牛磺酸对大鼠脑缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响
作者：赵士福 蔡文琴
单位：赵士福 第三军医大学新桥医院神经内科(重庆 630037)；蔡文琴 第三军医大学组织学与胚胎学教研室
关键词：脑；局部缺血；牛磺酸
中国病理生理杂志990518 摘 要 目的：研究牛磺酸(taurine, Tau)对脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响。方法：建立大鼠全脑缺血再灌注模型，使用DNA片段原位末端标记(terminal deoxynucleotigyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)和流式细胞仪(flow cytometry, FCM)观察了Tau治疗后细胞凋亡的变化。结果：海马及顶叶皮层内凋亡细胞数显著降低，但在1 mg及2 mg剂量组间无显著差异。结论：Tau对脑缺血再灌注损伤中神经细胞的保护作用可能部分由于降低细胞凋亡的发生。
, 百拇医药
The effect of taurine on apoptosis during ischemia-reperfusion injury in rats
ZHAO Shi-Fu,CAI Wen-Qin1
Department of Neurology, Xin Qiao Hospital, Third Military Medical College, Chongqing(400037)
1 Department of Histology and Embryology, Thrid Military Medical College
Abstract AIM and METHOD:In order to recognize the effect of taurine on apoptosis during ischemia-reperfusion injury, the model of rat globle brain ischemia-reperfusion injury was made, the changes of apoptotic cells were observed after taurine treatment by using methods of terminal deoxynucleotigyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) and flow cytometry(FCM).RESULTS:The number of apoptotic cells decreased significantly in hippocampus and parietal cortex, but there were significant difference between 1 mg and 2 mg dose group. CONCLUSION:The neural protective effect of taurine against ischemia-reperfusion injury may be partially due to reducing occurrence of apoptosis.
, 百拇医药
MeSH Brain; Ischemia; Taurine
近年的研究提示细胞凋亡是脑缺血损伤的重要形式[1]。牛磺酸(taurine, Tau)是人体内含量较高的自由氨基酸，在中枢神经系统中具有重要生理功能，是一种抑制性作用的氨基酸[2]。研究发现Tau对缺血、惊厥等引起的神经元损害具有对抗作用[2，3]，这种抗损害作用是通过对抗兴奋性氨基酸、过氧化物和调节细胞内Ca2+水平实现的，而兴奋性氨基酸、过氧化物和细胞内Ca2+升高与细胞凋亡(apoptosis)的发生有关[4，5]。因此，Tau可能对缺血后细胞凋亡有一定影响。本研究通过建立全脑缺血模型，观察Tau治疗后细胞凋亡的变化，为脑缺血的防治提供实验依据。
材料与方法
1.大鼠脑缺血动物模型：Wistar大鼠，体重250～300 g，0.3%戊巴比妥钠(ip)麻醉后，固定于立体定位仪上，使用四血管阻塞模型，先在第1、2颈椎水平闭合双侧椎动脉，分离双侧颈总动脉。次日在乙醚麻醉下，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，缺血30 min，松开微动脉夹，进行再灌流，达到再灌流时间后取材。
, 百拇医药
2.牛磺酸给药方式及分组：采用脑室内给药，将大鼠固定于立体定位仪，颅顶保持在同一水平面，以前囟为零点，向后0.8 mm，外侧1.5 mm，深4.5 mm，进入脑室(右)后推药时感阻力小。以1 mg及2 mg两个剂量组，分别给以10%牛磺酸(Sigma)10 μL和20 μL，每组给药两次，于缺血前给1次，缺血再灌流12 h再给1次，对照组用相同体积的生理盐水，每组5只，用于FCM测定；另外每组4只，用于TUNEL染色。
3.TUNEL染色：使用德国BM公司原位末端标记盒，原理是应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 将荧光素标记dUTP连接于DNA片段3’-OH末端。切片经蛋白酶K(20 mg/L,Sigma)室温下消化15 min，再用甲醇配制的0.3%H2O2处理30 min，然后浸于TUNEL反应混合物中，37℃ 60 min，用TB缓冲液(300 mmol/L NaCl, 30 mmol/L sodium citrate)室温下孵育15 min终止反应，再用连有辣根过氧化物酶(POD)的抗荧光素抗体于湿盒中37℃孵育30 min，DAB显色。阴性对照采用标记液(无TdT)代替TUNEL反应混合物。
, 百拇医药
4.FCM测定：于缺血再灌流24 h断头取脑，取给药同侧海马分离单细胞[6]，固定后按TUNEL方法染色，FCM测定。
5.图像处理：使用德国Leica公司MD20图像分析系统，测定单位面积(mm2)阳性细胞核数。
结果
1.FCM测定：通过缺血前给予1 mg和2 mg两种剂量牛磺酸，于缺血再灌流24 h分离海马单细胞，经TUNEL荧光染色，对凋亡细胞数量、百分比及平均荧光强度进行测定，生理盐水对照组，凋亡细胞数为12.36%，1 mg治疗组为8.93%，2 mg治疗组为8.33%，治疗组与生理盐水对照组间有显著差别(P<0.05)，但两种剂量之间无显著差别(见表1)。
表1 牛磺酸对脑缺血再灌流损伤中海马内凋亡细胞的影响
, 百拇医药
Tab 1 The effect of taurine on apoptosis in
hippocampus during ischemia-reperfusion injury
Control
1 mg
2 mg
Number of apop
1236±108
893±251*
833±143*
%
, http://www.100md.com
12.36±1.08
8.93±2.51*
8.33±1.43*
Fluo-density
26.30±2.34
25.00±2.58
23.50±1.52
n=5,*P<0.05，vs control
2.TUNEL染色：在生理盐水对照组，缺血再灌流24 h，海马CA1区及顶叶皮层可见较多阳性细胞核，表现为核固缩，阳性信号局限在核内，染色质凝集，边聚，形成半月状或环状。1 mg及2 mg治疗组，海马及顶叶皮层阳性细胞数明显减少。阳性细胞核的计数显示Tau治疗组阳性细胞核数较对照组明显减少(见表2)，而两组之间无显著差别。
, 百拇医药
表2 牛磺酸治疗后缺血再灌流24 h脑内凋亡细胞数的变化
Tab 2 The changes of the number of apoptotic cells in brain at 24h
of ischemia-reperfusion after taurine treatment (
) Regions
Control
1mg
2mg
CA1
18.43±2.01
, 百拇医药
12.63±2.69*
11.56±3.01**
PC
17.50±1.76
11.69±2.95*
10.44±2.10**
n=4;CA1:the sector of hippocampus; PC:parietal cortex; *P<0.05，**P<0.01, vs control
讨论
近年，研究逐步证实细胞凋亡是脑缺血再灌流损伤的重要形式之一，特别在迟发性神经元损害阶段[1]。在脑缺血后牛磺酸含量增高，可对抗谷氨酸(glutamate,Glu)等兴奋性氨基酸及Ca2+升高引起的神经元损伤[3，7]。本实验发现，在脑缺血再灌流中，给予Tau后，海马CA1区及顶叶皮层内凋亡细胞数量显著降低，1 mg及2 mg治疗组，顶叶皮层每平方毫米凋亡细胞数分别降至11.69及10.44个。FCM测定也显示海马内凋亡细胞显著下降，反映Tau对脑缺血再灌流细胞凋亡的发生具有一定保护作用。
, http://www.100md.com
以前对脑缺血后牛磺酸变化的研究提示，脑缺血后牛磺酸含量快速上升，随脑血流的增多，牛磺酸含量下降，但再灌流4 h后其含量又上升，这种变化与缺血后神经元的损伤的发生一致[7]。牛磺酸的分布在脑内不同区域差别较大，主要分布于细胞内，使用微灌注技术测得细胞外液浓度，在缺血后含量可数百倍增加[8]，由于牛磺酸难以通过血脑屏障，本实验从脑室内给药，根据生理时含量及缺血后变化确定给予1 mg和2 mg两种剂量，观察细胞凋亡的发生变化，1 mg和2 mg治疗组与对照组比较均有显著性降低，而两种剂量之间无显著性区别。可能因为实验中使用1 mg和2 mg，相对脑内水平，均为大剂量，反映牛磺酸在剂量达到一定程度后，再增加剂量，其作用上升不明显。在培养细胞的研究中有类似结论，杨忠等[9]使用0.5-10 mmol/L不同浓度牛磺酸，观察其对Glu和使君子酸(quisqualate,Qu)导致的培养小脑神经元死亡的作用时，发现2.0 mmol/L时效果最佳，再增加浓度其作用效果不再增强。
, 百拇医药
体内牛磺酸分布在中枢神经系统、肌肉及心脏内，具有抑制神经元过度兴奋、抗惊厥和增强神经细胞对缺血的耐受性等广泛的生理作用[2，3]。本实验结果提示，给予外源性Tau能降低脑缺血再灌注中细胞凋亡的发生，因此，外源Tau对防治脑缺血再灌流损伤是有益的。牛磺酸降低缺血再灌流中细胞凋亡的机制尚未得到认识，可能与调节细胞内Ca2+、对抗兴奋性氨基酸、超氧化物等作用有关。
参考文献
1 Nitatori T, Sato N, Waguri S, et al. Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis. J Neurosci, 1995, 15:1001.
, http://www.100md.com 2 Huxtable RJ. Physiological action of taurine. Physiol Rev, 1992, 72:101.
3 温书宝，张 敏.牛磺酸的细胞保护作用.中国药学杂志，1995，30：451.
4 赵士福，蔡文琴.神经元缺血性损伤中的细胞程序性死亡.国外医学脑血管病分册，1996，4：169.
5 Chan PH. Role of oxidants in ischemic brain damage. Stroke, 1996,27:1124.
6 王传松，蔡文琴，李才安等.流式细胞计用于大鼠脑发育研究.中国神经科学杂志，1996，3：125.
7 Matsumoto K, Lo EH, Pierce AR, et al. Secondary elevation of extracellular neurotransmitter amino acids in the reperfusion phase following focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:114.
, 百拇医药
8 Shibanoki S, Kogure M, Sugahara M, et al. Effect of systemic administration of N-Methyl-D-Aspartic acid on extracellular taurine level measured by microdialysis in the hippocampal CA1 field and striatum of rats. J Neurochem, 1993, 61:1689.
9 杨 忠，蔡文琴.牛磺酸减轻兴奋性氨基酸对培养新生大鼠小脑皮层神经元的损害.第三军医大学学报，1996，18：22.
(1997年7月18日收稿，1998年3月10日修回), http://www.100md.com
单位：赵士福 第三军医大学新桥医院神经内科(重庆 630037)；蔡文琴 第三军医大学组织学与胚胎学教研室
关键词：脑；局部缺血；牛磺酸
中国病理生理杂志990518 摘 要 目的：研究牛磺酸(taurine, Tau)对脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响。方法：建立大鼠全脑缺血再灌注模型，使用DNA片段原位末端标记(terminal deoxynucleotigyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)和流式细胞仪(flow cytometry, FCM)观察了Tau治疗后细胞凋亡的变化。结果：海马及顶叶皮层内凋亡细胞数显著降低，但在1 mg及2 mg剂量组间无显著差异。结论：Tau对脑缺血再灌注损伤中神经细胞的保护作用可能部分由于降低细胞凋亡的发生。
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The effect of taurine on apoptosis during ischemia-reperfusion injury in rats
ZHAO Shi-Fu,CAI Wen-Qin1
Department of Neurology, Xin Qiao Hospital, Third Military Medical College, Chongqing(400037)
1 Department of Histology and Embryology, Thrid Military Medical College
Abstract AIM and METHOD:In order to recognize the effect of taurine on apoptosis during ischemia-reperfusion injury, the model of rat globle brain ischemia-reperfusion injury was made, the changes of apoptotic cells were observed after taurine treatment by using methods of terminal deoxynucleotigyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) and flow cytometry(FCM).RESULTS:The number of apoptotic cells decreased significantly in hippocampus and parietal cortex, but there were significant difference between 1 mg and 2 mg dose group. CONCLUSION:The neural protective effect of taurine against ischemia-reperfusion injury may be partially due to reducing occurrence of apoptosis.
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MeSH Brain; Ischemia; Taurine
近年的研究提示细胞凋亡是脑缺血损伤的重要形式[1]。牛磺酸(taurine, Tau)是人体内含量较高的自由氨基酸，在中枢神经系统中具有重要生理功能，是一种抑制性作用的氨基酸[2]。研究发现Tau对缺血、惊厥等引起的神经元损害具有对抗作用[2，3]，这种抗损害作用是通过对抗兴奋性氨基酸、过氧化物和调节细胞内Ca2+水平实现的，而兴奋性氨基酸、过氧化物和细胞内Ca2+升高与细胞凋亡(apoptosis)的发生有关[4，5]。因此，Tau可能对缺血后细胞凋亡有一定影响。本研究通过建立全脑缺血模型，观察Tau治疗后细胞凋亡的变化，为脑缺血的防治提供实验依据。
材料与方法
1.大鼠脑缺血动物模型：Wistar大鼠，体重250～300 g，0.3%戊巴比妥钠(ip)麻醉后，固定于立体定位仪上，使用四血管阻塞模型，先在第1、2颈椎水平闭合双侧椎动脉，分离双侧颈总动脉。次日在乙醚麻醉下，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，缺血30 min，松开微动脉夹，进行再灌流，达到再灌流时间后取材。
, 百拇医药
2.牛磺酸给药方式及分组：采用脑室内给药，将大鼠固定于立体定位仪，颅顶保持在同一水平面，以前囟为零点，向后0.8 mm，外侧1.5 mm，深4.5 mm，进入脑室(右)后推药时感阻力小。以1 mg及2 mg两个剂量组，分别给以10%牛磺酸(Sigma)10 μL和20 μL，每组给药两次，于缺血前给1次，缺血再灌流12 h再给1次，对照组用相同体积的生理盐水，每组5只，用于FCM测定；另外每组4只，用于TUNEL染色。
3.TUNEL染色：使用德国BM公司原位末端标记盒，原理是应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 将荧光素标记dUTP连接于DNA片段3’-OH末端。切片经蛋白酶K(20 mg/L,Sigma)室温下消化15 min，再用甲醇配制的0.3%H2O2处理30 min，然后浸于TUNEL反应混合物中，37℃ 60 min，用TB缓冲液(300 mmol/L NaCl, 30 mmol/L sodium citrate)室温下孵育15 min终止反应，再用连有辣根过氧化物酶(POD)的抗荧光素抗体于湿盒中37℃孵育30 min，DAB显色。阴性对照采用标记液(无TdT)代替TUNEL反应混合物。
, 百拇医药
4.FCM测定：于缺血再灌流24 h断头取脑，取给药同侧海马分离单细胞[6]，固定后按TUNEL方法染色，FCM测定。
5.图像处理：使用德国Leica公司MD20图像分析系统，测定单位面积(mm2)阳性细胞核数。
结果
1.FCM测定：通过缺血前给予1 mg和2 mg两种剂量牛磺酸，于缺血再灌流24 h分离海马单细胞，经TUNEL荧光染色，对凋亡细胞数量、百分比及平均荧光强度进行测定，生理盐水对照组，凋亡细胞数为12.36%，1 mg治疗组为8.93%，2 mg治疗组为8.33%，治疗组与生理盐水对照组间有显著差别(P<0.05)，但两种剂量之间无显著差别(见表1)。
表1 牛磺酸对脑缺血再灌流损伤中海马内凋亡细胞的影响
, 百拇医药
Tab 1 The effect of taurine on apoptosis in
hippocampus during ischemia-reperfusion injury
Control
1 mg
2 mg
Number of apop
1236±108
893±251*
833±143*
%
, http://www.100md.com
12.36±1.08
8.93±2.51*
8.33±1.43*
Fluo-density
26.30±2.34
25.00±2.58
23.50±1.52
n=5,*P<0.05，vs control
2.TUNEL染色：在生理盐水对照组，缺血再灌流24 h，海马CA1区及顶叶皮层可见较多阳性细胞核，表现为核固缩，阳性信号局限在核内，染色质凝集，边聚，形成半月状或环状。1 mg及2 mg治疗组，海马及顶叶皮层阳性细胞数明显减少。阳性细胞核的计数显示Tau治疗组阳性细胞核数较对照组明显减少(见表2)，而两组之间无显著差别。
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表2 牛磺酸治疗后缺血再灌流24 h脑内凋亡细胞数的变化
Tab 2 The changes of the number of apoptotic cells in brain at 24h
of ischemia-reperfusion after taurine treatment (
) RegionsControl
1mg
2mg
CA1
18.43±2.01
, 百拇医药
12.63±2.69*
11.56±3.01**
PC
17.50±1.76
11.69±2.95*
10.44±2.10**
n=4;CA1:the sector of hippocampus; PC:parietal cortex; *P<0.05，**P<0.01, vs control
讨论
近年，研究逐步证实细胞凋亡是脑缺血再灌流损伤的重要形式之一，特别在迟发性神经元损害阶段[1]。在脑缺血后牛磺酸含量增高，可对抗谷氨酸(glutamate,Glu)等兴奋性氨基酸及Ca2+升高引起的神经元损伤[3，7]。本实验发现，在脑缺血再灌流中，给予Tau后，海马CA1区及顶叶皮层内凋亡细胞数量显著降低，1 mg及2 mg治疗组，顶叶皮层每平方毫米凋亡细胞数分别降至11.69及10.44个。FCM测定也显示海马内凋亡细胞显著下降，反映Tau对脑缺血再灌流细胞凋亡的发生具有一定保护作用。
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以前对脑缺血后牛磺酸变化的研究提示，脑缺血后牛磺酸含量快速上升，随脑血流的增多，牛磺酸含量下降，但再灌流4 h后其含量又上升，这种变化与缺血后神经元的损伤的发生一致[7]。牛磺酸的分布在脑内不同区域差别较大，主要分布于细胞内，使用微灌注技术测得细胞外液浓度，在缺血后含量可数百倍增加[8]，由于牛磺酸难以通过血脑屏障，本实验从脑室内给药，根据生理时含量及缺血后变化确定给予1 mg和2 mg两种剂量，观察细胞凋亡的发生变化，1 mg和2 mg治疗组与对照组比较均有显著性降低，而两种剂量之间无显著性区别。可能因为实验中使用1 mg和2 mg，相对脑内水平，均为大剂量，反映牛磺酸在剂量达到一定程度后，再增加剂量，其作用上升不明显。在培养细胞的研究中有类似结论，杨忠等[9]使用0.5-10 mmol/L不同浓度牛磺酸，观察其对Glu和使君子酸(quisqualate,Qu)导致的培养小脑神经元死亡的作用时，发现2.0 mmol/L时效果最佳，再增加浓度其作用效果不再增强。
, 百拇医药
体内牛磺酸分布在中枢神经系统、肌肉及心脏内，具有抑制神经元过度兴奋、抗惊厥和增强神经细胞对缺血的耐受性等广泛的生理作用[2，3]。本实验结果提示，给予外源性Tau能降低脑缺血再灌注中细胞凋亡的发生，因此，外源Tau对防治脑缺血再灌流损伤是有益的。牛磺酸降低缺血再灌流中细胞凋亡的机制尚未得到认识，可能与调节细胞内Ca2+、对抗兴奋性氨基酸、超氧化物等作用有关。
参考文献
1 Nitatori T, Sato N, Waguri S, et al. Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis. J Neurosci, 1995, 15:1001.
, http://www.100md.com 2 Huxtable RJ. Physiological action of taurine. Physiol Rev, 1992, 72:101.
3 温书宝，张 敏.牛磺酸的细胞保护作用.中国药学杂志，1995，30：451.
4 赵士福，蔡文琴.神经元缺血性损伤中的细胞程序性死亡.国外医学脑血管病分册，1996，4：169.
5 Chan PH. Role of oxidants in ischemic brain damage. Stroke, 1996,27:1124.
6 王传松，蔡文琴，李才安等.流式细胞计用于大鼠脑发育研究.中国神经科学杂志，1996，3：125.
7 Matsumoto K, Lo EH, Pierce AR, et al. Secondary elevation of extracellular neurotransmitter amino acids in the reperfusion phase following focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:114.
, 百拇医药
8 Shibanoki S, Kogure M, Sugahara M, et al. Effect of systemic administration of N-Methyl-D-Aspartic acid on extracellular taurine level measured by microdialysis in the hippocampal CA1 field and striatum of rats. J Neurochem, 1993, 61:1689.
9 杨 忠，蔡文琴.牛磺酸减轻兴奋性氨基酸对培养新生大鼠小脑皮层神经元的损害.第三军医大学学报，1996，18：22.
(1997年7月18日收稿，1998年3月10日修回), http://www.100md.com