baxα加强表达促进鼻咽癌细胞CNE2株凋亡*
作者：张清秀 朱振宇 孔庆瑜 周世豪 马涧泉
单位：张清秀 朱振宇 周世豪 马涧泉 中山医科大学生化教研室；孔庆瑜 中山医科大学附属第一医院(广州 510089)
关键词：细胞；凋亡；鼻咽肿瘤；基因表达
中国病理生理杂志990607 摘 要 目的：研究凋亡基因加强表达对鼻咽癌细胞株程序性死亡的影响。方法：用脂质体转染法将已构建的pSFFV-baxα-neo质粒导入CNE2细胞中，RT-PCR， 间接免疫荧光检测转染后CNE2中baxα表达水平；流式细胞术及电泳检测凋亡。结果：脂质体转染质粒pSFFV-baxα-neo入CNE2细胞，RT-PCR随机检测6个阳性克隆中baxα的mRNA表达水平明显提高，间接免疫荧光检测CNE2-baxα中Baxα强阳性(高)、中强阳性(中)以及弱阳性(低)表达。流式细胞仪分析细胞凋亡率显示高、中表达Baxα的细胞株凋亡率为11.3%、7.9%，显著高于对照株5.8%的凋亡率(P<0.001)，低表达Baxα的细胞株凋亡率为6.1%，与对照株无明显差异(P>0.05)。结论：Baxα在CNE2中促进无血清诱导的细胞凋亡。
, 百拇医药
Overexpression of the death-promoting gene baxα enhances apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2
ZHANG Qing-Xiu1, ZHU Zhen-Yu1, KONG Qin -Yu2, ZHOU Shi-Hao1, MA Jian-Quan1
1. Dept. of Biochemistry, 2. First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510089)
Abstract AIM:To investigate the effect of baxα overexpression on nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE2 in vitro. METHODS:Plasmids pSFFV-baxα-neo were transfected into CNE2 cell in liposome. RESULTS：Levels of baxα were very high in six clones randomly which were assayed with RT-PCR.Strong positive (high), medium-strong positive (medium) and weak-positive (low) Baxα expression in the CNE2-baxα cell line by indirect immunoflourescence staining. After serum deprivation for 48 h,the apoptotic rates of high, medium expression of baxα were 11.3%, 7.9% respectiviely, significantly higher than that of control cell line transfected with empty vector 5.8% (P<0.001). The apoptotic rate of the cell line with low Baxα expression is 6.1%. There was less significant difference compared with control cell line (P>0.05).CONCLUSION：Baxα enhances the serum-deprivation induced apoptosis in CNE2 cell line.
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MeSH Cell; Apoptosis; Nasopharyngeal neoplasms; Gene expression
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的发生密切相关[1]。CNE2是从鼻咽癌活检组织中分离出来的EB病毒阳性的低分化鳞癌细胞株[2]经体外多年传代后，细胞中仍有EBV基因存在，包括EBNA1，LMP1和EBERs基因等。其中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)可引起上皮细胞发生恶性转化[3]。LMP1蛋白在30%～65%的鼻咽癌中可检测到。Bcl-2作为一种促进细胞生存的蛋白，通常也伴随LMP1一起出现在EBV阳性的鼻咽癌细胞中[4]。Lu等认为bcl-2和LMP1的共表达可能在EBV相关的上皮细胞转化过程中起着互补作用[5]。1993年发现的Bax蛋白是一种促进细胞凋亡的蛋白，并可抑制肿瘤的发生，它与bcl-2形成异二聚体并自身形成同二聚体可拮抗bcl-2的作用[6]。
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本研究将baxα基因导入CNE2细胞使其加强表达以观察它拮抗bcl-2的程度和对CNE2细胞凋亡的效应。
材料与方法
一、材料来源：
1.质粒pSFFV-baxα-neo由本研究室构建[9]。
2.细胞株：人低分化鼻咽癌细胞株CNE2，由中山医科大学肿瘤防治中心提供。
3.酶及主要试剂：DOTAP脂质体转染试剂盒，购自德国宝灵曼公司：兔抗人Bax抗体，美国Dako产品；FITC-羊抗兔IgG，胎牛血清购自北京天象人公司；禽源性(AMV)逆转录酶，RNasin，Taq酶为美国promega公司产品。
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二、方法：
1.细胞培养及凋亡的诱导：CNE2细胞培养于RPMI1640+10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)培养液中，5% CO2，37℃贴壁培养，按常规方法，隔天胰酶消化、分瓶，传代培养，待细胞长至7成满，用于转染。RPMI1640不加FCS诱导CNE2细胞凋亡48 h后，收集细胞。
2.基因转染：参照试剂盒说明书制备质粒DNA与DOTAP混合溶液；0.25%胰酶消化7成满CNE2细胞数分钟，加入5 mL培养液，吹打成单个细胞，与DNA/DOTAP混合液混匀，置CO2培养箱中保温6 h，用新鲜的含G418 250 μg/mL选择培养液置换原培养液，保温细胞过夜。3～7 d换1次选择培养基，1周后改用125 μg/mL G418维持常规培养。
3.RT-PCR：参照文献[7]，收集5×106细胞抽提细胞总RNA以Oligo(dT)15为引物合成第一条cDNA， 进一步PCR，热循环条件为94℃变性2 min，再经94℃ 40 s，60℃ 60 s， 70 ℃ 40 s。共30 次循环，以β-actin作为内参照。
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4.间接免疫荧光检测法：参照文献[5]，转染后的细胞传代时，将洁净消毒的盖玻片置于培养皿中与传代细胞一起培养过液，第2 d取出长满细胞的盖玻片，PBS洗1次，-10℃甲醇固定5 min，空气中干燥，1.5%牛血清白蛋白的PBS保温标本20 min，一抗(兔抗人Bax抗体0.1 μg/mL)37℃保温60 min，PBS洗3次，每次5 min。FTTC-羊抗兔IgG的二抗保温(10μg/mL) 45 min，PBS洗3次，荧光显微镜观察，拍照记录。
5.流式细胞仪及琼脂糖凝胶电泳细胞凋亡：250 g离心收集培养细胞，约1×105个制成单细胞悬液，PBS洗3次，70%冷乙醇固定，4℃保存过夜，1%碘化丙锭染色30 min，流式细胞仪检测，激光波长488 nm；琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡方法参照文献[8]。
6.统计处理用χ2检验。
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结果
一、重组质粒pSFFV-baxα-neo导入CNE2细胞：
脂质体转染法将baxα cDNA导入CNE2细胞，以导入空载质粒pSFFV-neo的CNE2-Vec为对照，筛选1周后，第10 d长出独立的具有新霉素抗性的CNE2克隆。
二、RT-PCR在mRNA水平检测baxα的表达暨阳性克隆的鉴定：
1.转染前检测CNE2细胞中baxα的表达：抽提CNE2细胞总RNA，RT-PCR扩增的电泳结果(见图1a)，图中所示，培养的CNE2细胞mRNA水平检测不到baxα的表达。
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Fig 1 RT-PCR analysis of baxα expression in CNE2, CNE2-baxα
(a) 1:DNA marker; 2,3,4: 246bp of β-actin as control; 5, 6, 7: baxα in CNE2 (negative)
(b) 1: DNA marker; 2,3, 4: 246bp of β-actin as control; 5, 6,7, 8, 9, 10: 323bp of baxα in six positive clones of CNE2-baxα
图1 RT-PCR分析CNE2、CNE2-baxα中baxα的表达
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2.转染后CNE2-baxα的表达，取随机的6个阳性克隆细胞抽提总RNA， RT-PCR扩增，电泳结果(见图1b)。
结果表明转染前CNE2细胞中baxα在mRNA水平检测不到，转染后的阳性克隆CNE2-baxα中，Baxα得到了加强表达。
三、蛋白质水平检测baxα的表达：
如图2所示，有的克隆Baxα表达量为强阳性(高)，有的克隆表达量为中等强度(中)，有的克隆baxα表达量弱阳性(低)，而对照CNE2-Vec细胞株没有表达。
Fig2 Indirect immunoflourescence staining of Baxα in representative cells
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(a) strong positive expression of Baxα in clone CNE2-baxα Ⅰ(×200)
(b medium positive expression of Baxα in clone CNE2-baxα Ⅱ(×100)
(c) weak positive expression of Baxα in clone CNE2-baxd Ⅲ(×200)
(d) negative expression of Baxα in clone CNE2-Vec(×200)
图2 各细胞株中Baxα间接免疫荧光染色
四、baxα加强表达对鼻咽癌CNE2细胞凋亡效应检测：
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1.流式细胞仪分析细胞凋亡率：无血清诱导凋亡48 h后，乙醇固定，碘化丙锭染色检测凋亡率，结果见表1。
表1 转染后不同CNE2细胞株的凋亡率
Tab 1 Apoptotic rates of different CNE2 cell lines after being transfected
CNE2-baxαⅠ(high)
CNE2-baxαⅡ(high)
CNE2-baxαⅢ(high)
CNE2-Vec
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Cell number
9 902
4 564
6 768
7 569
Apoptotic rate(%)
11.3*
7.9*
6.1
5.8
*P<0.001, vs CNE2-Vec
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表1结果显示高、中表达Baxα细胞株凋亡均高于导入空载质粒的细胞株CNE2-Vec差异非常显著(P<0.001)。低表达Baxα的细胞株则与转染空载质粒CNE2-Vec的凋亡率之间无明显差异(P>0.05)。
2.梯状DNA电泳分析：Baxα表达量不同的四种细胞，经无血清诱导培养48 h后，抽提4种细胞DNA，电泳结果如图3。
Fig 3 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA fragmentation in cells undergoing apoptosis
1: DNA marker; 2: CNE2-Vec; 3: CNE2-baxαⅢ; 4: CNE2-baxαⅡ; 5: CNE2-baxα Ⅰ
, 百拇医药
图3 凋亡细胞NDA片段化电泳分析图
图3显示：经无血清诱导凋亡培养48 h后，转染空载质粒的CNE2-Vec细胞DNA呈涂布状，表现为坏死，而其余3种Baxα表达阳性的细胞克隆呈现典型的凋亡DNA梯形带。
讨论
Oltvai等[6]在研究bcl-2与其他蛋白质相互作用时发现了Bax，Bax有3种形式α、β、γ，以Baxα研究较多。Bax基因和bcl-2基因具有40%同源性，但作用却与bcl-2基因相反，当Baxα大量表达，bcl-2相对量较少时，Bax与bcl-2形成异源二聚体或自身形成同源二聚体启动细胞凋亡。在EBV阳性的B细胞系中的过表达，可降低细胞的分裂生长速度，细胞凋亡率显著上升，说明Baxα在EBV阳性的B细胞系中一定程度上拮抗了bcl-2的作用[9]。从本实验结果来看，外源baxα基因的导入，使得baxα在EBV阳性的上皮细胞系CNE2细胞中加强表达；不同的阳性克隆中，Baxα表达量不同，对细胞凋亡的作用也不一样。无血清诱导条件下，Baxα表达高的CNE2细胞凋亡率明显高于表达低的细胞，Baxα表达低的细胞株与转染空载质粒的细胞凋亡率无明显差异，但总体水平来说细胞凋亡率不高。而导入bax前后bcl-2表达量没有改变(另文报道)。说明低分化鳞癌CNE2细胞中Bax与bcl-2相对量的高低对细胞作用效应不同，Bax的高表达只能部分提高凋亡率。
, 百拇医药
细胞凋亡受到抑制可能是肿瘤发生的重要原因[7]。实验证明CNE2细胞中有EBV病毒LMP1基因和LMP1蛋白存在；在人的B细胞系，EB病毒LMP1抗原通过诱导bcl-2的表达抑制凋亡，而在上皮细胞中LMP1并不诱导bcl-2表达。免疫组化分析bcl-2存在于80%鼻咽癌细胞组织中，特别是EBV密切相关的低分化的鼻咽癌组织中，LMP1阳性鼻咽癌细胞中，67%为bcl-2阳性[5]，因而提示EBV对上皮细胞的感染，一方面导致LMP1在上皮靶细胞的表达促进细胞生存，另一方面通过独立于病毒的途径bcl-2被上调保护细胞不发生凋亡。bcl-2与LMP1在抑制凋亡的过程中起着互补作用[5]。Bax与bcl-2均是p53作用的下游基因，野生型p53作用于bax基因的启动子激活bax的表达并抑制bcl-2的表达[10]，bax可拮抗bcl-2的促细胞生存作用。本实验的结果证明bcl-2在EBV感染的上皮细胞中只是起部分作用，Bax表达只能部分提高细胞的凋亡率，而对LMP1的作用须从其他途径抑制。
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* 国家教委博士点基金课题
参考文献
1 Henle W, Henle, G, Burtin P, et al. Antibodies to Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma, other head and neck neoplasmas and control group. J Natl Can Insti, 1970, 44:225.
2 谷淑燕，赵之平，曾 毅，等.从低分化鼻咽癌病人建立鼻咽癌上皮细胞株.癌症，1983，2：70.
3 李宝民，刘振声，纪志武，等.Epstein-Bar病毒反义LMP1基因对鼻咽癌细胞CNE2株生长的抑制.病毒学报，1996，12：330.
, http://www.100md.com
4 Lu Q L, Elin G, Lucas S, et al. bcl-2 proto-oncogene expression in Epstein-Barr virus-associtaed nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer, 1993, 53:29.
5 Lu JJ, Chen JY, Hsu TY, et al. Cooperative interaction between bcl-2 and Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 in the growth transformation of human epithelial cells. J Gen Virol, 1997, 78:2975.
6 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, bax that accelerates programmed cell death. Cell, 1993, 74:609.
, 百拇医药
7 Bargou RC, Daniel PJ, Mapara MY, et al. Expression of the bcl-2 gene family in normal and malignant breast tissue:Low baxα expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int J Cancer, 1995, 60:854.
8 Yan G, Lin S, Win IR, et al. Activation of muscarinic cholinergic receptors blocks apoptosis of cultured cerebellar granule neurons. Mol Pharmacol, 1995, 47:248.
9 张清秀，朱振宇，马涧泉.Bax加强表达对Raji细胞程序性死亡效应.中山医科大学学报，1998，19：101.
10 Miyashita T, Read JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell, 1995, 80:293.
(1998年9月29日收稿，1998年12月30日修回), 百拇医药
单位：张清秀 朱振宇 周世豪 马涧泉 中山医科大学生化教研室；孔庆瑜 中山医科大学附属第一医院(广州 510089)
关键词：细胞；凋亡；鼻咽肿瘤；基因表达
中国病理生理杂志990607 摘 要 目的：研究凋亡基因加强表达对鼻咽癌细胞株程序性死亡的影响。方法：用脂质体转染法将已构建的pSFFV-baxα-neo质粒导入CNE2细胞中，RT-PCR， 间接免疫荧光检测转染后CNE2中baxα表达水平；流式细胞术及电泳检测凋亡。结果：脂质体转染质粒pSFFV-baxα-neo入CNE2细胞，RT-PCR随机检测6个阳性克隆中baxα的mRNA表达水平明显提高，间接免疫荧光检测CNE2-baxα中Baxα强阳性(高)、中强阳性(中)以及弱阳性(低)表达。流式细胞仪分析细胞凋亡率显示高、中表达Baxα的细胞株凋亡率为11.3%、7.9%，显著高于对照株5.8%的凋亡率(P<0.001)，低表达Baxα的细胞株凋亡率为6.1%，与对照株无明显差异(P>0.05)。结论：Baxα在CNE2中促进无血清诱导的细胞凋亡。
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Overexpression of the death-promoting gene baxα enhances apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2
ZHANG Qing-Xiu1, ZHU Zhen-Yu1, KONG Qin -Yu2, ZHOU Shi-Hao1, MA Jian-Quan1
1. Dept. of Biochemistry, 2. First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510089)
Abstract AIM:To investigate the effect of baxα overexpression on nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE2 in vitro. METHODS:Plasmids pSFFV-baxα-neo were transfected into CNE2 cell in liposome. RESULTS：Levels of baxα were very high in six clones randomly which were assayed with RT-PCR.Strong positive (high), medium-strong positive (medium) and weak-positive (low) Baxα expression in the CNE2-baxα cell line by indirect immunoflourescence staining. After serum deprivation for 48 h,the apoptotic rates of high, medium expression of baxα were 11.3%, 7.9% respectiviely, significantly higher than that of control cell line transfected with empty vector 5.8% (P<0.001). The apoptotic rate of the cell line with low Baxα expression is 6.1%. There was less significant difference compared with control cell line (P>0.05).CONCLUSION：Baxα enhances the serum-deprivation induced apoptosis in CNE2 cell line.
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MeSH Cell; Apoptosis; Nasopharyngeal neoplasms; Gene expression
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的发生密切相关[1]。CNE2是从鼻咽癌活检组织中分离出来的EB病毒阳性的低分化鳞癌细胞株[2]经体外多年传代后，细胞中仍有EBV基因存在，包括EBNA1，LMP1和EBERs基因等。其中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)可引起上皮细胞发生恶性转化[3]。LMP1蛋白在30%～65%的鼻咽癌中可检测到。Bcl-2作为一种促进细胞生存的蛋白，通常也伴随LMP1一起出现在EBV阳性的鼻咽癌细胞中[4]。Lu等认为bcl-2和LMP1的共表达可能在EBV相关的上皮细胞转化过程中起着互补作用[5]。1993年发现的Bax蛋白是一种促进细胞凋亡的蛋白，并可抑制肿瘤的发生，它与bcl-2形成异二聚体并自身形成同二聚体可拮抗bcl-2的作用[6]。
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本研究将baxα基因导入CNE2细胞使其加强表达以观察它拮抗bcl-2的程度和对CNE2细胞凋亡的效应。
材料与方法
一、材料来源：
1.质粒pSFFV-baxα-neo由本研究室构建[9]。
2.细胞株：人低分化鼻咽癌细胞株CNE2，由中山医科大学肿瘤防治中心提供。
3.酶及主要试剂：DOTAP脂质体转染试剂盒，购自德国宝灵曼公司：兔抗人Bax抗体，美国Dako产品；FITC-羊抗兔IgG，胎牛血清购自北京天象人公司；禽源性(AMV)逆转录酶，RNasin，Taq酶为美国promega公司产品。
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二、方法：
1.细胞培养及凋亡的诱导：CNE2细胞培养于RPMI1640+10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)培养液中，5% CO2，37℃贴壁培养，按常规方法，隔天胰酶消化、分瓶，传代培养，待细胞长至7成满，用于转染。RPMI1640不加FCS诱导CNE2细胞凋亡48 h后，收集细胞。
2.基因转染：参照试剂盒说明书制备质粒DNA与DOTAP混合溶液；0.25%胰酶消化7成满CNE2细胞数分钟，加入5 mL培养液，吹打成单个细胞，与DNA/DOTAP混合液混匀，置CO2培养箱中保温6 h，用新鲜的含G418 250 μg/mL选择培养液置换原培养液，保温细胞过夜。3～7 d换1次选择培养基，1周后改用125 μg/mL G418维持常规培养。
3.RT-PCR：参照文献[7]，收集5×106细胞抽提细胞总RNA以Oligo(dT)15为引物合成第一条cDNA， 进一步PCR，热循环条件为94℃变性2 min，再经94℃ 40 s，60℃ 60 s， 70 ℃ 40 s。共30 次循环，以β-actin作为内参照。
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4.间接免疫荧光检测法：参照文献[5]，转染后的细胞传代时，将洁净消毒的盖玻片置于培养皿中与传代细胞一起培养过液，第2 d取出长满细胞的盖玻片，PBS洗1次，-10℃甲醇固定5 min，空气中干燥，1.5%牛血清白蛋白的PBS保温标本20 min，一抗(兔抗人Bax抗体0.1 μg/mL)37℃保温60 min，PBS洗3次，每次5 min。FTTC-羊抗兔IgG的二抗保温(10μg/mL) 45 min，PBS洗3次，荧光显微镜观察，拍照记录。
5.流式细胞仪及琼脂糖凝胶电泳细胞凋亡：250 g离心收集培养细胞，约1×105个制成单细胞悬液，PBS洗3次，70%冷乙醇固定，4℃保存过夜，1%碘化丙锭染色30 min，流式细胞仪检测，激光波长488 nm；琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡方法参照文献[8]。
6.统计处理用χ2检验。
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结果
一、重组质粒pSFFV-baxα-neo导入CNE2细胞：
脂质体转染法将baxα cDNA导入CNE2细胞，以导入空载质粒pSFFV-neo的CNE2-Vec为对照，筛选1周后，第10 d长出独立的具有新霉素抗性的CNE2克隆。
二、RT-PCR在mRNA水平检测baxα的表达暨阳性克隆的鉴定：
1.转染前检测CNE2细胞中baxα的表达：抽提CNE2细胞总RNA，RT-PCR扩增的电泳结果(见图1a)，图中所示，培养的CNE2细胞mRNA水平检测不到baxα的表达。
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Fig 1 RT-PCR analysis of baxα expression in CNE2, CNE2-baxα
(a) 1:DNA marker; 2,3,4: 246bp of β-actin as control; 5, 6, 7: baxα in CNE2 (negative)
(b) 1: DNA marker; 2,3, 4: 246bp of β-actin as control; 5, 6,7, 8, 9, 10: 323bp of baxα in six positive clones of CNE2-baxα
图1 RT-PCR分析CNE2、CNE2-baxα中baxα的表达
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2.转染后CNE2-baxα的表达，取随机的6个阳性克隆细胞抽提总RNA， RT-PCR扩增，电泳结果(见图1b)。
结果表明转染前CNE2细胞中baxα在mRNA水平检测不到，转染后的阳性克隆CNE2-baxα中，Baxα得到了加强表达。
三、蛋白质水平检测baxα的表达：
如图2所示，有的克隆Baxα表达量为强阳性(高)，有的克隆表达量为中等强度(中)，有的克隆baxα表达量弱阳性(低)，而对照CNE2-Vec细胞株没有表达。
Fig2 Indirect immunoflourescence staining of Baxα in representative cells
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(a) strong positive expression of Baxα in clone CNE2-baxα Ⅰ(×200)
(b medium positive expression of Baxα in clone CNE2-baxα Ⅱ(×100)
(c) weak positive expression of Baxα in clone CNE2-baxd Ⅲ(×200)
(d) negative expression of Baxα in clone CNE2-Vec(×200)
图2 各细胞株中Baxα间接免疫荧光染色
四、baxα加强表达对鼻咽癌CNE2细胞凋亡效应检测：
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1.流式细胞仪分析细胞凋亡率：无血清诱导凋亡48 h后，乙醇固定，碘化丙锭染色检测凋亡率，结果见表1。
表1 转染后不同CNE2细胞株的凋亡率
Tab 1 Apoptotic rates of different CNE2 cell lines after being transfected
CNE2-baxαⅠ(high)
CNE2-baxαⅡ(high)
CNE2-baxαⅢ(high)
CNE2-Vec
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Cell number
9 902
4 564
6 768
7 569
Apoptotic rate(%)
11.3*
7.9*
6.1
5.8
*P<0.001, vs CNE2-Vec
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表1结果显示高、中表达Baxα细胞株凋亡均高于导入空载质粒的细胞株CNE2-Vec差异非常显著(P<0.001)。低表达Baxα的细胞株则与转染空载质粒CNE2-Vec的凋亡率之间无明显差异(P>0.05)。
2.梯状DNA电泳分析：Baxα表达量不同的四种细胞，经无血清诱导培养48 h后，抽提4种细胞DNA，电泳结果如图3。
Fig 3 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA fragmentation in cells undergoing apoptosis
1: DNA marker; 2: CNE2-Vec; 3: CNE2-baxαⅢ; 4: CNE2-baxαⅡ; 5: CNE2-baxα Ⅰ
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图3 凋亡细胞NDA片段化电泳分析图
图3显示：经无血清诱导凋亡培养48 h后，转染空载质粒的CNE2-Vec细胞DNA呈涂布状，表现为坏死，而其余3种Baxα表达阳性的细胞克隆呈现典型的凋亡DNA梯形带。
讨论
Oltvai等[6]在研究bcl-2与其他蛋白质相互作用时发现了Bax，Bax有3种形式α、β、γ，以Baxα研究较多。Bax基因和bcl-2基因具有40%同源性，但作用却与bcl-2基因相反，当Baxα大量表达，bcl-2相对量较少时，Bax与bcl-2形成异源二聚体或自身形成同源二聚体启动细胞凋亡。在EBV阳性的B细胞系中的过表达，可降低细胞的分裂生长速度，细胞凋亡率显著上升，说明Baxα在EBV阳性的B细胞系中一定程度上拮抗了bcl-2的作用[9]。从本实验结果来看，外源baxα基因的导入，使得baxα在EBV阳性的上皮细胞系CNE2细胞中加强表达；不同的阳性克隆中，Baxα表达量不同，对细胞凋亡的作用也不一样。无血清诱导条件下，Baxα表达高的CNE2细胞凋亡率明显高于表达低的细胞，Baxα表达低的细胞株与转染空载质粒的细胞凋亡率无明显差异，但总体水平来说细胞凋亡率不高。而导入bax前后bcl-2表达量没有改变(另文报道)。说明低分化鳞癌CNE2细胞中Bax与bcl-2相对量的高低对细胞作用效应不同，Bax的高表达只能部分提高凋亡率。
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细胞凋亡受到抑制可能是肿瘤发生的重要原因[7]。实验证明CNE2细胞中有EBV病毒LMP1基因和LMP1蛋白存在；在人的B细胞系，EB病毒LMP1抗原通过诱导bcl-2的表达抑制凋亡，而在上皮细胞中LMP1并不诱导bcl-2表达。免疫组化分析bcl-2存在于80%鼻咽癌细胞组织中，特别是EBV密切相关的低分化的鼻咽癌组织中，LMP1阳性鼻咽癌细胞中，67%为bcl-2阳性[5]，因而提示EBV对上皮细胞的感染，一方面导致LMP1在上皮靶细胞的表达促进细胞生存，另一方面通过独立于病毒的途径bcl-2被上调保护细胞不发生凋亡。bcl-2与LMP1在抑制凋亡的过程中起着互补作用[5]。Bax与bcl-2均是p53作用的下游基因，野生型p53作用于bax基因的启动子激活bax的表达并抑制bcl-2的表达[10]，bax可拮抗bcl-2的促细胞生存作用。本实验的结果证明bcl-2在EBV感染的上皮细胞中只是起部分作用，Bax表达只能部分提高细胞的凋亡率，而对LMP1的作用须从其他途径抑制。
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* 国家教委博士点基金课题
参考文献
1 Henle W, Henle, G, Burtin P, et al. Antibodies to Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma, other head and neck neoplasmas and control group. J Natl Can Insti, 1970, 44:225.
2 谷淑燕，赵之平，曾 毅，等.从低分化鼻咽癌病人建立鼻咽癌上皮细胞株.癌症，1983，2：70.
3 李宝民，刘振声，纪志武，等.Epstein-Bar病毒反义LMP1基因对鼻咽癌细胞CNE2株生长的抑制.病毒学报，1996，12：330.
, http://www.100md.com
4 Lu Q L, Elin G, Lucas S, et al. bcl-2 proto-oncogene expression in Epstein-Barr virus-associtaed nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer, 1993, 53:29.
5 Lu JJ, Chen JY, Hsu TY, et al. Cooperative interaction between bcl-2 and Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 in the growth transformation of human epithelial cells. J Gen Virol, 1997, 78:2975.
6 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, bax that accelerates programmed cell death. Cell, 1993, 74:609.
, 百拇医药
7 Bargou RC, Daniel PJ, Mapara MY, et al. Expression of the bcl-2 gene family in normal and malignant breast tissue:Low baxα expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int J Cancer, 1995, 60:854.
8 Yan G, Lin S, Win IR, et al. Activation of muscarinic cholinergic receptors blocks apoptosis of cultured cerebellar granule neurons. Mol Pharmacol, 1995, 47:248.
9 张清秀，朱振宇，马涧泉.Bax加强表达对Raji细胞程序性死亡效应.中山医科大学学报，1998，19：101.
10 Miyashita T, Read JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell, 1995, 80:293.
(1998年9月29日收稿，1998年12月30日修回), 百拇医药