肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸的促平滑肌细胞增殖作用
作者：王晓红 苏加林 李夏 安国顺 安松柱 汤健 唐朝枢 王述恒 刘乃奎
单位：北京医科大学心血管基础研究所(北京 100083)
关键词：肌；平滑；血管；细胞；家兔
肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸的促平滑肌细胞增殖作用 摘 要 目的和方法：在培养的家兔血管平滑肌细胞上，观察了肾上腺髓质素(Adm)对溶血磷脂酸(LPA)诱导的DNA合成和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性途径激活的影响。结果：LPA使[3H]-TdR掺入和MAPK活性增加，Adm对基础水平的MAPK活性和[3H]-TdR的掺入并无显著影响，但Adm对LPA刺激[3H]-TdR掺入和MAPK活性具有抑制作用。结论：Adm和LPA相互作用参与血管平滑肌细胞增殖的调节。
Adrenomedullin inhibits the lysophosphatidic acid-induced proliferation of vascular smooth
, http://www.100md.com
muscle cells
WANG Xiao-Hong,SU Jia-Lin,LI Xia,AN Guo-Shun,AN Song-Zhu,TANG Jian,TANG Chao-Shu,WANG Shu-Heng,LIU Nai-Kui
Institute of Cardiovascular Basic Research,Beijing Medical University,Beijing(100083)
Abstract AIM and METHODS:The effect of adenomedullin(Adm) on lysophosphatidic acid(LPA)induced DNA synthesis and mitogen-activated protein kinase(MAPK) activity in cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs) of rabbit was observed.RESULTS：LPA enhanced the cultured VSMCs [3H]-TdR incorporation and increased MAPK activity concurrently. Adm could not affect basal MAPK activity or [3H]-TdR incorportion,but inhibit LPA-induced [3H]-TdR incorporation and MAPK activity in a concentration-dependent manner.CONCLUSION：The action between Adm and LPA may play an important role in regulating the proliferation of VSMCs.
, 百拇医药
MeSH Muscle,smooth,vascular;Cell;Rabbits
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖在高血压、动脉粥样硬化和血管形成术后再狭窄等心血管疾病中具有重要发病学意义，确切增殖机理目前尚未完全阐明，已知受到体内多种神经-内分泌因子的网络调节所控制[1]。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是近年新发现的磷脂类信号分子，心血管组织富含其受体，本室实验表明LPA是VSMC的强效丝裂素原，促增殖作用与激活细胞内丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径有关。肾上腺髓质素(adrenomedullin,Adm)是强效舒血管肽，具有抑制血清、生长因子和内皮素等激活MAPK和促进平滑肌细胞增殖的作用[2]。本工作在培养的家兔血管平滑肌细胞上，观察Adm对LPA诱导的DNA合成和MAPK途径激活的影响，以认识Adm与LPA对VSMC增殖调节的相互作用。
, 百拇医药
材料与方法
大耳白兔由军事科学院动物中心提供；18：1-LPA为Sigma产品；Adm由Phoenix Pharmaceutical,Znc(USA)惠赠；[32P]-ATP购自Dupont NEN(111 TBq/mmol)；MAPK单克隆抗体为Zymed Lab Inc产品；
EMEM培养基，髓磷脂化碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)为Sigma产品。余为市售分析纯产品。
1.VSMC培养：取3月龄大耳白兔胸主动脉，以贴块法[3]在37℃通有95%空气的含有20%小牛血清的EMEM培养液中，在培养箱内传代培养，实验用第四代细胞，按5×105cell/孔接种于24孔培养板培养48 h,用无血清EMEM液再孵育24 h，按下列不同药物进行实验。
, 百拇医药
实验分组：(1)对照组：不加特殊试剂；(2)LPA组：加LPA 10-8mol/L；(3)Adm组：加Adm 10-7mol/L；(4)LPA+Adm组：在加入10-8mol/L LPA基础上，分别加入10-9、10-8、10-7mol/L Adm.
2.DNA合成测定[4]：按上述分组加入不同药物孵育4 h后，加入[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,[3H]-TdR)1.85×104Bq/孔，再孵育10 h。冷PBS液终止反应，在Millipore 仪器上经微孔滤膜(0.45μm)收集并洗净细胞，滤膜干燥后加入闪烁液，在β闪烁计数仪上测定[3H]放射活性。
3.MAPK活性测定：参照本室以前报告的方法[5]，按前述分组加入不同药物后孵育10 min，用冷PBS液洗涤细胞，加入细胞溶解液并超声破碎细胞，细胞溶解液与按MAPK的单克隆抗体孵育提取免疫复合物以MBP为底物，加入[γ-32P]-ATP始动反应，用滤纸(P81phosphocelluse)测定MAPK活性。
, 百拇医药
6次实验每次进行双平行孔操作，结果以
±s表示，方差分析组间q检验作统计学处理。
结果
一、肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸诱导的[3H]-TdR掺入：
在对照组，培养VSMC [3H][放射性]活度为7563±105 counts.min-1/孔，10-8mol/L LPA可使VSMC [3H]-TdR掺入增加34%(P<0.01)，LPA分别与10-9，10-8，10-7mol/L Adm合用时，VSMC[3H]-TdR掺入较LPA单用时分别低9%(P>0.05)，12%和17%(P分别<0.05和<0.01)。单用Adm 10-7mol/L对[3H]-TdR掺入无明显影响(7020±940 counts.min-1/孔，与对照组比较，P>0.05)。结果如图1所示。
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Fig 1 Effect of Adm on LPA-induced [3 H]-TdR incorporation in cultured rabbit VSMC(
±s，n=6) **P<0.01 vs control; #P<0.05,＃＃P<0.01，vs LPA；A＝Adrenomedulin
图1 肾上腺髓质素对溶血磷脂酸诱导的兔血管平滑肌细胞[3H]-TdR掺入的影响
二、肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸诱导的丝裂素活化蛋白激酶激活：
在对照组，MAPK活性为(2157±105) counts.min-1/孔，10-8mol/L LPA可使MAPK活性增加49%(P<0.01)，LPA(10-8mol/L)与10-9、10-8、10-7mol/L Adm合用时，MAPK活性分别降低11%(P>0.05)、32%和67%(P分别<0.05和0.01)。单用Adm10-7mol/L对MAPK活性无明显影响(1997±13 counts.min-1/孔，与对照组比较P>0.05)。结果如图2所示。
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Fig 2 Effect of Adm on LPA-induced MAPK activation in cultured rabbit VSMC(
±s,n=6) **P<0.01 vs control；＃P<0.05，##P<0.01，vs LPA
图2 肾上腺髓质素对溶血磷脂酸诱导的兔血管平滑肌细胞MAPK活性的影响
讨论
LPA由膜磷脂经过磷脂酶D和磷脂酶A降解生成，是血清中的正常成分，主要以结合蛋白的形式存在。血液中LPA主要来源于活化的血小板，也可由成纤维细胞和VSMC受刺激后产生。LPA具有促平滑肌收缩和增殖作用，其丝裂原效应通过MAPK途径介导[6]。MAPK途径是细胞外信号引起细胞增殖、分化等核反应的共同途径或会聚点。兴奋G蛋白偶联受体的物质和激活酪氨酸激酶的物质刺激细胞分裂时，都要通过激活MAPK，使转录因子磷酸化而改变基因的表达水平。最近发现Adm可以抑制他们的丝裂素作用[2]。本工作发现，LPA促进平滑肌细胞增殖，表现为3H-TdR掺入、MAPK活性增加，与文献报道一致[7]。
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VSMC富含Adm受体，血管内皮细胞是血浆和血管组织Adm的主要来源，通过循环分泌和旁分泌方式不仅调节血管张力，而且调节平滑肌细胞的增殖。本工作发现，Adm对VSMC基础水平的MAPK活性和[3H]-TdR掺入并无明显影响，但Adm对LPA刺激的[3H]-TdR掺入和MAPK活性具有抑制作用。
有报道，Adm通过第二信使cAMP发挥作用。推测cAMP促进蛋白激酶A激活从而抑制Ras到Raf-1的信号转导，进而阻断MAPK的激活抑制平滑肌细胞增殖[8]。Adm与LPA相互作用对VSMC增殖调节的生理、病理生理意义值得进一步研究。
参考文献
1 Schwartz SM,Majesky MW,Murry CE.The intima:development and monoclonal responses to injury.Atherosclerosis,1995,118(Supple):S125.
, 百拇医药
2 李田昌，田青，赵东，等.肾上腺髓质素抑制内皮素的促平滑肌细胞增殖作用.高血压杂志，1996，4：171.
3 Hirata Y,Taragi,Takata S. CGRP receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1988,15:1113.
4 李田昌，庞永政，唐朝枢，等.丝裂素活化蛋白激酶活性测定.基础医学与临床，1996，16：155.
5 李田昌，佟利家，庞永政，等.丝裂素活化蛋白激酶参与内皮素刺激的兔主动脉平滑肌细胞增生.生理学报，1996，48：337.
6 Tokumura JA,Limori M,Nishioka Y,et al.Lysophophatidic acid induce proliferation of cultured vascular smooth muscle cells from rat aorta. Am J Physiol,1994,C204.
7 Graves L,Bomfeldt K,Ross R， et al.Two major signal pathways linked. Science,1993,262:988.
1997年7月9日收稿，1997年12月24日修回, http://www.100md.com
单位：北京医科大学心血管基础研究所(北京 100083)
关键词：肌；平滑；血管；细胞；家兔
肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸的促平滑肌细胞增殖作用 摘 要 目的和方法：在培养的家兔血管平滑肌细胞上，观察了肾上腺髓质素(Adm)对溶血磷脂酸(LPA)诱导的DNA合成和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性途径激活的影响。结果：LPA使[3H]-TdR掺入和MAPK活性增加，Adm对基础水平的MAPK活性和[3H]-TdR的掺入并无显著影响，但Adm对LPA刺激[3H]-TdR掺入和MAPK活性具有抑制作用。结论：Adm和LPA相互作用参与血管平滑肌细胞增殖的调节。
Adrenomedullin inhibits the lysophosphatidic acid-induced proliferation of vascular smooth
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muscle cells
WANG Xiao-Hong,SU Jia-Lin,LI Xia,AN Guo-Shun,AN Song-Zhu,TANG Jian,TANG Chao-Shu,WANG Shu-Heng,LIU Nai-Kui
Institute of Cardiovascular Basic Research,Beijing Medical University,Beijing(100083)
Abstract AIM and METHODS:The effect of adenomedullin(Adm) on lysophosphatidic acid(LPA)induced DNA synthesis and mitogen-activated protein kinase(MAPK) activity in cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs) of rabbit was observed.RESULTS：LPA enhanced the cultured VSMCs [3H]-TdR incorporation and increased MAPK activity concurrently. Adm could not affect basal MAPK activity or [3H]-TdR incorportion,but inhibit LPA-induced [3H]-TdR incorporation and MAPK activity in a concentration-dependent manner.CONCLUSION：The action between Adm and LPA may play an important role in regulating the proliferation of VSMCs.
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MeSH Muscle,smooth,vascular;Cell;Rabbits
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖在高血压、动脉粥样硬化和血管形成术后再狭窄等心血管疾病中具有重要发病学意义，确切增殖机理目前尚未完全阐明，已知受到体内多种神经-内分泌因子的网络调节所控制[1]。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是近年新发现的磷脂类信号分子，心血管组织富含其受体，本室实验表明LPA是VSMC的强效丝裂素原，促增殖作用与激活细胞内丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径有关。肾上腺髓质素(adrenomedullin,Adm)是强效舒血管肽，具有抑制血清、生长因子和内皮素等激活MAPK和促进平滑肌细胞增殖的作用[2]。本工作在培养的家兔血管平滑肌细胞上，观察Adm对LPA诱导的DNA合成和MAPK途径激活的影响，以认识Adm与LPA对VSMC增殖调节的相互作用。
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材料与方法
大耳白兔由军事科学院动物中心提供；18：1-LPA为Sigma产品；Adm由Phoenix Pharmaceutical,Znc(USA)惠赠；[32P]-ATP购自Dupont NEN(111 TBq/mmol)；MAPK单克隆抗体为Zymed Lab Inc产品；
EMEM培养基，髓磷脂化碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)为Sigma产品。余为市售分析纯产品。
1.VSMC培养：取3月龄大耳白兔胸主动脉，以贴块法[3]在37℃通有95%空气的含有20%小牛血清的EMEM培养液中，在培养箱内传代培养，实验用第四代细胞，按5×105cell/孔接种于24孔培养板培养48 h,用无血清EMEM液再孵育24 h，按下列不同药物进行实验。
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实验分组：(1)对照组：不加特殊试剂；(2)LPA组：加LPA 10-8mol/L；(3)Adm组：加Adm 10-7mol/L；(4)LPA+Adm组：在加入10-8mol/L LPA基础上，分别加入10-9、10-8、10-7mol/L Adm.
2.DNA合成测定[4]：按上述分组加入不同药物孵育4 h后，加入[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,[3H]-TdR)1.85×104Bq/孔，再孵育10 h。冷PBS液终止反应，在Millipore 仪器上经微孔滤膜(0.45μm)收集并洗净细胞，滤膜干燥后加入闪烁液，在β闪烁计数仪上测定[3H]放射活性。
3.MAPK活性测定：参照本室以前报告的方法[5]，按前述分组加入不同药物后孵育10 min，用冷PBS液洗涤细胞，加入细胞溶解液并超声破碎细胞，细胞溶解液与按MAPK的单克隆抗体孵育提取免疫复合物以MBP为底物，加入[γ-32P]-ATP始动反应，用滤纸(P81phosphocelluse)测定MAPK活性。
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6次实验每次进行双平行孔操作，结果以
±s表示，方差分析组间q检验作统计学处理。结果
一、肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸诱导的[3H]-TdR掺入：
在对照组，培养VSMC [3H][放射性]活度为7563±105 counts.min-1/孔，10-8mol/L LPA可使VSMC [3H]-TdR掺入增加34%(P<0.01)，LPA分别与10-9，10-8，10-7mol/L Adm合用时，VSMC[3H]-TdR掺入较LPA单用时分别低9%(P>0.05)，12%和17%(P分别<0.05和<0.01)。单用Adm 10-7mol/L对[3H]-TdR掺入无明显影响(7020±940 counts.min-1/孔，与对照组比较，P>0.05)。结果如图1所示。
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Fig 1 Effect of Adm on LPA-induced [3 H]-TdR incorporation in cultured rabbit VSMC(
±s，n=6) **P<0.01 vs control; #P<0.05,＃＃P<0.01，vs LPA；A＝Adrenomedulin图1 肾上腺髓质素对溶血磷脂酸诱导的兔血管平滑肌细胞[3H]-TdR掺入的影响
二、肾上腺髓质素抑制溶血磷脂酸诱导的丝裂素活化蛋白激酶激活：
在对照组，MAPK活性为(2157±105) counts.min-1/孔，10-8mol/L LPA可使MAPK活性增加49%(P<0.01)，LPA(10-8mol/L)与10-9、10-8、10-7mol/L Adm合用时，MAPK活性分别降低11%(P>0.05)、32%和67%(P分别<0.05和0.01)。单用Adm10-7mol/L对MAPK活性无明显影响(1997±13 counts.min-1/孔，与对照组比较P>0.05)。结果如图2所示。
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Fig 2 Effect of Adm on LPA-induced MAPK activation in cultured rabbit VSMC(
±s,n=6) **P<0.01 vs control；＃P<0.05，##P<0.01，vs LPA图2 肾上腺髓质素对溶血磷脂酸诱导的兔血管平滑肌细胞MAPK活性的影响
讨论
LPA由膜磷脂经过磷脂酶D和磷脂酶A降解生成，是血清中的正常成分，主要以结合蛋白的形式存在。血液中LPA主要来源于活化的血小板，也可由成纤维细胞和VSMC受刺激后产生。LPA具有促平滑肌收缩和增殖作用，其丝裂原效应通过MAPK途径介导[6]。MAPK途径是细胞外信号引起细胞增殖、分化等核反应的共同途径或会聚点。兴奋G蛋白偶联受体的物质和激活酪氨酸激酶的物质刺激细胞分裂时，都要通过激活MAPK，使转录因子磷酸化而改变基因的表达水平。最近发现Adm可以抑制他们的丝裂素作用[2]。本工作发现，LPA促进平滑肌细胞增殖，表现为3H-TdR掺入、MAPK活性增加，与文献报道一致[7]。
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VSMC富含Adm受体，血管内皮细胞是血浆和血管组织Adm的主要来源，通过循环分泌和旁分泌方式不仅调节血管张力，而且调节平滑肌细胞的增殖。本工作发现，Adm对VSMC基础水平的MAPK活性和[3H]-TdR掺入并无明显影响，但Adm对LPA刺激的[3H]-TdR掺入和MAPK活性具有抑制作用。
有报道，Adm通过第二信使cAMP发挥作用。推测cAMP促进蛋白激酶A激活从而抑制Ras到Raf-1的信号转导，进而阻断MAPK的激活抑制平滑肌细胞增殖[8]。Adm与LPA相互作用对VSMC增殖调节的生理、病理生理意义值得进一步研究。
参考文献
1 Schwartz SM,Majesky MW,Murry CE.The intima:development and monoclonal responses to injury.Atherosclerosis,1995,118(Supple):S125.
, 百拇医药
2 李田昌，田青，赵东，等.肾上腺髓质素抑制内皮素的促平滑肌细胞增殖作用.高血压杂志，1996，4：171.
3 Hirata Y,Taragi,Takata S. CGRP receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1988,15:1113.
4 李田昌，庞永政，唐朝枢，等.丝裂素活化蛋白激酶活性测定.基础医学与临床，1996，16：155.
5 李田昌，佟利家，庞永政，等.丝裂素活化蛋白激酶参与内皮素刺激的兔主动脉平滑肌细胞增生.生理学报，1996，48：337.
6 Tokumura JA,Limori M,Nishioka Y,et al.Lysophophatidic acid induce proliferation of cultured vascular smooth muscle cells from rat aorta. Am J Physiol,1994,C204.
7 Graves L,Bomfeldt K,Ross R， et al.Two major signal pathways linked. Science,1993,262:988.
1997年7月9日收稿，1997年12月24日修回, http://www.100md.com