脂多糖、肿瘤坏死因子α、白介素-6对鼠星形胶质细胞分泌一氧化氮的影响*
作者：朱发明 文志斌 熊石龙 李俊成 贺石林
单位：文志斌 熊石龙 李俊成 贺石林 湖南医科大学生理教研室(长沙 410078)；朱发明 浙江省血液中心(杭州 310020)
关键词：
脂多糖
一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种信使分子和杀伤分子，在人体多种生理和病理过程中起作用。NO可传递神经信息、扩张血管、降低血压等。已有资料表明星形胶质细胞能分泌NO，但炎性介质对其影响尚未明确。本文拟观察脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素-6(IL-6)对星形胶质细胞分泌NO的影响。
材料与方法
(一)试剂和药品：DMEM培养基干粉、脂多糖(LPS)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α、亚硝酸盐、N-1-萘乙二胺盐酸盐、磺胺、兔抗鼠神经胶质纤维样酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)单抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG抗体均为美国Sigma产品。
, 百拇医药
(二)细胞培养方法：按Hertz等报道的方法培养Wistar乳鼠(出生后24 h内)星形胶质细胞。星形胶质细胞能特异性分泌神经胶质纤维样酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP),采用GFAP抗原间接免疫荧光法进行鉴定。
(三)实验过程：将同源传代的单层星形胶质细胞(F1代)接种于24孔板上，每孔接种细胞数为5×104，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。待24孔板细胞完全融合成片，去培养液，用D-Hanks液洗涤3遍。然后分组加入含不同刺激物的完全DMEM 1 mL，对照组只加完全DMEM 1 mL。37℃、5%CO2饱和湿度培养24 h后，收集培养液，贮存于-40℃待测。
(四)NO测定方法：NO化学性质极不稳定，很快转变为亚硝酸根(
)，可进一步转化成为
。本实验采用Griess反应检测NO代谢产物
来反映NO的活性。
, 百拇医药
(五)统计学分析：测定结果以均数±标准差(
)表示，采用INSTAT统计软件，组间比较采用F检验。若F>F0.05，则两两比较用q检验。
结果
(一)星形胶质细胞鉴定：使用抗GFAP单抗组荧光显微镜下可见99%以上的细胞呈现黄色荧光，而无单抗组荧光显微镜下无荧光表现，表明培养的细胞绝大多数属于星形胶质细胞。用各刺激物后镜下观察细胞形态无明显的变化。
(二)LPS、TNFα、IL-6对星形胶质细胞分泌NO的影响：参照有关文献，选定实验中刺激物浓度。加入的各刺激物终浓度分别为LPS 1 μg/mL、 IL-6 40 ng/mL、 TNFα 100 ng/mL。加入刺激物后细胞培养时间为24 h。结果显示(见表1)：LPS、TNFα、LPS+IL-6、LPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6、TNFα+IL-6组星形胶质细胞分泌NO明显高于对照组(P<0.05)。而IL-6组无明显的变化(P>0.05)。LPS、TNFα、LPS+IL-6、LPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6、TNFα+IL-6组星形胶质细胞分泌NO明显高于IL-6组(P<0.05)。IPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6组星形胶质细胞表达NO明显高于TNFα组(P<0.05)，而LPS、LPS+IL-6、TNFα+IL-6组与TNFα组比较无明显的区别(P>0.05)。LPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6组星形胶质细胞分泌NO明显高于LPS组(P<0.05)，而IL-6+TNFα、IL-6+LPS组与LPS组比较无明显的区别(P>0.05)。
, http://www.100md.com
表1 脂多糖、白介素-6、肿瘤坏死因子α对星形胶质
细胞分泌NO的影响
Tab 1 Effect of LPS,TNFα, IL-6 on the secretion NO
of astrocytes (n=9,)
Group(μmol/L)
Control
, http://www.100md.com
1.98±0.58
IL-6
1.99±0.43
TNFα
4.96±0.95*
LPS
6.51±0.53*
IL-6+TNFα
5.82±0.24*
LPS+IL-6
6.11±0.73*
, 百拇医药
LPS+TNFα
9.81±0.63*
LPS+IL-6+TNFα
9.82±0.68*
* P<0.05,vs control group
讨论
NO具有多种生物活性，可传递神经信息，调节血管内皮细胞、平滑肌和神经细胞等功能，它参与血管平滑肌松驰、细胞介导的免疫反应等。人体内主要有结构型(cNOS)与诱生型(iNOS)两种NO合酶。cNOS与iNOS均存在于星形胶质细胞中。本实验结果表明，在基础培养液中，星形胶质细胞能分泌少量的NO，这与文献报道基本一致。
NO在体内的作用是双重性的，既有利于机体(作为信使或调节物，参与自身免疫防御反应等)，有时也对机体有害。慢性炎症(如关节炎等)或败血症时，体内NO的生成往往明显升高。研究表明NOS抑制剂可以逆转机体典型的炎症反应。当脑部细菌感染或败血症时，由于细菌内毒素的作用，可使血管内皮细胞或单核细胞分泌细胞肽(肿瘤坏死因子与白介素-6等)。此外，星形胶质细胞也能分泌TNFα和IL-6。本实验结果表明LPS、TNFα能刺激星形中国病理生理杂志990625胶质细胞分泌NO，两者合用有明显的增强作用，这提示脑内感染时，由于内毒素与细胞因子的共同作用，脑内局部可形成大量的NO。此外NO也可进入血液中，引起机体内NO增强。脑内NO通过介导非肾上腺非乙酰胆碱神经(nonadrenergic-noncholinergic, NANC)而起神经递质作用，而体内NO的大量增高可引起血管扩张，血压下降，加重内毒素反应。这表明内毒素及败血症休克的发生发展可能与NO大量的生成有一定的关系。
* 国家自然科学基金资助(No.39600197)
(1998年6月1日收稿，1999年4月30日修回), http://www.100md.com
单位：文志斌 熊石龙 李俊成 贺石林 湖南医科大学生理教研室(长沙 410078)；朱发明 浙江省血液中心(杭州 310020)
关键词：
脂多糖
一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种信使分子和杀伤分子，在人体多种生理和病理过程中起作用。NO可传递神经信息、扩张血管、降低血压等。已有资料表明星形胶质细胞能分泌NO，但炎性介质对其影响尚未明确。本文拟观察脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素-6(IL-6)对星形胶质细胞分泌NO的影响。
材料与方法
(一)试剂和药品：DMEM培养基干粉、脂多糖(LPS)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α、亚硝酸盐、N-1-萘乙二胺盐酸盐、磺胺、兔抗鼠神经胶质纤维样酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)单抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG抗体均为美国Sigma产品。
, 百拇医药
(二)细胞培养方法：按Hertz等报道的方法培养Wistar乳鼠(出生后24 h内)星形胶质细胞。星形胶质细胞能特异性分泌神经胶质纤维样酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP),采用GFAP抗原间接免疫荧光法进行鉴定。
(三)实验过程：将同源传代的单层星形胶质细胞(F1代)接种于24孔板上，每孔接种细胞数为5×104，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。待24孔板细胞完全融合成片，去培养液，用D-Hanks液洗涤3遍。然后分组加入含不同刺激物的完全DMEM 1 mL，对照组只加完全DMEM 1 mL。37℃、5%CO2饱和湿度培养24 h后，收集培养液，贮存于-40℃待测。
(四)NO测定方法：NO化学性质极不稳定，很快转变为亚硝酸根(
)，可进一步转化成为。本实验采用Griess反应检测NO代谢产物来反映NO的活性。, 百拇医药
(五)统计学分析：测定结果以均数±标准差(
)表示，采用INSTAT统计软件，组间比较采用F检验。若F>F0.05，则两两比较用q检验。结果
(一)星形胶质细胞鉴定：使用抗GFAP单抗组荧光显微镜下可见99%以上的细胞呈现黄色荧光，而无单抗组荧光显微镜下无荧光表现，表明培养的细胞绝大多数属于星形胶质细胞。用各刺激物后镜下观察细胞形态无明显的变化。
(二)LPS、TNFα、IL-6对星形胶质细胞分泌NO的影响：参照有关文献，选定实验中刺激物浓度。加入的各刺激物终浓度分别为LPS 1 μg/mL、 IL-6 40 ng/mL、 TNFα 100 ng/mL。加入刺激物后细胞培养时间为24 h。结果显示(见表1)：LPS、TNFα、LPS+IL-6、LPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6、TNFα+IL-6组星形胶质细胞分泌NO明显高于对照组(P<0.05)。而IL-6组无明显的变化(P>0.05)。LPS、TNFα、LPS+IL-6、LPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6、TNFα+IL-6组星形胶质细胞分泌NO明显高于IL-6组(P<0.05)。IPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6组星形胶质细胞表达NO明显高于TNFα组(P<0.05)，而LPS、LPS+IL-6、TNFα+IL-6组与TNFα组比较无明显的区别(P>0.05)。LPS+TNFα、LPS+TNFα+IL-6组星形胶质细胞分泌NO明显高于LPS组(P<0.05)，而IL-6+TNFα、IL-6+LPS组与LPS组比较无明显的区别(P>0.05)。
, http://www.100md.com
表1 脂多糖、白介素-6、肿瘤坏死因子α对星形胶质
细胞分泌NO的影响
Tab 1 Effect of LPS,TNFα, IL-6 on the secretion NO
of astrocytes (n=9,
)Group
(μmol/L)Control
, http://www.100md.com
1.98±0.58
IL-6
1.99±0.43
TNFα
4.96±0.95*
LPS
6.51±0.53*
IL-6+TNFα
5.82±0.24*
LPS+IL-6
6.11±0.73*
, 百拇医药
LPS+TNFα
9.81±0.63*
LPS+IL-6+TNFα
9.82±0.68*
* P<0.05,vs control group
讨论
NO具有多种生物活性，可传递神经信息，调节血管内皮细胞、平滑肌和神经细胞等功能，它参与血管平滑肌松驰、细胞介导的免疫反应等。人体内主要有结构型(cNOS)与诱生型(iNOS)两种NO合酶。cNOS与iNOS均存在于星形胶质细胞中。本实验结果表明，在基础培养液中，星形胶质细胞能分泌少量的NO，这与文献报道基本一致。
NO在体内的作用是双重性的，既有利于机体(作为信使或调节物，参与自身免疫防御反应等)，有时也对机体有害。慢性炎症(如关节炎等)或败血症时，体内NO的生成往往明显升高。研究表明NOS抑制剂可以逆转机体典型的炎症反应。当脑部细菌感染或败血症时，由于细菌内毒素的作用，可使血管内皮细胞或单核细胞分泌细胞肽(肿瘤坏死因子与白介素-6等)。此外，星形胶质细胞也能分泌TNFα和IL-6。本实验结果表明LPS、TNFα能刺激星形中国病理生理杂志990625胶质细胞分泌NO，两者合用有明显的增强作用，这提示脑内感染时，由于内毒素与细胞因子的共同作用，脑内局部可形成大量的NO。此外NO也可进入血液中，引起机体内NO增强。脑内NO通过介导非肾上腺非乙酰胆碱神经(nonadrenergic-noncholinergic, NANC)而起神经递质作用，而体内NO的大量增高可引起血管扩张，血压下降，加重内毒素反应。这表明内毒素及败血症休克的发生发展可能与NO大量的生成有一定的关系。
* 国家自然科学基金资助(No.39600197)
(1998年6月1日收稿，1999年4月30日修回), http://www.100md.com