0.01,vs preoperative; ＃P<0.05，vs Non-Gln
收稿日期：1998年8月28日
修稿日期：1998年12月18日, 百拇医药
单位：杨俊涛 第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科；王正国 朱佩芳 第三军医大学大坪医院野战外科研究所 第四研究室(重庆 400042)
关键词：
谷氨酰胺在胃肠手术患者外周血单个核细胞 中的代谢及其对抗氧化能力的影响
谷氨酰胺(glutamine, Gln)是合成体内抗氧化剂—还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)的前体物质。研究表明，手术创伤后出现免疫抑制的同时常伴有体内Gln含量的显著降低。本实验旨在评价补充Gln能否维持胃肠手术患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)内GSH水平和减少其脂质过氧化反应，并探讨其可能的机理。
, 百拇医药
方 法
(一)对象与分组：胃、十二指肠溃疡患者14例，男11例，女3例，年龄27～60岁。全部患者均行择期胃大部切除术，术中将鼻空肠饲管送入空肠。实验分为Gln组(n=7)和Non-Gln组(n=7)。术后采用外周静脉营养支持(含氮量0.20 g·kg-1·d-1，热量108.78 kJ·kg-1·d-1，糖脂比1∶1)1周，同时Gln组于术后第2d开始经肠内补充Gln溶液(0.3 g·kg-1·d-1)，Non-Gln组则经肠内补充等氮和等能量的其他氨基酸替代Gln。分别于术前、术后第1 d和第6 d采血3次，用Ficoll分离液制备PBMC悬液。
(二)检测指标及方法：(1)Gln含量：PBMC沉淀加入HClO4终止代谢，超声破膜处理后加入K2CO3，4℃离心收集上清样本，用反相高效液相法进行测定。(2)Gln的利用率：用RPMI 1640培养液(含2mmol/L Gln)调整PBMC浓度，在植物血凝素存在下，37℃体积分数为5%CO2培养24h，收集上清，按前述方法测定培养前后培养液中的Gln含量，以Gln在培养液中的消失率表示利用率。(3)谷氨酰胺酶(glutaminase, GA)活性，PBMC沉淀加入匀浆液，超声破膜制备细胞匀浆液，37℃下酶反应30min，加入96%预冷甲醇并置冰浴中冷却，离心取上清用于Gln和谷氨酸的高效液相测定。以每分钟谷氨酸的产量来计算酶活性。(4)GSH水平：PBMC沉淀加入5%三氯醋酸，超声破膜，冰浴30 min，离心取上清后用荧光光度法进行测定。(5)丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平：PBMC沉淀加入1/24mol/L H2SO4，10%磷钨酸，静置10min，离心弃上清，沉淀中加入双蒸水混悬后，按硫代巴比妥酸荧光法进行测定。
, 百拇医药
结 果
手术患者PBMC内Gln含量、Gln利用率和GA活性见表1；GSH、MDA水平见表2。
表1 胃肠手术患者PBMC内Gln含量、Gln利用率、GA活性的变化
Tab 1 The changes of Gln content, GA activity and rate of Gln utilization in PBMC from gastrointestinal surgical patients(
±s)Group
, http://www.100md.com
PBMC
Gln content
(nmol/107 cells)
Rate of Gln utilization(nmol/106cells·24h-1)
GA activity
(nmol/min·mg-1 protein)
Preoperative
Non=Gln
3.15±0.87
, 百拇医药
112.71±25.48
36.54±10.13
Gln
2.96±0.52
107.57±32.35
33.13±8.89
Postoperative day1
Non=Gln
2.37±0.60
179.86±30.41**
61.34±13.25**
, http://www.100md.com
Gln
2.43±0.68
183.43±36.01**
54.37±13.40**
Postoperaive day6
Non=Gln
2.11±0.56*
141.57±22.32*
41.63±9.20
Gln
3.41±0.91##
, http://www.100md.com
190.86±41.04**##
58.24±14.56**#
*P<0.05，**P<0.01，vs preoperave; ＃P<0.05，＃＃P<0.01，vs Non-Gln 讨 论
Gln在PBMC中有很高的利用率，而GA作为PBMC内Gln代谢的起始酶和关键酶，其活性也是衡量PBMC利用Gln的重要指标。近年来的研究表明，大手术患者血浆Gln水平明显降低，但是否会引起PBMC内Gln含量及代谢变化，目前研究甚少。本研究发现，术后PBMC对Gln的利用率加快，GA活性升高；但若不补充Gln，细胞内Gln含量将逐渐减少，导致GA活性及Gln利用率下降；肠内补充Gln，能有效地维持PBMC内Gln的正常含量，提高PBMC内Gln的代谢水平平。
GSH是由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的三肽复合物，其中谷氨酸来源于Gln。因此，术后血浆及细胞内Gln水平下降极有可能成为GSH合成的限速因素，其结果是机体抗氧化能力持续降低；术后补充Gln，维持了PBMC内Gln的正常含量，并提高了细胞内Gln的代谢水平，从而为GSH的合成提供了有利条件。本实验观察到，术后PBMC内GSH浓度明显下降，MDA含量明显增加，表明细胞内脂质过氧化反应增强，GSH消耗增加或/GSH产生减少。术后第6 d，Gln组PBMC内GSH、MDA水平较术前已无显著差异，而Non-Gln组差异明显。结果提示，补充Gln能维持术后PBMC内GSH正常含量，增强其抗氧化损伤能力。
, 百拇医药
表2 胃肠手术患者PBMC内GSH和MDA水平的变化
Tab 2 The changes of GSH, MDA levels in PBMC from
gastrointestinal surgical patients (
±s)Group
PBMC
GSH level
(nmol/107 cells)
, 百拇医药
MDA level
(nmol/107 cells)
Preoperative
Non-Gln
12.86±3.04
2.39±0.89
Gln
13.37±3.89
3.04±1.06
Postoperative day 1
Non-Gln
, 百拇医药
8.49±3.51*
4.86±1.79**
Gln
7.98±2.91*
5.85±1.40**
Postoperative day 6
Non-Gln
9.19±2.20*
4.23±1.57*
Gln
12.64±3.06＃
4.12±1.28
*P<0.05，**P<0.01,vs preoperative; ＃P<0.05，vs Non-Gln
收稿日期：1998年8月28日
修稿日期：1998年12月18日, 百拇医药