红景天甙对缺氧状态下兔肺动脉平滑肌细胞增殖和c-fos、c-myc原癌基因表达的影响
作者：赵贺玲 林树新 贾斌 张莉莉 张世范
单位：赵贺玲 林树新 贾 斌 张莉莉 第四军医大学病生教研室(西安710032)；张世范 兰州军区总医院胸外科
关键词：低氧；肺动脉；肌；平滑；基因-fos；基因-myc；原癌基因
红景天甙对缺氧状态下兔肺动脉平滑肌细胞增殖 和c 摘 要 目的：研究红景天甙(salidroside, Sal)对缺氧( 2%～3%)状态下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞周期和c-fos,c-myc 原癌基 因表达的影响。方法：应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[3H] -胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入、细胞周期测定和斑点杂交的方法。结果：发现缺氧24 h可直接刺激PASMC，使MTT之OD值增加95%(P<0.05)，[3H]-T dR的掺入量增加140%(P<0.01)；在缺氧的PASMC培养液中加入Sal(1200 μg/mL)可抑 制缺氧的这种促增殖作用，PASMC的MTT之OD值与[3H]-TdR掺入量与缺氧组相比显著 下降(P<0.05)；流式细胞分析显示缺氧24 h PASMC G2/M期细胞比例比常氧组明显 增 多(P<0.01),G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.05)，与缺氧组相比Sal可增 多PASMC G0/G1期细胞比例，减少G2/M期细胞比例(P<0.05)；缺氧可促 进c-fos,c-myc原癌基因表达，该效应可被Sal所抑制。结论：红 景天甙可抑 制缺氧所致的PASMC增殖、DNA合成、进入G2/M期的细胞比例和c-fos,c-myc原癌 基因表达。
, 百拇医药
Effects of salidroside on the proliferation and c-fos, c-myc oncogene expression of
rabbit pulmonary artery smooth muscle cell s under hypoxia
ZHAO He-Ling, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG Li-Li, ZHANG Shi-Fan
Department of Pathophysiology, Fourth Military Medical University, Xian(710032)
Lanzhou General Hospital
, 百拇医药
Abstract AIM：To investigate the effects of salidroside on the proliferation, DNA synthesis, cell cycle and c-fos, c-myc oncogene expre ssion of rabbit PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell) under hypoxia. METHODS ：Techniques of cell culture, M TT test, [3H]-TdR incorporation, flowcytometric DNA analysis and Dot blot wer e used. RESULTS： OD value of MTT and [3H]-TdR i ncorporation to PASMC increased significantly by 95% (P<0.05) and 140% ( P<0.01) respectively after 24 h hypoxia, and salidroside(1 200 μg/mL) could inhibit these effects induced by hypoxia(P<0.05); Flowcytometric DNA ana lysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G2/M phase of PASMC (P<0.01) and decreased G0/G1 phase of PASMC(P<0.05); While salidroside could reverse these effects (P<0.05); hypoxia stimulate d c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC, and the effect could be inh ibited by salidroside. CONCLUSION：Salid roside inhibited the proliferation, the cell proportion of G2/M phase, DN A synthesis and c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC induced by hy poxia.
, 百拇医药
MeSH Anoxia; Muscle, smooth; Pulmonary artery; Genes, fos; Ge nes, myc; Oncogenes
缺氧性肺动脉高压形成的主要因素有缺氧性肺动脉血管收缩和缺氧性 肺动脉壁构型重建(remodeling)，而肺动脉平滑肌细胞的增殖是缺氧性肺动脉壁构型重建的 一个重要环节[1]。影响PASMC增殖的因素很多，如缺氧、血管紧张素-Ⅱ、内皮素 、张力[2]等。药用植物红景天具有抗缺氧、提高机体对高原的适应能力 等 作用，在我国西北、西南高原缺氧地区被用于防治高原适应不全症[3]，并取得满 意效果，但对其作用机理尚缺乏研究。本试验应用细胞培养、四唑盐比色试验、[3H] -TdR掺入、流式细胞仪和斑点杂交等方法研究缺氧状态下SAL对兔PASMC增殖、DNA合成、细 胞周期和c-fos,c-myc原癌基因表达的影响，探讨其在防治缺氧造成的肺动脉壁结 构改变和肺动脉高压中的可能作用机制。
, 百拇医药
材料与方法
(一)实验动物：纯种新西兰幼兔(出生1个月，体重400～600 g)，由本校动物实验中心提供 。
(二)主要试剂和药品：RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程 材料研究所，批号9610003； 胰蛋白酶、MTT(噻唑蓝)购自Sigma公司；[3H]-TdR购自 上海原子能科学研究院，比度7.4×1011Bq/mmol、放射性浓度3.7×107 Bq/m L；c-fos,c-myc原癌基因探针购自华美生物试剂公司；红景天甙由兰州军区总医院 提 供，根据Saratikov法提取；PPO购自FLUKA公司；POPOP、DMSO为上海化学试剂一厂产品。
(三)实验方法：
1.PASMC的培养和细胞同步化方法：新西兰幼兔麻醉后，无菌取出肺主动脉，用贴片法进行 PASMC的原代培养。采用细胞分裂相脱离同步化法，使细胞进入同步化生长[4]。
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2.PASMC的缺氧培养：已同步化的PASMC接种于96孔板24 h后，换成含5%小牛血清RPMI-1640 培养液，进行缺氧及常氧对照实验。缺氧装置为自制有机玻璃小室，以20 mL/min连续通入5 % CO2+95% N2的混合气体，测得小室内氧气浓度维持在2～3%(CR-2测氧仪监测 )，小室置于37℃培养箱内。常氧对照组的细胞置于5% CO2孵箱内。
3.四唑盐比色(MTT)试验：用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640配制 成 5×104细胞/ml的细胞悬液，移入96孔板，细胞数为5×103.100 μL-1/孔， 将培养板移入CO 2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养24 h，移去旧培养液，换5%胎牛 血清的RPMI-1640，并加入Sal，在含2%～3% O2缺氧小室继续孵育20 h后，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL) 20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150μL，振荡10 min，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。
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4.[3H]-TdR掺入实验：将消化好的细胞悬液移入96孔板，使细胞数为5×103.100 μL-1/孔，培养24 h后，换为5%小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入Sal， 在含2%～3% CO2缺氧小室继续培养18 h，然后加入[3H]-TdR(3.7×104 Bq/mL)，再继 续孵育6 h后，中止反应，收集细胞于9999型玻璃纤维滤纸上，用液闪计数器测定[3H ]-TdR掺入量。
5.流式细胞仪(FCM)测定细胞周期：长成单层的PASMC换含5%小牛血清RPMI-1640培养液，分 常氧(21%)，缺氧(2%～3%)，缺氧(2%～3%)+Sal组，培养24 h后，用0.25%胰酶-EDTA 消化离心收集细胞，0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗2次，1 000 r/min 离心10 min，上机前加 含RNA 酶的PI染液4 ℃ 30 min，调细胞浓度至106/mL，用FCM EPICS Profile Ⅱ型测定细胞周 期。
, 百拇医药
6.c-fos,c-myc原癌基因斑点杂交：制备1×106细胞/mL悬液，每组加入10 mL 悬液，培 养24 h以后，换为含5%小牛血清RPMI-1640培养基，分别作常氧及缺氧培养，24 h后加Sal， 分别 于30 min，1 h中止反应并收集细胞，按文献[5]方法提取总RNA，以260 nm波长紫 外光吸光度测定RNA含量，c-fos基因探针长1.6 kb，c-myc基因探针长1.3 kb， 通过缺口 平移法进行放射性标记，每一样品点两个斑点，用量分别为5 μg,2.5 μg RNA，然后按文 献[6]方法进行RNA斑点杂交，最后进行放射自显影。
7.统计分析：所有数据均以平均数±标准差(
±s)表示，以组间t检验判 断差异显著性。细胞周期采用总体率假设检验。
, 百拇医药
结 果
1.Sal对缺氧状态下PASMC增殖和DNA合成的影响：结果如图1所示，结果表明，Sal可抑制缺 氧所致的PASMC增殖和DNA合成。以单纯缺氧组为对照，Sal使PASMC的OD值下降23%，[3 H]-TdR掺入量 下降28%(P<0.05)。PASMC的OD值下降45%，3 H-TdR掺 入量下降28%(P<0.05)。
Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation and DNA synthesis o f PASMC under hypoxia●P<0.05, vs H group; P<0.01, vs N group(±s,n=12)
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N=normoxia; H=hypoxia; H+Sal=hypoxia+salidroside
图1 红景天甙对缺氧状态下PASMC增殖和DNA合成的影响
2.红景天甙对缺氧状态下PASMC细胞周期的影响：流式细胞分析表 明，与常氧对照 组相比，PASMC缺氧培养24 h后，显著增加进入G2/M期的细胞比例，显著减少进入G0 /G1期的细胞比例(P<0.01)，Sal能减少缺氧的PASMC进入G2/M期的细胞 比例(P<0.05)，增加进入G0/G1期的细胞比例(P<0.05)，使更多的P ASMC处 于相对静止期，如图2所示。
, 百拇医药
Fig 2 Effect of salidroside on the cell cycle of PASMC under hyp oxia
A=normoxia; B=hypoxia; C=salidroside+hypoxia
图2 红景天甙对缺氧状态下PASMC细胞周期的影响
3.红景天甙对缺氧状态下PASMC的c-fos,c-myc基因表达的影响：结果如 图3所 示。可见缺氧组PASMC的斑点灰度较常氧组高，而在缺氧组PASMC中加入Sal后，于30 min，1 h收集细胞，分别作c-fos,c-myc原癌基因的斑点杂交，则斑点灰度较单纯缺氧组低。
, 百拇医药
Fig 3 Effect of salidroside on the expression of c-fos (1,2,3)、c- myc(4,5,6) oncogene of PASMC under hypoxia
1,4=normoxia; 2,5=hypoxia; 3,6=hypoxia+salidroside
图3 红景天甙对PASMC c-fos、c-myc原癌基因表达的影响
讨 论
大量研究证明，肺血管平滑肌在缺氧环境下的增生导致肺血管壁结构重建。影响PASMC增殖 的因素很多，Reusch等[7]报道机械张力可通过JNK/SAPK和ERK(extracellular sig nal-regul ated kinase)系统的激活促进PASMC的增殖。生长因子如PDGF，EGF等可通过改变 细胞内Na+/H+交换促进PASMC的增殖[8]。Cornfield等研究发现[9 ] ，急性缺氧可引起PASMC内[Ca2+]增高，而Ca2+是细胞增殖活动中重 要的第二信使，PKC的激活依赖于Ca2+。各种刺激PASMC增殖的因素通过细胞内信息 传导的共同通路如Ras/MAPK、Raf-1系统[10]、cGMP、磷酸酶/磷脂系统的激活将 细胞外信息传递到细胞核内，诱导c-myc,c-fos,c-jun等原癌基因快速短暂转 录和表达，促进与DNA合成相关蛋白的合成，进而促进PASMC的增殖。
, 百拇医药
本研究表明，红景天甙可显著抑制缺氧对PASMC增殖和DNA合成的促进作用，抑制缺氧所致的 G2/M期细胞比例增多，使更多的PASMC处于G0/G1期，从而抑制PASMC的增殖， 研究还表明Sal可抑制缺氧所致的c-fos,c-myc mRNA表达增加。本研究为Sal应用于 临床防治 缺氧性肺动脉高压提供了理论基础，但其抑制PASMC的增殖及原癌基因表达的细胞内信号传 导途径还有待进一步研究。
参考文献
1 Davies P, Patton W. Peripheral and central vascular smooth muscle cells from rat lung exhibit different cytoskeletal protein profiles but similar growth factor requirements. J Cell Physiol, 1994, 159(3):399.
, 百拇医药
2 Kulik TJ, Alvarado SP. Effect of stretch on growth and collagen synth esis in cu ltured rat and lamb pulmonary arterial smooth muscle cells. J Cell Physiol, 1993 , 157(3):615.
3 昝俊平，谢印之，孙兴斌，等.红景天中药复方提高高原机体劳动能力的效果观 察.解放军预防医学杂志，1994，12(1)：17.
4 鄂征.细胞同步化法.鄂征主编.组织与细胞培养技术.第3版.北京：人民卫 生出版社，1994. 201.
5 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid g uanidinium thiocyanate-phenol-chlororm extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156.
, 百拇医药
6 卢圣东.现代分子生物学技术.北京：高等教育出版社，1993，167.
7 Reusch HP, Chan G, Ives HE, et al. Activation of JNK/SAPK and ERK by m echanical strain in vascular smooth muscle cells depends on extracellular matrix composition. Biochem Biophys Res Commun, 1997,237(2):239.
8 Quinn DA, Dahlberg CG, Bonventre JP. The role of Na+/H+exchang e and growth factors in pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996, 14(2):139.
, http://www.100md.com
9 Cornfield DN, Stevens T, McMurtry IF, et al. Acute hypoxia increase cy tosolic calcium in fetal pulmonary after smooth muscle cell. Am J Physiol, 1993, 265(9):L53.
10 van Dijk MC, Hilkmann H, van Blitterswijk WJ. Platelet-derived growth factor activation of mitogen-activated protein kinase depends on the sequential activation of phosphatidylcholine-specific phospholipase C, protein kinase C-zet a and Raf-1. Biochem J, 1997,325(Pt 2):303.
(1997年11月13日收稿，1998年3月17日修回), http://www.100md.com
单位：赵贺玲 林树新 贾 斌 张莉莉 第四军医大学病生教研室(西安710032)；张世范 兰州军区总医院胸外科
关键词：低氧；肺动脉；肌；平滑；基因-fos；基因-myc；原癌基因
红景天甙对缺氧状态下兔肺动脉平滑肌细胞增殖 和c 摘 要 目的：研究红景天甙(salidroside, Sal)对缺氧( 2%～3%)状态下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞周期和c-fos,c-myc 原癌基 因表达的影响。方法：应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[3H] -胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入、细胞周期测定和斑点杂交的方法。结果：发现缺氧24 h可直接刺激PASMC，使MTT之OD值增加95%(P<0.05)，[3H]-T dR的掺入量增加140%(P<0.01)；在缺氧的PASMC培养液中加入Sal(1200 μg/mL)可抑 制缺氧的这种促增殖作用，PASMC的MTT之OD值与[3H]-TdR掺入量与缺氧组相比显著 下降(P<0.05)；流式细胞分析显示缺氧24 h PASMC G2/M期细胞比例比常氧组明显 增 多(P<0.01),G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.05)，与缺氧组相比Sal可增 多PASMC G0/G1期细胞比例，减少G2/M期细胞比例(P<0.05)；缺氧可促 进c-fos,c-myc原癌基因表达，该效应可被Sal所抑制。结论：红 景天甙可抑 制缺氧所致的PASMC增殖、DNA合成、进入G2/M期的细胞比例和c-fos,c-myc原癌 基因表达。
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Effects of salidroside on the proliferation and c-fos, c-myc oncogene expression of
rabbit pulmonary artery smooth muscle cell s under hypoxia
ZHAO He-Ling, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG Li-Li, ZHANG Shi-Fan
Department of Pathophysiology, Fourth Military Medical University, Xian(710032)
Lanzhou General Hospital
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Abstract AIM：To investigate the effects of salidroside on the proliferation, DNA synthesis, cell cycle and c-fos, c-myc oncogene expre ssion of rabbit PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell) under hypoxia. METHODS ：Techniques of cell culture, M TT test, [3H]-TdR incorporation, flowcytometric DNA analysis and Dot blot wer e used. RESULTS： OD value of MTT and [3H]-TdR i ncorporation to PASMC increased significantly by 95% (P<0.05) and 140% ( P<0.01) respectively after 24 h hypoxia, and salidroside(1 200 μg/mL) could inhibit these effects induced by hypoxia(P<0.05); Flowcytometric DNA ana lysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G2/M phase of PASMC (P<0.01) and decreased G0/G1 phase of PASMC(P<0.05); While salidroside could reverse these effects (P<0.05); hypoxia stimulate d c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC, and the effect could be inh ibited by salidroside. CONCLUSION：Salid roside inhibited the proliferation, the cell proportion of G2/M phase, DN A synthesis and c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC induced by hy poxia.
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MeSH Anoxia; Muscle, smooth; Pulmonary artery; Genes, fos; Ge nes, myc; Oncogenes
缺氧性肺动脉高压形成的主要因素有缺氧性肺动脉血管收缩和缺氧性 肺动脉壁构型重建(remodeling)，而肺动脉平滑肌细胞的增殖是缺氧性肺动脉壁构型重建的 一个重要环节[1]。影响PASMC增殖的因素很多，如缺氧、血管紧张素-Ⅱ、内皮素 、张力[2]等。药用植物红景天具有抗缺氧、提高机体对高原的适应能力 等 作用，在我国西北、西南高原缺氧地区被用于防治高原适应不全症[3]，并取得满 意效果，但对其作用机理尚缺乏研究。本试验应用细胞培养、四唑盐比色试验、[3H] -TdR掺入、流式细胞仪和斑点杂交等方法研究缺氧状态下SAL对兔PASMC增殖、DNA合成、细 胞周期和c-fos,c-myc原癌基因表达的影响，探讨其在防治缺氧造成的肺动脉壁结 构改变和肺动脉高压中的可能作用机制。
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材料与方法
(一)实验动物：纯种新西兰幼兔(出生1个月，体重400～600 g)，由本校动物实验中心提供 。
(二)主要试剂和药品：RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程 材料研究所，批号9610003； 胰蛋白酶、MTT(噻唑蓝)购自Sigma公司；[3H]-TdR购自 上海原子能科学研究院，比度7.4×1011Bq/mmol、放射性浓度3.7×107 Bq/m L；c-fos,c-myc原癌基因探针购自华美生物试剂公司；红景天甙由兰州军区总医院 提 供，根据Saratikov法提取；PPO购自FLUKA公司；POPOP、DMSO为上海化学试剂一厂产品。
(三)实验方法：
1.PASMC的培养和细胞同步化方法：新西兰幼兔麻醉后，无菌取出肺主动脉，用贴片法进行 PASMC的原代培养。采用细胞分裂相脱离同步化法，使细胞进入同步化生长[4]。
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2.PASMC的缺氧培养：已同步化的PASMC接种于96孔板24 h后，换成含5%小牛血清RPMI-1640 培养液，进行缺氧及常氧对照实验。缺氧装置为自制有机玻璃小室，以20 mL/min连续通入5 % CO2+95% N2的混合气体，测得小室内氧气浓度维持在2～3%(CR-2测氧仪监测 )，小室置于37℃培养箱内。常氧对照组的细胞置于5% CO2孵箱内。
3.四唑盐比色(MTT)试验：用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640配制 成 5×104细胞/ml的细胞悬液，移入96孔板，细胞数为5×103.100 μL-1/孔， 将培养板移入CO 2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养24 h，移去旧培养液，换5%胎牛 血清的RPMI-1640，并加入Sal，在含2%～3% O2缺氧小室继续孵育20 h后，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL) 20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150μL，振荡10 min，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。
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4.[3H]-TdR掺入实验：将消化好的细胞悬液移入96孔板，使细胞数为5×103.100 μL-1/孔，培养24 h后，换为5%小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入Sal， 在含2%～3% CO2缺氧小室继续培养18 h，然后加入[3H]-TdR(3.7×104 Bq/mL)，再继 续孵育6 h后，中止反应，收集细胞于9999型玻璃纤维滤纸上，用液闪计数器测定[3H ]-TdR掺入量。
5.流式细胞仪(FCM)测定细胞周期：长成单层的PASMC换含5%小牛血清RPMI-1640培养液，分 常氧(21%)，缺氧(2%～3%)，缺氧(2%～3%)+Sal组，培养24 h后，用0.25%胰酶-EDTA 消化离心收集细胞，0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗2次，1 000 r/min 离心10 min，上机前加 含RNA 酶的PI染液4 ℃ 30 min，调细胞浓度至106/mL，用FCM EPICS Profile Ⅱ型测定细胞周 期。
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6.c-fos,c-myc原癌基因斑点杂交：制备1×106细胞/mL悬液，每组加入10 mL 悬液，培 养24 h以后，换为含5%小牛血清RPMI-1640培养基，分别作常氧及缺氧培养，24 h后加Sal， 分别 于30 min，1 h中止反应并收集细胞，按文献[5]方法提取总RNA，以260 nm波长紫 外光吸光度测定RNA含量，c-fos基因探针长1.6 kb，c-myc基因探针长1.3 kb， 通过缺口 平移法进行放射性标记，每一样品点两个斑点，用量分别为5 μg,2.5 μg RNA，然后按文 献[6]方法进行RNA斑点杂交，最后进行放射自显影。
7.统计分析：所有数据均以平均数±标准差(
±s)表示，以组间t检验判 断差异显著性。细胞周期采用总体率假设检验。, 百拇医药
结 果
1.Sal对缺氧状态下PASMC增殖和DNA合成的影响：结果如图1所示，结果表明，Sal可抑制缺 氧所致的PASMC增殖和DNA合成。以单纯缺氧组为对照，Sal使PASMC的OD值下降23%，[3 H]-TdR掺入量 下降28%(P<0.05)。PASMC的OD值下降45%，3 H-TdR掺 入量下降28%(P<0.05)。
Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation and DNA synthesis o f PASMC under hypoxia●P<0.05, vs H group; P<0.01, vs N group(
±s,n=12), http://www.100md.com
N=normoxia; H=hypoxia; H+Sal=hypoxia+salidroside
图1 红景天甙对缺氧状态下PASMC增殖和DNA合成的影响
2.红景天甙对缺氧状态下PASMC细胞周期的影响：流式细胞分析表 明，与常氧对照 组相比，PASMC缺氧培养24 h后，显著增加进入G2/M期的细胞比例，显著减少进入G0 /G1期的细胞比例(P<0.01)，Sal能减少缺氧的PASMC进入G2/M期的细胞 比例(P<0.05)，增加进入G0/G1期的细胞比例(P<0.05)，使更多的P ASMC处 于相对静止期，如图2所示。
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Fig 2 Effect of salidroside on the cell cycle of PASMC under hyp oxia
A=normoxia; B=hypoxia; C=salidroside+hypoxia
图2 红景天甙对缺氧状态下PASMC细胞周期的影响
3.红景天甙对缺氧状态下PASMC的c-fos,c-myc基因表达的影响：结果如 图3所 示。可见缺氧组PASMC的斑点灰度较常氧组高，而在缺氧组PASMC中加入Sal后，于30 min，1 h收集细胞，分别作c-fos,c-myc原癌基因的斑点杂交，则斑点灰度较单纯缺氧组低。
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Fig 3 Effect of salidroside on the expression of c-fos (1,2,3)、c- myc(4,5,6) oncogene of PASMC under hypoxia
1,4=normoxia; 2,5=hypoxia; 3,6=hypoxia+salidroside
图3 红景天甙对PASMC c-fos、c-myc原癌基因表达的影响
讨 论
大量研究证明，肺血管平滑肌在缺氧环境下的增生导致肺血管壁结构重建。影响PASMC增殖 的因素很多，Reusch等[7]报道机械张力可通过JNK/SAPK和ERK(extracellular sig nal-regul ated kinase)系统的激活促进PASMC的增殖。生长因子如PDGF，EGF等可通过改变 细胞内Na+/H+交换促进PASMC的增殖[8]。Cornfield等研究发现[9 ] ，急性缺氧可引起PASMC内[Ca2+]增高，而Ca2+是细胞增殖活动中重 要的第二信使，PKC的激活依赖于Ca2+。各种刺激PASMC增殖的因素通过细胞内信息 传导的共同通路如Ras/MAPK、Raf-1系统[10]、cGMP、磷酸酶/磷脂系统的激活将 细胞外信息传递到细胞核内，诱导c-myc,c-fos,c-jun等原癌基因快速短暂转 录和表达，促进与DNA合成相关蛋白的合成，进而促进PASMC的增殖。
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本研究表明，红景天甙可显著抑制缺氧对PASMC增殖和DNA合成的促进作用，抑制缺氧所致的 G2/M期细胞比例增多，使更多的PASMC处于G0/G1期，从而抑制PASMC的增殖， 研究还表明Sal可抑制缺氧所致的c-fos,c-myc mRNA表达增加。本研究为Sal应用于 临床防治 缺氧性肺动脉高压提供了理论基础，但其抑制PASMC的增殖及原癌基因表达的细胞内信号传 导途径还有待进一步研究。
参考文献
1 Davies P, Patton W. Peripheral and central vascular smooth muscle cells from rat lung exhibit different cytoskeletal protein profiles but similar growth factor requirements. J Cell Physiol, 1994, 159(3):399.
, 百拇医药
2 Kulik TJ, Alvarado SP. Effect of stretch on growth and collagen synth esis in cu ltured rat and lamb pulmonary arterial smooth muscle cells. J Cell Physiol, 1993 , 157(3):615.
3 昝俊平，谢印之，孙兴斌，等.红景天中药复方提高高原机体劳动能力的效果观 察.解放军预防医学杂志，1994，12(1)：17.
4 鄂征.细胞同步化法.鄂征主编.组织与细胞培养技术.第3版.北京：人民卫 生出版社，1994. 201.
5 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid g uanidinium thiocyanate-phenol-chlororm extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156.
, 百拇医药
6 卢圣东.现代分子生物学技术.北京：高等教育出版社，1993，167.
7 Reusch HP, Chan G, Ives HE, et al. Activation of JNK/SAPK and ERK by m echanical strain in vascular smooth muscle cells depends on extracellular matrix composition. Biochem Biophys Res Commun, 1997,237(2):239.
8 Quinn DA, Dahlberg CG, Bonventre JP. The role of Na+/H+exchang e and growth factors in pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996, 14(2):139.
, http://www.100md.com
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(1997年11月13日收稿，1998年3月17日修回), http://www.100md.com