血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子对心肌细胞周期素和p27蛋白表达量的调节*
作者：袁 勇 许顶立 刘伊丽 贾满盈
单位：第一军医大学附属南方医院心内科(广州 510515)
关键词：细胞周期蛋白类；心肌；细胞周期；流式细胞术
血管紧张素 摘 要 目的：细胞周期素(cyclin)和CDK抑制蛋白(CKI)是对细胞周期起正性和负性调节作用的两类物质。p27蛋白是CKI的一种，主要对细胞外部促进或抑制增殖的信号起反应。本文观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血小板源生长因子(PDGF)对心肌细胞细胞周期素和p27蛋白表达量的影响。方法：培养的心肌细胞除血清24 h使其处于静止状态，加入AngⅡ10-6mol/L、PDGF-BB20 ng/mL后不同时间收集细胞，用碘化丙啶(PI)标记细胞DNA，以确定细胞所处的周期。用细胞周期素或p27蛋白的单抗和标记FITC的二抗标记细胞，用流式细胞仪测定被激发出的荧光量来测定细胞周期素和p27蛋白表达的相对量。结果：AngⅡ可促进细胞周期素的表达，但对p27蛋白的表达没有影响，不能促进心肌细胞增殖；PDGF明显促进心肌细胞细胞周期素的表达，也不能明显抑制p27的表达，也不能促进心肌细胞增殖。结论：细胞周期素的表达增加与心肌细胞能否进入细胞周期并不一致，p27蛋白是心肌细胞能否进入细胞周期并进行有丝分裂的重要调节因子
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Angiotensin Ⅱ and platelet derived growth factor regulate the expression of cyclins and cyclin dependent kinase inhibitor p27 in cardiac myocytes
YUAN Yong, XU Ding-Li, LIU Yi-Li, JIA Man-Ying
Department of Cardiology, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou (510515)
Abstract AIM: To investigate cell cycle distribution of cardiac myocytes(CM) and expression of cyclins and p27 (one of cyclin dependent kinase inhibitors) caused by angiotensin Ⅱ(AngⅡ) and platelet derived growth factor BB(PDGF-BB). METHODS: Cultured CMs were deprived of fetal calf serum for 24 hours to make quiescent. CMs were collected at different times after stimulation of AngⅡand PDGF-BB. Cell cycle distribution and expression of cyclins and p27 were determined with flow cytometer. RESULTS: AngⅡincreased expression of cyclins, but had no effects on expression of p27. PDGF could enhanced expression of cyclins significantly, but did not inhibit p27 expression. Both could not promote CM proliferation. CONCLUSION: Enhanced expression of cyclins was not correlated to progression of CM cell cycle. p27 inhibits CM progression through G1 to S phase and thus inhibited CM proliferation.
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MeSH Cyclins; Myocardium; Cell cycle; Flow cytometer
心肌细胞(cardiac myocyte,CM)数量的减少是心力衰竭产生和/或恶化的最主要的病理基础[1]。一般认为成年的哺乳动物心肌细胞属于终末分化细胞，很少或几乎不能进行有丝分裂，然而最近发现在成年急性和慢性心力衰竭动物模型以及心力衰竭患者心脏都观察到心肌细胞增殖的现象[2]，促进成熟心肌细胞再进入细胞周期将会对心衰起到有益的治疗作用[3]。寻找调控心肌细胞增殖信号转导的关键点，对促进心肌细胞的增殖将有非常重要的意义。
促进或抑制细胞增殖是通过促进或抑制细胞周期而实现的，细胞周期素(cyclin)和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor, CKI)是对细胞周期起正性和负性调节作用的两类物质[4]。p27蛋白是CKI的一种，在对肿瘤细胞的研究中发现：p27蛋白主要对细胞外部促进或抑制增殖的信号起反应，在静止细胞中p27蛋白具有相当高的表达，而在增殖细胞中表达却减低，提示p27蛋白可能是各种调节细胞增殖信号的关键性因子[5]。但是，p27蛋白和细胞周期素在心肌细胞中的作用目前尚不清楚。
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血管紧张素II(angiotensin Ⅱ, AngII)、血小板源生长因子BB(platelet derived growth factor BB, PDGF-BB)是体内存在的强有力的细胞因子，在心室重构中可能起重要作用。本研究以AngII和PDGF为代表，应用流式细胞仪(FCM)观察其对心肌细胞细胞周期素和p27蛋白表达的影响，说明在心室重构信号转导过程中p27和细胞周期素的重要作用。
材料与方法
(一)材料：AngⅡ、PDGF-BB、碘化丙啶(PI)购于美国Sigma 公司，DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国GIBCO公司，抗p27单克隆鼠抗人抗体(一抗)、抗cyclin A、cyclin D、cyclin E单克隆鼠抗人抗体(一抗)由美国哈佛大学麻省总医院病理科Dr.Wu惠赠，荧光标记羊抗鼠抗体(二抗)购于军事医学科学院，流式细胞仪Elite型(美国Coulter公司)。
, 百拇医药 (二)心肌细胞的培养及处理： 新生1 d Sprague-Dawley(SD)大鼠(由本院动物所提供)，无菌取出心室，0.06%胰蛋白酶37℃水浴中消化20 min，离心分离出细胞加2 mL培养液，置细胞悬液于深的玻璃平皿中，在37℃孵箱中静置，3 h后，非心肌细胞沉至平皿底贴壁，而心肌细胞仍在细胞悬液中，此时细胞悬液中心肌细胞比例大于95%，吸出细胞悬液，转入培养瓶中培养。实验所用细胞为培养3 d后的原代细胞。实验前24 h换成含1%FBS的DMEM。这种DMEM能使心肌细胞在一段时间内处于静止的非代谢状态，细胞数目稳定，这样可使用于实验的细胞处于同一生长水平。所有处理细胞的药品均先加在DMEM中，12 h给予更换。
(三)流式细胞仪双标法测定[6]：将培养的细胞收集起来，用注射器将细胞迅速注入4℃冷1%甲醛中，5 min后加入99%的甲醇30 min，然后将细胞加入到4℃的PBS液中，其中含0.1%(v/v) Triton-100和0.1%柠檬酸钠, 冰浴45 min，细胞分别加入特异的第一抗体抗p27或抗 cyclin A、cyclin D、cyclin E(鼠抗人)50 μL，空白(PBS 50μL)，室温放置2.5 h，用PBS 2 mL洗两次，加入异硫氰荧光素(FITC)标记的第二抗体50 μL(羊抗鼠)，37℃孵育30 min，空白对照中加入标记的二抗作为背景荧光。再加入RNA酶37℃水浴30 min除去RNA。加入PI染液，终浓度为20 μg/mL，暗处冰浴30 min。上机前用孔径40 μm的尼龙网过滤。
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PI和FITC被激发出的荧光互不影响，因此，根据PI所标记的DNA含量可以确定细胞所处的细胞周期，同时根据FITC被激发出的荧光量的多少来确定细胞中不同细胞周期素和p27蛋白表达的相对量。
(四)统计学处理：数据用均数±标准差(
)表示，两组之间用配对t检验，多组百分率比较用u检验。
结果
一、AngⅡ和PDGF-BB对心肌细胞细胞周期的影响：
静止的心肌细胞中加入AngⅡ、PDGF-BB，培养48h后上机检测，所有结果均由FCM随机软件处理得出，AngⅡ和PDGF-BB对CM细胞周期的影响如表1所示。
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表1 AngⅡ和PDGF-BB对心肌细胞细胞周期的影响
Tab 1 Effects of AngⅡ and PDGF-BB on CM cell
cycle distribution (,n=6)
Treatment
Cell cycle distribution
G0/1(%)
S(%)
G2/M(%)
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Control(Free FBS)
AngⅡ10-6 mol/L
PDGF 20 ng/mL
89.3±5.3
89.9±5.7
87.5±6.4
4.5±2.3
4.4±1.4
5.5±1.7
6.2±1.3
5.7±0.8
, 百拇医药
7.0±2.6
AngⅡ和PDGF-BB对静止的CM细胞周期没有影响，细胞主要仍处于G0-G1期，不能使CM通过G1期，越过G1期的限制点，与对照组(free FBS)相比没有明显的差异。
二、AngⅡ对心肌细胞中细胞周期素和p27表达的影响：
在静止的心肌细胞中cyclin D的表达量处于较高水平，加入Ang II 12 h后，升高幅度大约为50%，24 h后又降至静止水平。Cyclin E在静止的心肌细胞中表达量处于较低水平，加入Ang II 12 h后，未见明显升高，24h后升高至静止时的2.5倍，48h降至不到静止时的2倍。Cyclin A在加入Ang II后12 h即升高至静止时的3倍，很快又恢复至静止水平。然而，p27的表达则无明显变化。 表2 10-6 mol/L Ang II对心肌细胞中细胞周期素
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和p27蛋白表达的影响
Tab 2 Effect of 10-6mol/L Ang II on cyclins and
p27 expression in CMs (,n=6)
Cyclins/p27
Control(0h)
12h
24h
48h
, 百拇医药
Cyclin D
21.8±2.8
29.6±3.1*
22.4±4.1
18.8±5.4
Cyclin E
8.9±1.6
12.8±3.7
23.9±4.3**
16.2±2.6*
Cyclin A
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8.7±1.5
24.2±3.8**
6.8±2.5
8.6±2.8
p27
44.6±3.6
41.2±4.3
42.7±5.3
45.3±4.5
*P<0.05,** P<0.01, vs control group
Quiescent CMs were treated with 10-6mol/L Ang II for the indicated times and then subjected to immunostaining with specific anti-cyclins or p27 antibody. FITC-conjugated anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody, and then counterstained with PI. Proteins and cell cycle distribution were determined with flow cytometry. Each value shows the average fluorescence of positively stained cells
, 百拇医药
三、PDGF对心肌细胞中细胞周期素和p27表达的影响：
表3 PDGF对心肌细胞中细胞周期素和p27表达的影响
Tab 3 Effects of 20 ng/mL PDGF on cyclins and
p27 expression in CMs (,n=6)
Cyclin/p27
Control(0h)
12h
24h
, 百拇医药
48h
Cyclin D
21.8±2.8
44.6±4.3**
64.7±5.7**
60.5±4.6**
Cyclin E
8.9±1.6
20.4±3.8**
51.8±6.5**
10.6±2.4
, 百拇医药
Cyclin A
8.7±1.5
86.6±7.4**
96.5±8.5**
36.3±6.3**
p27
44.6±3.6
38.6±4.2
39.8±5.6
45.6±7.5
*P<0.05, ** P<0.01， vs control group
, 百拇医药
Quiescent CMs incubated for 12h or 24h or 48h in DMEM containing 20 ng/mL PDGF, then stained with antibody which labeled with FITC, counterstained with PI. Proteins and cell distribution were determined with flow cytometry. Each value shows the average fluorescence of positively stained cells
静止的心肌细胞中加入PDGF-BB12 h后，cyclin D和cyclin E的表达量开始升高，24 h时达峰值，cyclin D是基础状态的3倍多，cyclin E是基础状态的5倍多，48 h时cyclin D的表达仍处于较高水平，而cyclin E已恢复至基础水平。cyclin A在PDGF-BB作用12 h时，表达量是静止状态的10倍，在24 h时是静止状态的12倍，48 h时是静止状态的4倍。但PDGF-BB对心肌细胞p27的表达影响不大。
, 百拇医药
讨论
成熟的心肌细胞在正常情况下是不分裂的，然而有确切的实验证明，人或动物心肌细胞在缺血或超负荷等病理条件下都有增殖现象[7]。我们的实验表明培养的乳鼠心肌细胞在培养的前3 d数目不断增加，Ang II或PDGF-BB加入到含10%FBS的培养基中对心肌细胞的生长明显有促进作用，与Ang II和PDGF-BB对许多其它类型的细胞促生长作用相似。用含1%FBS的培养基继续培养24 h后，再加入Ang II或PDGF-BB，虽然细胞仍可搏动，但是细胞周期与对照组相比没有明显改变，不能促进细胞增殖。
细胞的增殖分化是通过细胞周期来完成的，细胞周期素与CDK组成合酶对细胞周期进展起促进作用，cyclin D和cyclin E是G1期主要的效应细胞周期素，cyclin A与DNA合成有关。Cyclin表达量的多少对心肌细胞的生长有非常重要的调节作用[4，8]。然而我们的结果表明，Ang II虽能使cyclin D、cyclin E和cyclin A的表达量有所升高，但其升高的幅度和持续的时间都不足以使心肌细胞通过G1期，这可能是Ang II不能促进心肌细胞增殖的原因之一。PDGF-BB也可使心肌细胞中各种cyclin的表达量均升高，升高的幅度和持续的时间比Ang II的作用强得多，但是仍然不能使心肌细胞越过G1期进入S期。说明cyclin的表达量与心肌细胞能否进入细胞周期是分离的，除了cyclin的表达量对心肌细胞周期起作用外，一定还有其它因素起作用。
, 百拇医药
本实验结果表明静止的心肌细胞中CDK抑制蛋白p27的表达即处于较高水平，加入Ang II后可使p27蛋白的表达稍有降低，在48h时p27蛋白的表达又回到静止水平，加入PDGF-BB后，p27蛋白的表达虽然大约降低了14%，由于p27蛋白的表达基础值较高，仍未能解除p27蛋白对cyclin-CDK合酶的抑制作用，因此，Ang II和PDGF-BB均不能促进心肌细胞通过G1末期限制点进入S期，也就不能促进心肌细胞增殖。
总之，细胞周期素的表达增加与心肌细胞能否进入细胞周期并不一致，p27蛋白是心肌细胞能否进入细胞周期并进行有丝分裂的重要调节因子，p27蛋白的表达量决定心肌细胞能否通过限制点。然而，细胞外刺激信号是如何调节p27蛋白的表达，以及细胞增殖所需p27蛋白表达下降的幅度均是需要进一步研究的重要课题。
* 国家自然科学基金资助(No 39770325)和军队回国人员启动基金资助
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参考文献
1 Yeh E. Life and death in the cardiovascular system. Circulation, 1997,95:782.
2 Quaini F, Cigola E, Lagrasta C, et al. End-stage cardiac failure in humans is coupled with the induction of proliferating cell nuclear antigen and nuclear mitotic division in ventricular myocytes. Circ Res, 1994, 75:1050.
3 Katz AM. Is heart failure an abnormality of myocardial cell growth? Cardiology, 1990, 77:346.
, 百拇医药
4 Gao CY, Zelenka PS. Cyclins, cyclin-dependent kinases and differentiation. Bioessays, 1997, 19:307.
5 Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, et al. p27Kip1, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev, 1994, 8:9.
6 Sindermann J, Weigel KA, Breithardt GA. simple method for the flow cytometric analysis of intracellular antigens in whole smooth muscle cells: quantification of cyclin-dependent kinase 2. J Immunol Methods, 1997, 202:205.
, 百拇医药
7 Li F, McNelis MR, Lustig K, et al. Hyperplasia and hypertrophy of chicken cardiac myocytes during posthatching development. Am J Physiol, 1997, 273:R518.
8 Grana X, Reddy EP. Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene, 1995, 11:211.
(1998年11月23日收稿， 1999年3月18日修回), http://www.100md.com
单位：第一军医大学附属南方医院心内科(广州 510515)
关键词：细胞周期蛋白类；心肌；细胞周期；流式细胞术
血管紧张素 摘 要 目的：细胞周期素(cyclin)和CDK抑制蛋白(CKI)是对细胞周期起正性和负性调节作用的两类物质。p27蛋白是CKI的一种，主要对细胞外部促进或抑制增殖的信号起反应。本文观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血小板源生长因子(PDGF)对心肌细胞细胞周期素和p27蛋白表达量的影响。方法：培养的心肌细胞除血清24 h使其处于静止状态，加入AngⅡ10-6mol/L、PDGF-BB20 ng/mL后不同时间收集细胞，用碘化丙啶(PI)标记细胞DNA，以确定细胞所处的周期。用细胞周期素或p27蛋白的单抗和标记FITC的二抗标记细胞，用流式细胞仪测定被激发出的荧光量来测定细胞周期素和p27蛋白表达的相对量。结果：AngⅡ可促进细胞周期素的表达，但对p27蛋白的表达没有影响，不能促进心肌细胞增殖；PDGF明显促进心肌细胞细胞周期素的表达，也不能明显抑制p27的表达，也不能促进心肌细胞增殖。结论：细胞周期素的表达增加与心肌细胞能否进入细胞周期并不一致，p27蛋白是心肌细胞能否进入细胞周期并进行有丝分裂的重要调节因子
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Angiotensin Ⅱ and platelet derived growth factor regulate the expression of cyclins and cyclin dependent kinase inhibitor p27 in cardiac myocytes
YUAN Yong, XU Ding-Li, LIU Yi-Li, JIA Man-Ying
Department of Cardiology, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou (510515)
Abstract AIM: To investigate cell cycle distribution of cardiac myocytes(CM) and expression of cyclins and p27 (one of cyclin dependent kinase inhibitors) caused by angiotensin Ⅱ(AngⅡ) and platelet derived growth factor BB(PDGF-BB). METHODS: Cultured CMs were deprived of fetal calf serum for 24 hours to make quiescent. CMs were collected at different times after stimulation of AngⅡand PDGF-BB. Cell cycle distribution and expression of cyclins and p27 were determined with flow cytometer. RESULTS: AngⅡincreased expression of cyclins, but had no effects on expression of p27. PDGF could enhanced expression of cyclins significantly, but did not inhibit p27 expression. Both could not promote CM proliferation. CONCLUSION: Enhanced expression of cyclins was not correlated to progression of CM cell cycle. p27 inhibits CM progression through G1 to S phase and thus inhibited CM proliferation.
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MeSH Cyclins; Myocardium; Cell cycle; Flow cytometer
心肌细胞(cardiac myocyte,CM)数量的减少是心力衰竭产生和/或恶化的最主要的病理基础[1]。一般认为成年的哺乳动物心肌细胞属于终末分化细胞，很少或几乎不能进行有丝分裂，然而最近发现在成年急性和慢性心力衰竭动物模型以及心力衰竭患者心脏都观察到心肌细胞增殖的现象[2]，促进成熟心肌细胞再进入细胞周期将会对心衰起到有益的治疗作用[3]。寻找调控心肌细胞增殖信号转导的关键点，对促进心肌细胞的增殖将有非常重要的意义。
促进或抑制细胞增殖是通过促进或抑制细胞周期而实现的，细胞周期素(cyclin)和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor, CKI)是对细胞周期起正性和负性调节作用的两类物质[4]。p27蛋白是CKI的一种，在对肿瘤细胞的研究中发现：p27蛋白主要对细胞外部促进或抑制增殖的信号起反应，在静止细胞中p27蛋白具有相当高的表达，而在增殖细胞中表达却减低，提示p27蛋白可能是各种调节细胞增殖信号的关键性因子[5]。但是，p27蛋白和细胞周期素在心肌细胞中的作用目前尚不清楚。
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血管紧张素II(angiotensin Ⅱ, AngII)、血小板源生长因子BB(platelet derived growth factor BB, PDGF-BB)是体内存在的强有力的细胞因子，在心室重构中可能起重要作用。本研究以AngII和PDGF为代表，应用流式细胞仪(FCM)观察其对心肌细胞细胞周期素和p27蛋白表达的影响，说明在心室重构信号转导过程中p27和细胞周期素的重要作用。
材料与方法
(一)材料：AngⅡ、PDGF-BB、碘化丙啶(PI)购于美国Sigma 公司，DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国GIBCO公司，抗p27单克隆鼠抗人抗体(一抗)、抗cyclin A、cyclin D、cyclin E单克隆鼠抗人抗体(一抗)由美国哈佛大学麻省总医院病理科Dr.Wu惠赠，荧光标记羊抗鼠抗体(二抗)购于军事医学科学院，流式细胞仪Elite型(美国Coulter公司)。
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(三)流式细胞仪双标法测定[6]：将培养的细胞收集起来，用注射器将细胞迅速注入4℃冷1%甲醛中，5 min后加入99%的甲醇30 min，然后将细胞加入到4℃的PBS液中，其中含0.1%(v/v) Triton-100和0.1%柠檬酸钠, 冰浴45 min，细胞分别加入特异的第一抗体抗p27或抗 cyclin A、cyclin D、cyclin E(鼠抗人)50 μL，空白(PBS 50μL)，室温放置2.5 h，用PBS 2 mL洗两次，加入异硫氰荧光素(FITC)标记的第二抗体50 μL(羊抗鼠)，37℃孵育30 min，空白对照中加入标记的二抗作为背景荧光。再加入RNA酶37℃水浴30 min除去RNA。加入PI染液，终浓度为20 μg/mL，暗处冰浴30 min。上机前用孔径40 μm的尼龙网过滤。
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PI和FITC被激发出的荧光互不影响，因此，根据PI所标记的DNA含量可以确定细胞所处的细胞周期，同时根据FITC被激发出的荧光量的多少来确定细胞中不同细胞周期素和p27蛋白表达的相对量。
(四)统计学处理：数据用均数±标准差(
)表示，两组之间用配对t检验，多组百分率比较用u检验。结果
一、AngⅡ和PDGF-BB对心肌细胞细胞周期的影响：
静止的心肌细胞中加入AngⅡ、PDGF-BB，培养48h后上机检测，所有结果均由FCM随机软件处理得出，AngⅡ和PDGF-BB对CM细胞周期的影响如表1所示。
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表1 AngⅡ和PDGF-BB对心肌细胞细胞周期的影响
Tab 1 Effects of AngⅡ and PDGF-BB on CM cell
cycle distribution (
,n=6)Treatment
Cell cycle distribution
G0/1(%)
S(%)
G2/M(%)
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Control(Free FBS)
AngⅡ10-6 mol/L
PDGF 20 ng/mL
89.3±5.3
89.9±5.7
87.5±6.4
4.5±2.3
4.4±1.4
5.5±1.7
6.2±1.3
5.7±0.8
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7.0±2.6
AngⅡ和PDGF-BB对静止的CM细胞周期没有影响，细胞主要仍处于G0-G1期，不能使CM通过G1期，越过G1期的限制点，与对照组(free FBS)相比没有明显的差异。
二、AngⅡ对心肌细胞中细胞周期素和p27表达的影响：
在静止的心肌细胞中cyclin D的表达量处于较高水平，加入Ang II 12 h后，升高幅度大约为50%，24 h后又降至静止水平。Cyclin E在静止的心肌细胞中表达量处于较低水平，加入Ang II 12 h后，未见明显升高，24h后升高至静止时的2.5倍，48h降至不到静止时的2倍。Cyclin A在加入Ang II后12 h即升高至静止时的3倍，很快又恢复至静止水平。然而，p27的表达则无明显变化。 表2 10-6 mol/L Ang II对心肌细胞中细胞周期素
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和p27蛋白表达的影响
Tab 2 Effect of 10-6mol/L Ang II on cyclins and
p27 expression in CMs (
,n=6)Cyclins/p27
Control(0h)
12h
24h
48h
, 百拇医药
Cyclin D
21.8±2.8
29.6±3.1*
22.4±4.1
18.8±5.4
Cyclin E
8.9±1.6
12.8±3.7
23.9±4.3**
16.2±2.6*
Cyclin A
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8.7±1.5
24.2±3.8**
6.8±2.5
8.6±2.8
p27
44.6±3.6
41.2±4.3
42.7±5.3
45.3±4.5
*P<0.05,** P<0.01, vs control group
Quiescent CMs were treated with 10-6mol/L Ang II for the indicated times and then subjected to immunostaining with specific anti-cyclins or p27 antibody. FITC-conjugated anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody, and then counterstained with PI. Proteins and cell cycle distribution were determined with flow cytometry. Each value shows the average fluorescence of positively stained cells
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三、PDGF对心肌细胞中细胞周期素和p27表达的影响：
表3 PDGF对心肌细胞中细胞周期素和p27表达的影响
Tab 3 Effects of 20 ng/mL PDGF on cyclins and
p27 expression in CMs (
,n=6)Cyclin/p27
Control(0h)
12h
24h
, 百拇医药
48h
Cyclin D
21.8±2.8
44.6±4.3**
64.7±5.7**
60.5±4.6**
Cyclin E
8.9±1.6
20.4±3.8**
51.8±6.5**
10.6±2.4
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Cyclin A
8.7±1.5
86.6±7.4**
96.5±8.5**
36.3±6.3**
p27
44.6±3.6
38.6±4.2
39.8±5.6
45.6±7.5
*P<0.05, ** P<0.01， vs control group
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Quiescent CMs incubated for 12h or 24h or 48h in DMEM containing 20 ng/mL PDGF, then stained with antibody which labeled with FITC, counterstained with PI. Proteins and cell distribution were determined with flow cytometry. Each value shows the average fluorescence of positively stained cells
静止的心肌细胞中加入PDGF-BB12 h后，cyclin D和cyclin E的表达量开始升高，24 h时达峰值，cyclin D是基础状态的3倍多，cyclin E是基础状态的5倍多，48 h时cyclin D的表达仍处于较高水平，而cyclin E已恢复至基础水平。cyclin A在PDGF-BB作用12 h时，表达量是静止状态的10倍，在24 h时是静止状态的12倍，48 h时是静止状态的4倍。但PDGF-BB对心肌细胞p27的表达影响不大。
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讨论
成熟的心肌细胞在正常情况下是不分裂的，然而有确切的实验证明，人或动物心肌细胞在缺血或超负荷等病理条件下都有增殖现象[7]。我们的实验表明培养的乳鼠心肌细胞在培养的前3 d数目不断增加，Ang II或PDGF-BB加入到含10%FBS的培养基中对心肌细胞的生长明显有促进作用，与Ang II和PDGF-BB对许多其它类型的细胞促生长作用相似。用含1%FBS的培养基继续培养24 h后，再加入Ang II或PDGF-BB，虽然细胞仍可搏动，但是细胞周期与对照组相比没有明显改变，不能促进细胞增殖。
细胞的增殖分化是通过细胞周期来完成的，细胞周期素与CDK组成合酶对细胞周期进展起促进作用，cyclin D和cyclin E是G1期主要的效应细胞周期素，cyclin A与DNA合成有关。Cyclin表达量的多少对心肌细胞的生长有非常重要的调节作用[4，8]。然而我们的结果表明，Ang II虽能使cyclin D、cyclin E和cyclin A的表达量有所升高，但其升高的幅度和持续的时间都不足以使心肌细胞通过G1期，这可能是Ang II不能促进心肌细胞增殖的原因之一。PDGF-BB也可使心肌细胞中各种cyclin的表达量均升高，升高的幅度和持续的时间比Ang II的作用强得多，但是仍然不能使心肌细胞越过G1期进入S期。说明cyclin的表达量与心肌细胞能否进入细胞周期是分离的，除了cyclin的表达量对心肌细胞周期起作用外，一定还有其它因素起作用。
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本实验结果表明静止的心肌细胞中CDK抑制蛋白p27的表达即处于较高水平，加入Ang II后可使p27蛋白的表达稍有降低，在48h时p27蛋白的表达又回到静止水平，加入PDGF-BB后，p27蛋白的表达虽然大约降低了14%，由于p27蛋白的表达基础值较高，仍未能解除p27蛋白对cyclin-CDK合酶的抑制作用，因此，Ang II和PDGF-BB均不能促进心肌细胞通过G1末期限制点进入S期，也就不能促进心肌细胞增殖。
总之，细胞周期素的表达增加与心肌细胞能否进入细胞周期并不一致，p27蛋白是心肌细胞能否进入细胞周期并进行有丝分裂的重要调节因子，p27蛋白的表达量决定心肌细胞能否通过限制点。然而，细胞外刺激信号是如何调节p27蛋白的表达，以及细胞增殖所需p27蛋白表达下降的幅度均是需要进一步研究的重要课题。
* 国家自然科学基金资助(No 39770325)和军队回国人员启动基金资助
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参考文献
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(1998年11月23日收稿， 1999年3月18日修回), http://www.100md.com