精-甘-天冬-丝氨酸四肽对大鼠主动脉内皮剥脱术后血小板活化的影响
作者：姚兴海 王培勇 苏静怡 唐朝枢 杨利 杜爱萍
单位：
姚兴海 王培勇 苏静怡 唐朝枢 北京医科大学 心血管基础研究所；杨利 北京医科大学中西医结合教研室；杜爱萍 北京医科大学病理学系(北京 100083)
关键词：肽类；血小板聚集；蛋白激酶C；腺苷环一磷酸
中国病理生理杂志990418 摘要 目的和方法：在大鼠主动脉球囊内皮剥脱模型上，于术后3、10、21 d观察在体和体外孵育血小板活化及应用血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)肽对其活化的影响。结果：球囊剥脱术后大鼠的血小板聚集明显增强，蛋白激酶C(PKC)活性明显增高，环磷酸腺苷(cAMP)活性明显降低，血小板膜活化的GPⅡb/Ⅲa受体密度明显增高，均以3 d组最为明显。应用RGDS肽体外孵育，可明显逆转上述改变。结论：血小板膜活化的GPⅡb/Ⅲa受体的变化，可能是内皮剥脱时介导血小板活化的关键途径。
, 百拇医药
Effect of Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) peptide on platelet activation after balloon angioplasty in rat aorta
YAO Xing-Hai,YANG Li,WANG Pei-Yong,DU Ai-Ping,SU Jing-Yi,TANG Chao-Shu
Institute of Cardiovascular Basic Research，Beijing Medical University,Beijing(100083)
Abstract AIM and METHOD:The present study observed the effect of balloon angioplasty and RGDS peptide,the antagonist of platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa receptor,on platelet activation in vivo and in vitro at 3，10 and 21 days after endothelial denudation with balloon.RESULTS: Platelet aggregation,protein kinase C(PKC) activity and platelet GPⅡb/Ⅲa receptor density are obviously enhanced, while cyclic monophosphate(cAMP) activity is decreased after balloon angioplasty.The most prominent changes occurred on the third day.When platelets were incubated together with 100μmol/L RGDS peptide it was found that RGDS peptide obviously counteracted the above changes.CONCLUSION:The changes of platelet GPⅡb/Ⅲa receptor might be the key pathway of endothelial denudation on platelet stimulation.
, 百拇医药
MeSH Peptides;Platelet aggregation;Protein kinase C;Adenosine cyclic monophosphate
经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是冠心病治疗的有效措施，但病人术后可能发生血栓形成和血管再狭窄等并发症，其发生机理尚未完全阐明。临床和实验资料表明，活化血小板起了关键作用[1]，它不仅能触发凝血过程，而且可以通过释放凝血酶、血栓素和生长因子等介质，促使新生内膜增殖，发生再狭窄。Tcheng等报道[2]应用血小板膜的纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)结合受体-糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/Ⅲa受体的单克隆抗体，临床实验有效防治PTCA术后再狭窄的发生。但是受损伤的血管激活血小板及阻断GPⅡb/Ⅲa受体对其活化影响细胞分子机制，目前尚不清楚。本工作在大鼠主动脉球囊内皮剥脱模型上，观察术后不同时期的血小板在体和体外孵育的血小板活化和细胞蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性的变化，并观察应用血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂精-苷-天冬-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)肽的抑制作用。以认识阻断血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体防治再狭窄的作用机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、大鼠主动脉球囊内皮剥脱术[3]：
300～350 g雄性Wistar大鼠，0.6%戊巴比妥钠(50 mg/kg,ip)麻醉，将改良的2F Forgarty球囊导管从左颈总动脉插入至腹主动脉远端，充盈球囊后，在不同方向反复抽拉3次，剥脱主动脉内皮。假手术组除不插入导管外，其余操作同剥脱组。
二、血小板血浆制备：
将假手术及球囊剥脱术后3、10、21 d的大鼠(每组各5只)在乌拉坦(1.0 g/kg，ip)麻醉下，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，离心分别制备贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP,3500 r/min， 15 min)和富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP，1000 r/min， 15 min)，后者调至5×108 platelets/mL。
, 百拇医药
三、血小板与血管条孵育：
摘取假手术组和剥脱3、10、21 d各组大鼠主动脉血管条20 mg，分别置于灌流浴槽，内盛从健康大鼠制备的PRP 4 ml。每只动物血管浴槽分别为不含RGDS(生理盐水)和含有RGDS(0.1mmol/L)两管。37℃、体积分数为95%O2-5%CO2平衡下孵育60 min。
四、血小板聚集及血浆纤维蛋白原含量测定：
取上述各组动物PRP及离体血管孵育的PRP各200 μL，37℃预孵育1 min后，分别加入ADP 50μmol/L，孵育5 min。以PPP作对照管，按比浊法测定血小板聚集。亚硫酸钠法测定血浆Fg含量。
五、蛋白激酶C活性测定[4]：
, 百拇医药 取上述各组动物和离体孵育的PRP各20μL，加80μL测定液[mmol/L：Tris/HCl(pH 7.5)20,[32P]-ATP(18.5kBq)0.0125，Mg(NO3)26.25，CaCl2 1.25)，PS(Phosphatidylserine)12.5 mg/L，PKC底物蛋白62.5 mg/L],30℃孵育5 min，加终止液(25% TCA液于2 mol/L乙酸中)100 μL终止反应，取30 μL点于P81ion exchange chromatographic paper上，75 mmol/L磷酸冲洗，凉干，加闪烁液，在液闪计数仪上测[32P]放射活性。同时作不加样品的空白对照管，实验管与空白管[32P]掺入的差值表示PKC活性(pmol/5×108platelets.min-1).
, 百拇医药
六、cAMP活性测定[5]：
取上述各组动物的PRP和离体孵育的PRP各3 mL，离心、低渗液洗脱去除残存红细胞，收集的血小板经过氯酸和KOH处理后，按试剂盒说明书以放射免疫法测定血小板cAMP含量。
七、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体免疫组织化学染色：
将洗涤后的上述各组血小板悬液滴加于明胶处理过的载片上，室温下静置30 min,4%多聚甲醛固定(4℃ 1h)后，采用间接法行常规免疫组织化学染色，所用抗体为一抗(抗CDW41)，二抗(兔抗鼠IgG1:1000稀释)。以TBS替代一抗作为空白对照。Leica 4550 IW图象分析仪，进行图象灰度扫描分析，每组以100个血小板的积分光密度作为定量指标。
八、材料：
, 百拇医药
Wistar大鼠由本校实验动物部提供；[γ-32P]-ATP(比活性111TBq/mmol)购自Du Pont NEN;RGDS肽、PKC底物蛋白、phosphatidylserine 等为Sigma Co.产品；cAMP放免药盒购自上海中医药大学；CDW41抗体及二抗购自军事医学科学院邦定公司；余为市售分析纯试剂。
九、统计处理：
实验数据以均数±标准差(
±s)表示，用One-Way analysis of ANOVA 方法，组间q检验作统计学处理。
结果
一、球囊剥脱术对血小板的影响：
, http://www.100md.com
本实验所制备的大鼠PRP中Fg含量为3.0±0.15 mg/L。球囊剥脱术后大鼠的血小板聚集明显高于假手术组，PKC活性明显高于假手术组，血小板着色颗粒的积分光密度明显高于假手术组，而cAMP活性明显低于假手术组。本实验3 d组最严重，但是术后21 d仍未恢复到对照水平(P<0.05)。结果见表1所示。
二、离体孵育球囊剥脱的大鼠主动脉条对血小板的影响：
内皮剥脱组血小板聚集明显强于假手术组，PKC活性明显高于假手术组，血小板着色颗粒的积分光密度明显高于假手术组。cAMP活性明显低于假手术组。应用RGDS肽，可明显逆转上述改变。结果见表2及图1所示。
表1 大鼠主动脉球囊剥脱术对血小板活化的影响
Tab 1 Effect of balloon angioplasty on platelet activation in rat aorta(
±s，n=5) Group
, 百拇医药
Sham
Endothelial denudation
3 d
10 d
21 d
Platelets
aggregation(%)
57.20±2.59
69.90±2.70**
64.60±2.97**
61.20±3.03*
, http://www.100md.com
PKC activity
(mmol/5×108 platelets)
0.48±0.09
1.17±3.23**
1.11±0.19**
0.82±0.12*
cAMP content
(pmol/5×108 platelets)
21.39±1.86
11.51±1.82**
, 百拇医药
15.67±2.01**
18.33±2.28*
GPⅡb/Ⅲa
Staining(I.O.D.)
5.80±1.64
27.43±2.78**
25.58±2.14**
18.83±2.95**
*P<0.05，**P<0.01， vs sham group表2 RGDS 肽对离体孵育球囊剥脱大鼠主动脉条刺激血小板活化的影响
, http://www.100md.com
Tab 2 Effect of RGDS peptide on platelet activation after balloon angioplasty of isolated rat aorta(
±s，n=5) Group
Sham
Endothelial denudation
Endothelial denudation+RGDS
3 d
10 d
21 d
3 d
, 百拇医药
10 d
21 d
Platelet
aggregation(%)
60.00±3.87
78.00±2.74**
69.80±2.59**
67.00±3.54**
70.40±4.04＃＃
63.20±3.96＃
, 百拇医药
61.00±3.81＃
PKC activity
(mmol/5×108 platelets)
1.15±0.16
2.93±0.28**
2.33±0.19**
2.31±0.16**
1.87±0.18＃＃
1.56±0.18＃＃
, 百拇医药
1.58±0.18＃＃
cAMP content
(pmol/5×108platelets)
18.92±2.39
7.53±1.76**
11.64±1.87**
13.07±1.41**
10.37±1.68＃
15.67±3.20＃
, 百拇医药
17.75±1.74＃
GPⅡb/Ⅲa
Staining(I.O.D.)
7.32±1.46
41.93±3.61**
36.68±5.14**
32.71±5.66**
14.63±3.32＃＃
11.13±2.83＃＃
9.67±3.14＃＃
, 百拇医药
**P<0.01， vs sham group; ＃ P<0.05，＃＃ P<0.01，vs endothelial denudation group
Fig 1 Effect of RGDS peptide on platelet GP Ⅱ b/Ⅲ a receptor density after balloon angioplasty if of isolated rat aorta(×40)
(a)Sham; (b)3 d after angioplasty; (c) 3 d after angioplasty+RGDS
, http://www.100md.com
图1 RGDS肽对球囊剥脱大鼠主动脉条刺激血小板活化GP Ⅱ b/Ⅲ a受体密度的影响
讨论
PTCA术后血小板活化，聚集增强，cAMP活性降低，PKC活性增高，血小板活化的GPⅡb/Ⅲ a受体密度增高，这些变化持续较久，体外实验证明损伤血管对血小板有直接作用，结果一致。这些变化是血小板与损伤管壁相互作用和/或管壁释放某些物质的结果。提示，临床较长时间应用抗栓剂是必要的。
活化血小板的聚集增强，可引起血栓的形成，导致再狭窄的发生。血小板PKC活性增高，可使血小板中蛋白质P47磷酸化，使血小板骨架重组，以利于释放反应；并可修饰血小板膜上GP Ⅱb/Ⅲa受体，使之易与Fg结合，促进血小板聚集[6]；cAMP活性降低可导致细胞内Ca2+浓度增高，引起血小板的变形、聚集和释放反应。血小板模活化的GP Ⅱb/Ⅲa 受体的密度增加，可增强血小板的活化程度，促进聚集和释放反应等。
, 百拇医药
RGDS肽为血浆FgAα链95-98和572-575位上的氨基酸残基，是血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体的配基。我们曾报道，RGDS肽具有抗栓[7]、抗血管平滑肌细胞增殖[8]及抗GPⅡb/Ⅲa受体磷酸化的作用[9]。本工作的体外孵育实验结果发现RGDS肽可直接抑制损伤血管对血小板的促聚集作用，增加cAMP活性、降低PKC活性、降低活化的GPⅡb/Ⅲa受体密度。表明应用RGDS肽抗血小板GPⅡb/Ⅲa治疗，能有效的降低血小板活化。提示，血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体的活化可能是介导内皮剥脱血管刺激血小板的关键途径。
参考文献
1 Slepian MJ,Massia SP,Tucson VA-U，et al.Local delivery of a cyclic RGD peptide inhibits neointimal hyperplasia following balloon injury.Circulation,1993,88:Part2 I 372.
, 百拇医药
2 Tcheng JE,Ellis SG,George BS,et al.Pharmacodynamics of chimeric glycoprotein Ⅱb/Ⅲa integrin antiplatelet antibody Fab 7E3 in high-risk coronary angioplasty.Circulation,1994,90:1757.
3 Block PC,Baughman KL,Pasternak RC,et al.Transluminal angioplasty:correlation of morphologic and angiographic fidings in an experimental model.Circulation,1980,61:778.
4 Ikeda M,Onda T,Tomita I,et al.The differences in Ca2+-sensitivity of protein kinase C in platelets from Wistar Kyoto rat and stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Thromb Res,1996,82(5):417.
, 百拇医药
5 张夏英，任淑卿，熊 军，等.一种灵敏的血小板内环磷酸腺苷(cAMP)测定法.中华心血管病杂志，1980，82：142.
6 Jackson SP,Yan Y, Schoenwaelder SM,et al.Role of the platelet integrin glycoproptein Ⅱb/Ⅲa in intracellular signalling.Thromb Res,1993,71:159.
7 姚兴海，付爱华，汤 健，等.肽6A与RGDS肽对大鼠颈总动脉血栓形成的影响.北京医科大学学报，1994，26：17.
8 凌世长，姚兴海，付爱华，等.RGDS肽对大鼠主动脉球囊内皮剥脱后血管壁增殖的影响.中国应用生理学杂志，1994，10：229.
9 姚兴海，王培勇，庞永政，等.精-甘-天冬-丝氨酸四肽对ADP诱导大鼠血小板活化的信号转导的影响.生理学报，1998，50：121.
1997年10月20日收稿，1998年4月6日修回, http://www.100md.com
单位：
姚兴海 王培勇 苏静怡 唐朝枢 北京医科大学 心血管基础研究所；杨利 北京医科大学中西医结合教研室；杜爱萍 北京医科大学病理学系(北京 100083)
关键词：肽类；血小板聚集；蛋白激酶C；腺苷环一磷酸
中国病理生理杂志990418 摘要 目的和方法：在大鼠主动脉球囊内皮剥脱模型上，于术后3、10、21 d观察在体和体外孵育血小板活化及应用血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)肽对其活化的影响。结果：球囊剥脱术后大鼠的血小板聚集明显增强，蛋白激酶C(PKC)活性明显增高，环磷酸腺苷(cAMP)活性明显降低，血小板膜活化的GPⅡb/Ⅲa受体密度明显增高，均以3 d组最为明显。应用RGDS肽体外孵育，可明显逆转上述改变。结论：血小板膜活化的GPⅡb/Ⅲa受体的变化，可能是内皮剥脱时介导血小板活化的关键途径。
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Effect of Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) peptide on platelet activation after balloon angioplasty in rat aorta
YAO Xing-Hai,YANG Li,WANG Pei-Yong,DU Ai-Ping,SU Jing-Yi,TANG Chao-Shu
Institute of Cardiovascular Basic Research，Beijing Medical University,Beijing(100083)
Abstract AIM and METHOD:The present study observed the effect of balloon angioplasty and RGDS peptide,the antagonist of platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa receptor,on platelet activation in vivo and in vitro at 3，10 and 21 days after endothelial denudation with balloon.RESULTS: Platelet aggregation,protein kinase C(PKC) activity and platelet GPⅡb/Ⅲa receptor density are obviously enhanced, while cyclic monophosphate(cAMP) activity is decreased after balloon angioplasty.The most prominent changes occurred on the third day.When platelets were incubated together with 100μmol/L RGDS peptide it was found that RGDS peptide obviously counteracted the above changes.CONCLUSION:The changes of platelet GPⅡb/Ⅲa receptor might be the key pathway of endothelial denudation on platelet stimulation.
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MeSH Peptides;Platelet aggregation;Protein kinase C;Adenosine cyclic monophosphate
经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是冠心病治疗的有效措施，但病人术后可能发生血栓形成和血管再狭窄等并发症，其发生机理尚未完全阐明。临床和实验资料表明，活化血小板起了关键作用[1]，它不仅能触发凝血过程，而且可以通过释放凝血酶、血栓素和生长因子等介质，促使新生内膜增殖，发生再狭窄。Tcheng等报道[2]应用血小板膜的纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)结合受体-糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/Ⅲa受体的单克隆抗体，临床实验有效防治PTCA术后再狭窄的发生。但是受损伤的血管激活血小板及阻断GPⅡb/Ⅲa受体对其活化影响细胞分子机制，目前尚不清楚。本工作在大鼠主动脉球囊内皮剥脱模型上，观察术后不同时期的血小板在体和体外孵育的血小板活化和细胞蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性的变化，并观察应用血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂精-苷-天冬-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)肽的抑制作用。以认识阻断血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体防治再狭窄的作用机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、大鼠主动脉球囊内皮剥脱术[3]：
300～350 g雄性Wistar大鼠，0.6%戊巴比妥钠(50 mg/kg,ip)麻醉，将改良的2F Forgarty球囊导管从左颈总动脉插入至腹主动脉远端，充盈球囊后，在不同方向反复抽拉3次，剥脱主动脉内皮。假手术组除不插入导管外，其余操作同剥脱组。
二、血小板血浆制备：
将假手术及球囊剥脱术后3、10、21 d的大鼠(每组各5只)在乌拉坦(1.0 g/kg，ip)麻醉下，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，离心分别制备贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP,3500 r/min， 15 min)和富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP，1000 r/min， 15 min)，后者调至5×108 platelets/mL。
, 百拇医药
三、血小板与血管条孵育：
摘取假手术组和剥脱3、10、21 d各组大鼠主动脉血管条20 mg，分别置于灌流浴槽，内盛从健康大鼠制备的PRP 4 ml。每只动物血管浴槽分别为不含RGDS(生理盐水)和含有RGDS(0.1mmol/L)两管。37℃、体积分数为95%O2-5%CO2平衡下孵育60 min。
四、血小板聚集及血浆纤维蛋白原含量测定：
取上述各组动物PRP及离体血管孵育的PRP各200 μL，37℃预孵育1 min后，分别加入ADP 50μmol/L，孵育5 min。以PPP作对照管，按比浊法测定血小板聚集。亚硫酸钠法测定血浆Fg含量。
五、蛋白激酶C活性测定[4]：
, 百拇医药 取上述各组动物和离体孵育的PRP各20μL，加80μL测定液[mmol/L：Tris/HCl(pH 7.5)20,[32P]-ATP(18.5kBq)0.0125，Mg(NO3)26.25，CaCl2 1.25)，PS(Phosphatidylserine)12.5 mg/L，PKC底物蛋白62.5 mg/L],30℃孵育5 min，加终止液(25% TCA液于2 mol/L乙酸中)100 μL终止反应，取30 μL点于P81ion exchange chromatographic paper上，75 mmol/L磷酸冲洗，凉干，加闪烁液，在液闪计数仪上测[32P]放射活性。同时作不加样品的空白对照管，实验管与空白管[32P]掺入的差值表示PKC活性(pmol/5×108platelets.min-1).
, 百拇医药
六、cAMP活性测定[5]：
取上述各组动物的PRP和离体孵育的PRP各3 mL，离心、低渗液洗脱去除残存红细胞，收集的血小板经过氯酸和KOH处理后，按试剂盒说明书以放射免疫法测定血小板cAMP含量。
七、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体免疫组织化学染色：
将洗涤后的上述各组血小板悬液滴加于明胶处理过的载片上，室温下静置30 min,4%多聚甲醛固定(4℃ 1h)后，采用间接法行常规免疫组织化学染色，所用抗体为一抗(抗CDW41)，二抗(兔抗鼠IgG1:1000稀释)。以TBS替代一抗作为空白对照。Leica 4550 IW图象分析仪，进行图象灰度扫描分析，每组以100个血小板的积分光密度作为定量指标。
八、材料：
, 百拇医药
Wistar大鼠由本校实验动物部提供；[γ-32P]-ATP(比活性111TBq/mmol)购自Du Pont NEN;RGDS肽、PKC底物蛋白、phosphatidylserine 等为Sigma Co.产品；cAMP放免药盒购自上海中医药大学；CDW41抗体及二抗购自军事医学科学院邦定公司；余为市售分析纯试剂。
九、统计处理：
实验数据以均数±标准差(
±s)表示，用One-Way analysis of ANOVA 方法，组间q检验作统计学处理。结果
一、球囊剥脱术对血小板的影响：
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本实验所制备的大鼠PRP中Fg含量为3.0±0.15 mg/L。球囊剥脱术后大鼠的血小板聚集明显高于假手术组，PKC活性明显高于假手术组，血小板着色颗粒的积分光密度明显高于假手术组，而cAMP活性明显低于假手术组。本实验3 d组最严重，但是术后21 d仍未恢复到对照水平(P<0.05)。结果见表1所示。
二、离体孵育球囊剥脱的大鼠主动脉条对血小板的影响：
内皮剥脱组血小板聚集明显强于假手术组，PKC活性明显高于假手术组，血小板着色颗粒的积分光密度明显高于假手术组。cAMP活性明显低于假手术组。应用RGDS肽，可明显逆转上述改变。结果见表2及图1所示。
表1 大鼠主动脉球囊剥脱术对血小板活化的影响
Tab 1 Effect of balloon angioplasty on platelet activation in rat aorta(
±s，n=5) Group, 百拇医药
Sham
Endothelial denudation
3 d
10 d
21 d
Platelets
aggregation(%)
57.20±2.59
69.90±2.70**
64.60±2.97**
61.20±3.03*
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PKC activity
(mmol/5×108 platelets)
0.48±0.09
1.17±3.23**
1.11±0.19**
0.82±0.12*
cAMP content
(pmol/5×108 platelets)
21.39±1.86
11.51±1.82**
, 百拇医药
15.67±2.01**
18.33±2.28*
GPⅡb/Ⅲa
Staining(I.O.D.)
5.80±1.64
27.43±2.78**
25.58±2.14**
18.83±2.95**
*P<0.05，**P<0.01， vs sham group表2 RGDS 肽对离体孵育球囊剥脱大鼠主动脉条刺激血小板活化的影响
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Tab 2 Effect of RGDS peptide on platelet activation after balloon angioplasty of isolated rat aorta(
±s，n=5) GroupSham
Endothelial denudation
Endothelial denudation+RGDS
3 d
10 d
21 d
3 d
, 百拇医药
10 d
21 d
Platelet
aggregation(%)
60.00±3.87
78.00±2.74**
69.80±2.59**
67.00±3.54**
70.40±4.04＃＃
63.20±3.96＃
, 百拇医药
61.00±3.81＃
PKC activity
(mmol/5×108 platelets)
1.15±0.16
2.93±0.28**
2.33±0.19**
2.31±0.16**
1.87±0.18＃＃
1.56±0.18＃＃
, 百拇医药
1.58±0.18＃＃
cAMP content
(pmol/5×108platelets)
18.92±2.39
7.53±1.76**
11.64±1.87**
13.07±1.41**
10.37±1.68＃
15.67±3.20＃
, 百拇医药
17.75±1.74＃
GPⅡb/Ⅲa
Staining(I.O.D.)
7.32±1.46
41.93±3.61**
36.68±5.14**
32.71±5.66**
14.63±3.32＃＃
11.13±2.83＃＃
9.67±3.14＃＃
, 百拇医药
**P<0.01， vs sham group; ＃ P<0.05，＃＃ P<0.01，vs endothelial denudation group
Fig 1 Effect of RGDS peptide on platelet GP Ⅱ b/Ⅲ a receptor density after balloon angioplasty if of isolated rat aorta(×40)
(a)Sham; (b)3 d after angioplasty; (c) 3 d after angioplasty+RGDS
, http://www.100md.com
图1 RGDS肽对球囊剥脱大鼠主动脉条刺激血小板活化GP Ⅱ b/Ⅲ a受体密度的影响
讨论
PTCA术后血小板活化，聚集增强，cAMP活性降低，PKC活性增高，血小板活化的GPⅡb/Ⅲ a受体密度增高，这些变化持续较久，体外实验证明损伤血管对血小板有直接作用，结果一致。这些变化是血小板与损伤管壁相互作用和/或管壁释放某些物质的结果。提示，临床较长时间应用抗栓剂是必要的。
活化血小板的聚集增强，可引起血栓的形成，导致再狭窄的发生。血小板PKC活性增高，可使血小板中蛋白质P47磷酸化，使血小板骨架重组，以利于释放反应；并可修饰血小板膜上GP Ⅱb/Ⅲa受体，使之易与Fg结合，促进血小板聚集[6]；cAMP活性降低可导致细胞内Ca2+浓度增高，引起血小板的变形、聚集和释放反应。血小板模活化的GP Ⅱb/Ⅲa 受体的密度增加，可增强血小板的活化程度，促进聚集和释放反应等。
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RGDS肽为血浆FgAα链95-98和572-575位上的氨基酸残基，是血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体的配基。我们曾报道，RGDS肽具有抗栓[7]、抗血管平滑肌细胞增殖[8]及抗GPⅡb/Ⅲa受体磷酸化的作用[9]。本工作的体外孵育实验结果发现RGDS肽可直接抑制损伤血管对血小板的促聚集作用，增加cAMP活性、降低PKC活性、降低活化的GPⅡb/Ⅲa受体密度。表明应用RGDS肽抗血小板GPⅡb/Ⅲa治疗，能有效的降低血小板活化。提示，血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体的活化可能是介导内皮剥脱血管刺激血小板的关键途径。
参考文献
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1997年10月20日收稿，1998年4月6日修回, http://www.100md.com