热应激大鼠心肌线粒体功能的变化
作者：钱令嘉 程素琦 吴孟平 陈西京
单位：卫生学环境医学研究所(天津300050)
关键词：热；应激；线粒体；心脏；氧化磷酸化；钙代谢障碍
热应激大鼠心肌线粒体功能的变化 摘 要 目的：观察不同强度热应激大鼠心肌线粒体氧化磷酸化功能和钙储存功能的变化。方法：用Klark氧电极极谱方法测定线粒体氧化代谢功能，用生物发光法测定心室肌ATP含量及线粒体Ca2+-ATP酶活性，用电感藕合等离子体-原子放射光谱仪测定心肌线粒体内钙含量。结果：热应激大鼠心肌线粒体呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR)及氧化磷酸化效率(P/O)均随动物直肠温度的升高逐步显著降低，当大鼠直肠温度超过42℃时，RCR与P/O分别较对照下降31.4%，11.05%。直肠温度42℃以上，大鼠的心室肌ATP含量仅为对照的37.5%。热应激大鼠心肌线粒体Ca2+-A TP酶活性和钙含量亦明显降低，直肠温度42℃以上大鼠的该两项指标可较对照值降低达32.6%和31.3%，显示了线粒体钙代谢的异常变化。结论：热应激机体心肌线粒体的氧化代谢和钙功能受损是热应激时心功能紊乱的重要原因。
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The changes of mitochondrial functions of
myocardium in heat-stressed rats
QIAN Ling-Jia, CHENG Su-Qi, WU Meng-Ping, CHEN Xi-Jing
Institute of Health and Environmental Medicine, Tianjin (300050)
Abstract AIM:To study the changes of mitochondrial oxidative phosphorylation and calcium metabolism of myocardium in heat-stressed rats. METHODS:The mitochondrial oxidative metabolism was analysed by Klark oxygen-electrode polarography; Bioluminescence assay was used to measure ATP content in myocardium and Ca2+-ATPase activity of mitochondria; calcium content in mitochondria was measured by ICP.RESULTS:The respiratory control rate (RCR) and P/O ratio decreased gradually as rectal temperature (Tr) increased. When Tr rosed to >42℃, RCR and P/O ratio decreased by 31.4% and 11.05% (P<0.05) respectively.RCR decrease resulted mainly from the effect of respiratory state Ⅳ.ATP content in myocardium of heat-stressed rats also decreased by 37.5% at Tr>42℃. The activity of Ca2+-ATPase and calcium content in myocardial mitochondria of heat-stressed rats were reduced. When Tr increased to >42℃, both of the above decreased by 32.6% and 31.3% respectively compared with control group.CONCLUSION:The injury of oxidative respiration and Ca2+-metabolism of mitochondria may be one important cause resulting in cardiac-function disorder in heat stress.
, 百拇医药
MeSH Heat; Stress; Mitochondria, heart; Oxidative phosphorylation; Calcium metabolism disorders
线粒体结构的完整和功能的正常对于维持心脏的生理功能有着极其重要的意义[1]。当机体因环境高热或体内代谢障碍而处于热应激状态时，心血管功能可由最初的代偿性增强逐步转变为功能失调，甚至衰竭。对于热应激机体心功能紊乱的发生机制至今尚未有深入的研究。本研究通过对不同强度热应激大鼠心肌线粒体氧化磷酸化功能和钙代谢状态变化的观察，探讨心肌线粒体在热应激心血管功能紊乱发生中的作用，为保护热应激机体心血管功能的研究开拓新思路。
材料与方法
一、热应激动物实验模型复制：
选取200～250 g雄性Wistar大鼠，随机分为5组，其中一组为常温对照组，余均为不同强度热暴露组。大鼠在人工高温箱内进行热暴露。箱内湿度为74%～85%，箱内温度根据实验设计分别调节为36、37、38、39℃。动物热暴露1.5 h后，其直肠温度分别超过39、40、41、42℃(表1)。非热暴露条件下，动物在22～25℃室温下饲养，普食，自由饮水。
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表1 不同热暴露强度下大鼠直肠温度(Tr)的变化
Tab 1 Changes of rectal temperature (Tr) of rats in varying degrees of heat-exposure (
±s)
Group
n
Temp of hot
Chamber (℃)
Tr
Before exposed After exposed
, 百拇医药
Control
14
23.5±0.6
37.4±0.4
37.5±0.4
Heat exposure
Group1
12
36
37.6±0.4
39.6±0.3
Group2
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10
37
37.5±0.5
40.6±0.4
Group3
12
38
37.4±0.3
41.5±0.4
Group4
10
39
37.6±0.4
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42.4±0.5
二、样品制备：
动物热暴露后立即断头处死，并同批处死常温对照组。迅速摘取心脏，剪取心室肌，冲净余血后，部分心肌置于液氮中待测心肌ATP含量，另一部分心肌在4℃条件下，用玻璃匀浆器制备组织匀浆，采用低温分级离心法制备线粒体待用。
三、测定方法：
采用TH-1型数字测温仪(天津卫生学环境医学研究所研制，在各次实验前均由该所实验技术保障研究室以标准温度计校正标定)，测定动物直肠温度；采用klark氧电极极谱方法测定线粒体氧化代谢功能的变化[2]，采用陈克明生物发光法测定心室肌ATP含量[3]，采用酶学发光法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性；并以电感藕合等离子体-原子发射光谱仪测定心肌线粒体内钙含量。 结果
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一、热应激大鼠心肌线粒体氧化代谢功能变化：
表2显示了热应激大鼠心肌线粒体RCR及P/O的变化。当大鼠肛温升达40℃以上时，心室肌线粒体RCR已比对照下降13.5%，仅为6.18±0.17(P<0.05)。直肠温度42℃大鼠RCR比对照下降达31.4%。RCR是呼吸态Ⅲ与呼吸态Ⅳ的比值，对两者的分析结果显示大鼠热应激时心肌线粒体呼吸态Ⅳ的升高是RCR变化的主要原因。热应激大鼠心肌线粒体P/O在大鼠直肠温度达39℃时已显著降低，而至大鼠直肠温度超过42℃时，P/O比对照低11.05%。氧化磷酸化效率与直肠温度呈指数函数曲线相关(Y=2.5-10(-8.8293+0.1969X)，r=0.9782,P<0.05)。
二、热应激大鼠心室肌ATP含量的变化：
热暴露后不同直肠温度的大鼠心室肌ATP含量的变化见图1。直肠温度42℃以上大鼠心室肌ATP含量为0.93 μmol/g 湿重组织，比对照大鼠低62.5%。
, 百拇医药
表2 热应激对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响
Tab 2 Effect of heat-stress on the respiratory function of mitochondria in rat myocardium (
±s)
Group
n
Respiratory
state Ⅲ
Respiratory
state Ⅳ
, 百拇医药
RCR
P/O
Control
10
46.59±1.25
6.40±0.21
7.28±0.18
2.49±0.05
39℃-
8
48.22±1.08
6.86±0.15*
, 百拇医药
7.03±0.25*
2.39±0.08*
40℃-
9
48.51±1.14*
7.85±0.19*
6.18±0.17*
2.33±0.16*
41℃-
9
49.11±1.37*
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8.85±0.18**
5.53±0.18**
2.31±0.14**
42℃-
8
50.05±1.51**
10.02±0.25**
5.00±0.21**
2.24±0.03**
*P<0.05, **P<0.01，vs control group
, 百拇医药
图1 热暴露大鼠心肌ATP含量
Fig 1 ATP content in myocardium of heat exposed rats (
±s，n＝8)*P<0.05, **P<0.01，vs control group
三、热应激大鼠心室肌线粒体钙代谢的变化：
实验结果表明(图2A)，直肠温度39、40、41、42℃以上的大鼠线粒体Ca2+-ATP酶活力分别低于对照14.0%、21.0%，25.5%和32.6%。线粒体内钙含量(图2B)亦随直肠温度升高呈反“S”型下降趋势，并与Ca2+-ATP酶活力呈显著相关关系(Y=-3.21+40.35X, r=-0.885,P<0.05)。
, 百拇医药
图2 热暴露大鼠心肌线粒Ca2+-ATP酶活性和钙含量
Fig 2 Activity of Ca2+-ATPase and calcium content in myocardial mitochondria of heat-exposed rats (
±s，n＝8) *P<0.05, **P<0.01，vs control group
讨论
本实验结果表明，RCR作为反映线粒体结构完整和功能状态的灵敏指标，随着机体热应激强度的增高显著降低，并主要源于呼吸态Ⅳ的明显升高，提示线粒体的完整性受到了破坏。既往一些研究已证实，热应激机体心肌线粒体肿胀，内腔明显扩张，嵴断裂，基质密度降低，是细胞内损伤最重的细胞器[4]。P/O则直接显示线粒体利用物质氧化释放能量转化为ATP的效率。P/O的明显下降表明线粒体中氧化磷酸化解偶联的发生。由此可见，当机体热应激时，心肌线粒体结构和氧化代谢功能受损，这将致使物质氧化产生的能量以热的形式散发，不但使ATP合成严重受阻，而且加剧了机体热应激强度，并使心肌细胞进入氧化应激状态，导致心肌细胞损伤。
, 百拇医药
线粒体膜Ca2+-ATP酶是调节和维持细胞及线粒体内钙稳态的关键因素。热应激大鼠心肌线粒体Ca2+-ATP酶活力显著下降，使线粒体对胞浆内Ca2+的重摄取能力随之降低，线粒体内Ca2+含量减少，而当热应激强度超过一定限量后，可能因线粒体膜的破损导致线粒体内Ca2+含量的反升，线粒体钙代谢紊乱，对细胞内钙稳态的维持有着重要作用的Ca2+隔离保护能力丧失，致使心肌细胞出现Ca2+超载。一些研究证实，机体高热可使细胞膜的流动性改变，以致膜结合蛋白的构象及生物功能受到影响[5]。Ca2+-ATP酶活力下降可能正是膜受热损伤的直接后果之一；线粒体ATP合成的减少对于Ca2+-ATP活性亦有着不可忽视的负性影响。线粒体钙代谢紊乱将会进一步促使氧化磷酸化方向改变，加剧氧化磷酸化解偶联，[6]，并可能过度激活一系列胞内Ca2+依赖性蛋白激酶，导致线粒体以及心肌细胞受到更加严重的损伤，甚至细胞凋亡[7]。
, 百拇医药
参考文献
1 Bers DM.Ca2+ regulation in cardiac muscle. Med Sci Sport Exerc, 1991, 23(12):1157.
2 Rouslin W.Effects of acidosis and ATP depletion on cardiac muscle electron transfer complex I. J Mol Cell Cardiol, 1991, 23:1127.
3 陈克明.生物发光和化学发光分析技术.第1版.上海：第二军医大学出版社，1990.85.
4 Laszlo A. The effects of hyperthermia on mammaliam cell structure and function. Cell Prolif，1992, 25:59.
, 百拇医药
5 Yatvin MB, Cramp WA. Role of cellular membranes in hyperthermia, some observation and theories reviewed. Int J Hyperthermia, 1993, 9(2):165.
6 Trump BJ, Berezesdy CR. Calcium-mediated cell injury and cell death. FASEB J, 1995, 9:219.
7 Petit PX, Susin SA, Zamzami N, et al. Mitochondria and programmed cell death: back to the future. FEBS Lett, 1996, 396:7.
1997年10月16日收稿，1998年3月30日修回, 百拇医药
单位：卫生学环境医学研究所(天津300050)
关键词：热；应激；线粒体；心脏；氧化磷酸化；钙代谢障碍
热应激大鼠心肌线粒体功能的变化 摘 要 目的：观察不同强度热应激大鼠心肌线粒体氧化磷酸化功能和钙储存功能的变化。方法：用Klark氧电极极谱方法测定线粒体氧化代谢功能，用生物发光法测定心室肌ATP含量及线粒体Ca2+-ATP酶活性，用电感藕合等离子体-原子放射光谱仪测定心肌线粒体内钙含量。结果：热应激大鼠心肌线粒体呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR)及氧化磷酸化效率(P/O)均随动物直肠温度的升高逐步显著降低，当大鼠直肠温度超过42℃时，RCR与P/O分别较对照下降31.4%，11.05%。直肠温度42℃以上，大鼠的心室肌ATP含量仅为对照的37.5%。热应激大鼠心肌线粒体Ca2+-A TP酶活性和钙含量亦明显降低，直肠温度42℃以上大鼠的该两项指标可较对照值降低达32.6%和31.3%，显示了线粒体钙代谢的异常变化。结论：热应激机体心肌线粒体的氧化代谢和钙功能受损是热应激时心功能紊乱的重要原因。
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The changes of mitochondrial functions of
myocardium in heat-stressed rats
QIAN Ling-Jia, CHENG Su-Qi, WU Meng-Ping, CHEN Xi-Jing
Institute of Health and Environmental Medicine, Tianjin (300050)
Abstract AIM:To study the changes of mitochondrial oxidative phosphorylation and calcium metabolism of myocardium in heat-stressed rats. METHODS:The mitochondrial oxidative metabolism was analysed by Klark oxygen-electrode polarography; Bioluminescence assay was used to measure ATP content in myocardium and Ca2+-ATPase activity of mitochondria; calcium content in mitochondria was measured by ICP.RESULTS:The respiratory control rate (RCR) and P/O ratio decreased gradually as rectal temperature (Tr) increased. When Tr rosed to >42℃, RCR and P/O ratio decreased by 31.4% and 11.05% (P<0.05) respectively.RCR decrease resulted mainly from the effect of respiratory state Ⅳ.ATP content in myocardium of heat-stressed rats also decreased by 37.5% at Tr>42℃. The activity of Ca2+-ATPase and calcium content in myocardial mitochondria of heat-stressed rats were reduced. When Tr increased to >42℃, both of the above decreased by 32.6% and 31.3% respectively compared with control group.CONCLUSION:The injury of oxidative respiration and Ca2+-metabolism of mitochondria may be one important cause resulting in cardiac-function disorder in heat stress.
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MeSH Heat; Stress; Mitochondria, heart; Oxidative phosphorylation; Calcium metabolism disorders
线粒体结构的完整和功能的正常对于维持心脏的生理功能有着极其重要的意义[1]。当机体因环境高热或体内代谢障碍而处于热应激状态时，心血管功能可由最初的代偿性增强逐步转变为功能失调，甚至衰竭。对于热应激机体心功能紊乱的发生机制至今尚未有深入的研究。本研究通过对不同强度热应激大鼠心肌线粒体氧化磷酸化功能和钙代谢状态变化的观察，探讨心肌线粒体在热应激心血管功能紊乱发生中的作用，为保护热应激机体心血管功能的研究开拓新思路。
材料与方法
一、热应激动物实验模型复制：
选取200～250 g雄性Wistar大鼠，随机分为5组，其中一组为常温对照组，余均为不同强度热暴露组。大鼠在人工高温箱内进行热暴露。箱内湿度为74%～85%，箱内温度根据实验设计分别调节为36、37、38、39℃。动物热暴露1.5 h后，其直肠温度分别超过39、40、41、42℃(表1)。非热暴露条件下，动物在22～25℃室温下饲养，普食，自由饮水。
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表1 不同热暴露强度下大鼠直肠温度(Tr)的变化
Tab 1 Changes of rectal temperature (Tr) of rats in varying degrees of heat-exposure (
±s)Group
n
Temp of hot
Chamber (℃)
Tr
Before exposed After exposed
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Control
14
23.5±0.6
37.4±0.4
37.5±0.4
Heat exposure
Group1
12
36
37.6±0.4
39.6±0.3
Group2
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10
37
37.5±0.5
40.6±0.4
Group3
12
38
37.4±0.3
41.5±0.4
Group4
10
39
37.6±0.4
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42.4±0.5
二、样品制备：
动物热暴露后立即断头处死，并同批处死常温对照组。迅速摘取心脏，剪取心室肌，冲净余血后，部分心肌置于液氮中待测心肌ATP含量，另一部分心肌在4℃条件下，用玻璃匀浆器制备组织匀浆，采用低温分级离心法制备线粒体待用。
三、测定方法：
采用TH-1型数字测温仪(天津卫生学环境医学研究所研制，在各次实验前均由该所实验技术保障研究室以标准温度计校正标定)，测定动物直肠温度；采用klark氧电极极谱方法测定线粒体氧化代谢功能的变化[2]，采用陈克明生物发光法测定心室肌ATP含量[3]，采用酶学发光法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性；并以电感藕合等离子体-原子发射光谱仪测定心肌线粒体内钙含量。 结果
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一、热应激大鼠心肌线粒体氧化代谢功能变化：
表2显示了热应激大鼠心肌线粒体RCR及P/O的变化。当大鼠肛温升达40℃以上时，心室肌线粒体RCR已比对照下降13.5%，仅为6.18±0.17(P<0.05)。直肠温度42℃大鼠RCR比对照下降达31.4%。RCR是呼吸态Ⅲ与呼吸态Ⅳ的比值，对两者的分析结果显示大鼠热应激时心肌线粒体呼吸态Ⅳ的升高是RCR变化的主要原因。热应激大鼠心肌线粒体P/O在大鼠直肠温度达39℃时已显著降低，而至大鼠直肠温度超过42℃时，P/O比对照低11.05%。氧化磷酸化效率与直肠温度呈指数函数曲线相关(Y=2.5-10(-8.8293+0.1969X)，r=0.9782,P<0.05)。
二、热应激大鼠心室肌ATP含量的变化：
热暴露后不同直肠温度的大鼠心室肌ATP含量的变化见图1。直肠温度42℃以上大鼠心室肌ATP含量为0.93 μmol/g 湿重组织，比对照大鼠低62.5%。
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表2 热应激对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响
Tab 2 Effect of heat-stress on the respiratory function of mitochondria in rat myocardium (
±s)Group
n
Respiratory
state Ⅲ
Respiratory
state Ⅳ
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RCR
P/O
Control
10
46.59±1.25
6.40±0.21
7.28±0.18
2.49±0.05
39℃-
8
48.22±1.08
6.86±0.15*
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7.03±0.25*
2.39±0.08*
40℃-
9
48.51±1.14*
7.85±0.19*
6.18±0.17*
2.33±0.16*
41℃-
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49.11±1.37*
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5.53±0.18**
2.31±0.14**
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8
50.05±1.51**
10.02±0.25**
5.00±0.21**
2.24±0.03**
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图1 热暴露大鼠心肌ATP含量
Fig 1 ATP content in myocardium of heat exposed rats (
±s，n＝8)*P<0.05, **P<0.01，vs control group三、热应激大鼠心室肌线粒体钙代谢的变化：
实验结果表明(图2A)，直肠温度39、40、41、42℃以上的大鼠线粒体Ca2+-ATP酶活力分别低于对照14.0%、21.0%，25.5%和32.6%。线粒体内钙含量(图2B)亦随直肠温度升高呈反“S”型下降趋势，并与Ca2+-ATP酶活力呈显著相关关系(Y=-3.21+40.35X, r=-0.885,P<0.05)。
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图2 热暴露大鼠心肌线粒Ca2+-ATP酶活性和钙含量
Fig 2 Activity of Ca2+-ATPase and calcium content in myocardial mitochondria of heat-exposed rats (
±s，n＝8) *P<0.05, **P<0.01，vs control group讨论
本实验结果表明，RCR作为反映线粒体结构完整和功能状态的灵敏指标，随着机体热应激强度的增高显著降低，并主要源于呼吸态Ⅳ的明显升高，提示线粒体的完整性受到了破坏。既往一些研究已证实，热应激机体心肌线粒体肿胀，内腔明显扩张，嵴断裂，基质密度降低，是细胞内损伤最重的细胞器[4]。P/O则直接显示线粒体利用物质氧化释放能量转化为ATP的效率。P/O的明显下降表明线粒体中氧化磷酸化解偶联的发生。由此可见，当机体热应激时，心肌线粒体结构和氧化代谢功能受损，这将致使物质氧化产生的能量以热的形式散发，不但使ATP合成严重受阻，而且加剧了机体热应激强度，并使心肌细胞进入氧化应激状态，导致心肌细胞损伤。
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线粒体膜Ca2+-ATP酶是调节和维持细胞及线粒体内钙稳态的关键因素。热应激大鼠心肌线粒体Ca2+-ATP酶活力显著下降，使线粒体对胞浆内Ca2+的重摄取能力随之降低，线粒体内Ca2+含量减少，而当热应激强度超过一定限量后，可能因线粒体膜的破损导致线粒体内Ca2+含量的反升，线粒体钙代谢紊乱，对细胞内钙稳态的维持有着重要作用的Ca2+隔离保护能力丧失，致使心肌细胞出现Ca2+超载。一些研究证实，机体高热可使细胞膜的流动性改变，以致膜结合蛋白的构象及生物功能受到影响[5]。Ca2+-ATP酶活力下降可能正是膜受热损伤的直接后果之一；线粒体ATP合成的减少对于Ca2+-ATP活性亦有着不可忽视的负性影响。线粒体钙代谢紊乱将会进一步促使氧化磷酸化方向改变，加剧氧化磷酸化解偶联，[6]，并可能过度激活一系列胞内Ca2+依赖性蛋白激酶，导致线粒体以及心肌细胞受到更加严重的损伤，甚至细胞凋亡[7]。
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参考文献
1 Bers DM.Ca2+ regulation in cardiac muscle. Med Sci Sport Exerc, 1991, 23(12):1157.
2 Rouslin W.Effects of acidosis and ATP depletion on cardiac muscle electron transfer complex I. J Mol Cell Cardiol, 1991, 23:1127.
3 陈克明.生物发光和化学发光分析技术.第1版.上海：第二军医大学出版社，1990.85.
4 Laszlo A. The effects of hyperthermia on mammaliam cell structure and function. Cell Prolif，1992, 25:59.
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5 Yatvin MB, Cramp WA. Role of cellular membranes in hyperthermia, some observation and theories reviewed. Int J Hyperthermia, 1993, 9(2):165.
6 Trump BJ, Berezesdy CR. Calcium-mediated cell injury and cell death. FASEB J, 1995, 9:219.
7 Petit PX, Susin SA, Zamzami N, et al. Mitochondria and programmed cell death: back to the future. FEBS Lett, 1996, 396:7.
1997年10月16日收稿，1998年3月30日修回, 百拇医药