反义TNF-α寡脱氧核苷酸降低感染性休克小鼠死亡率
作者：肾内科 李锦华 唐皓 余学清
单位：余学清 李锦华 广州中山医科大学附属第一医院 肾内科；唐皓 急诊 科 (广州510080)
关键词：寡核苷酸类；反义；肿瘤坏死因子；休克；脓毒性；小鼠
中国病理生理杂志/990715 摘要 目的： 观察反义肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)寡脱氧核苷酸对LPS诱导的感染性休克小鼠的影响，为采用反义技术 降低感染性休克死亡率的早期临床试验奠定基础。 方法：通过腹腔注射LP S建立感染性休克小鼠模型。采用腹腔注射方法，通过DOTAP转染导入系统，使反义TNF-α寡 脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)作用于小鼠单核吞噬细胞系统；采用RT-PCR ，E LISA检测TNF-α的mRN A和蛋白质的表达水平。结果： 反义TNF-α ODN降低了LPS诱导的感染性休 克小鼠的TNF-α的释放，降低了感染性休克小鼠的死亡率，而正义TNF-α ODN和错配TNF-α ODN与对照组相比，对TNF-α的释放无影响，未能降低感染性休克小鼠的死亡率。 结论：反义TNF-α ODN以序列特异性方式抑制了LPS诱导的感染性休克小鼠的TNF- α 的释放，降低了感染性休克小鼠的死亡率。
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Antisense TNF-α oligodeoxynucleotide decreases death rate in se ptic shock mice
LI Jin-Hua1, TANG Hao2, YU Xue-Qing1
1 Department of Nephrology, 2 Emergency Department , The First Affi liated Hospital of
Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou (510080)
Abstract AIM：To evaluate the effect of antisense ph osphrothioate tumor necr osis factor-alpha(TNF-α) oligodeoxynucleotide(ODN) on death rate in septic mic e induced by LPS.METHODS: Septic shock mice model was induced by in traperitoneal injection of LPS.Mouse antisense TNF-α ODN was applied to the ret icular-endothelial system in septic shock BALB/c mice introduced by DOTAP delive ry system . RT-PCR and ELISA were used to detect TNF-α mRNA and protein.R ESULTS: The antisense TNF-α ODN can suppress releasing of TNF-α and re d uce death rate in septic shock mice induced by LPS, and neither sense nor misma t ched TNF-α ODN can. CONCLUSION: Antisense TNF-α ODN significantly suppressed production of TNF-α in septic shock.The investigation provides the b asis for the early clinical trials assessing the therapeutic potential of antise nse TNF-α approach for decreasing death rate in septic shock.
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MeSH Oligonucleotides, antisense; Tumor necrosis factor; Shock ,septic; Mice
感染性休克是感染的严重并发症，病死率高。目前大多数学者认为革 兰阴性菌所致的感染性休克的许多病理结果是由于炎症细胞因子的过度产生所致[1] ，其中TNF-α是介导感染性休克的主要介质：(1)革兰阴性菌内毒素刺激机体产生过量 的TNF-α，引起发热，心脏和肾上腺严重受损，呼吸、循环衰竭，甚至死亡[2]； (2)TNF-α水平与病死率呈正相关；(3)注射TNF-α可再次产生显著的感染性休克的临床 和病理表现。本研究采用针对小鼠TNF-α mRNA包括腺嘌呤(AUG)在内 的前5个密码子的翻译起始区的反义TNF-α ODN，以DOTAP为转染 导入系统，采用腹腔注射方法，观察反义TNF-α ODN对LPS诱导的感染性休克小鼠的影响， 为采用反义技术降低感染性休克死亡率的早期临床试验奠定基础。
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材料与方法
一、材料：
DOTAP，Boehringer Marmnnheim；E.coli 0127:B8LPS, Sigma; RT-PCR kit, Promega; Mouse TNF-α ELISA kit,深圳晶美公司; Balb/c小鼠, 中山医科大学实验动物中心。
二、方法：
(一)TNF-α ODN:中国科学院上海生物工程研究中心合成；ODN的5'和3'端各3个磷酸二酯键 经过硫代磷酸修饰。正义TNF-α ODN：5' ATG AGC ACA GAA AGC ATG 3';反义TNF-α ODN: 5'CAT GCT TTC TGT GCT CAT 3';错配TNF-α ODN：5' CAT TCT GTC CGT GTT ATC 3'。
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(二)感染性休克小鼠模型的制备：每只小鼠腹腔注射100 μL PBS，含LPS 350 μg。
(三)实验分组：每组10只BALB/c小鼠(雌性，6～8 weeks)。腹腔注射LPS 30 min前，进行 下面实验。
1.对照组:腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg；正义TNF-α ODN组：腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg+正义TNF-α ODN 100 μg。
2.反义TNF-α ODN组：腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg+反义TNF-α ODN 100 μ g。
3.错配TNF-α ODN组：腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg+错配TNF-α ODN 100 μ g。
, 百拇医药
(四)小鼠单核吞噬细胞系统TNF-α mRNA的测定：腹腔注射LPS 150 min后各组随机处死3只小鼠，按文献[3]提取小鼠脾脏总RNA,按RT-PCR Kit提供的方法进行RT-PCR 。反转录后PCR所用的引物如下述。扩增TNF-α mRNA:上游引物：5'-CAA ACC ACC AAG TGG A GG AG-3';下游引物：5'-GTA GAC CTG CCC GGA CTC CG -3'，产物398bp。Denaturation 9 3℃×1 min,Annealing 50℃×1 min,extension 72 ℃×2 min ,35 cycles,final exte nsion 72 ℃×5 min。以一对引物(sense： 5'- CCT GGT CTT TCT GGT GCT TG -3', anti -sense: 5'-GTA GGT TAC AAG GAA GGT GAT G-3')扩增小鼠β2微球蛋白基因的mRNA为阳 性内参照，反转录后PCR方法同上，产物472 bp。
, 百拇医药
(五)小鼠血清TNF-α的测定：腹腔注射LPS 150 min后取小鼠静脉血按照mouse TNF-α ELIS A kit提供的方法测定TNF-α。
(六)资料统计：每个样本重复测定6次，求其均值，实验数据用
±s表示。采用 计算机医用统计程序(SPSS/PC)对数据进行F及q检验。
结 果
一、 TNF-α ODN对小鼠生存率的影响：
反义TNF-α ODN组LPS诱导的感染性休克小鼠死亡率显著低于对照组，正义、错配TNF-α ODN组与对照组相比，无显著差异(见图1)。
, 百拇医药
Fig 1 Antisense TNF-α ODN protects mice from lethal endotoxemia
Four groups of 10 BALB/c mice were injected intraperitoneally with 350 μg LPS, before 30 minutes with 100 μL PBS (containing DOTAP 5 μg,□) or an equivalent volume containing the following dose of DOTAP 5 μg+Sense TNF- α ODN 100 μg (○), DOTAP 5 μg+Antisense TNF-α ODN 100 μg ( ●), DOTAP 5 μg +Mismatch TNF-α ODN 100 μg(■). Death was monitored over the f ollowing 7d
图1 反义TNF-α ODN降低感染性休克小鼠死亡率
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二、 反义TNF-α ODN对感染性休克小鼠单核吞噬细胞系统TNF-α mRNA表达的影响：
按上述实验分组提取脾细胞总RNA，采用RT-PCR方法，检测了TNF-α mRNA的表达水 平。结果发现，与对照组相比，反义TNF-α ODN组显著抑制LPS诱导小鼠单核吞噬细胞系统 TNF-α mRNA的表达；而正义、错配TNF-α ODN组与对照组相比，无显著差 异(见图2)。
Fig 2 TNF-α mRNA RT-PCR of splenocytes of septic shock mice induced by LPS Lane1,2,3,4： indicates sense,mismatched and antisense TNF-α ODN group respec ticely.Electrophoreses with 5 μL TNF-α mRNA RT-PCR product(392bp) per lane was performed.Mouse β2-microglobulin (β2-MG) mRNA RT-PCR product(478bp) was us ed as a loading internal control. Lane 5: PCR marker:1543,994,695,515,377, 237bp.Inhi bition of TNF-α mRNA in septic shock mouse by antisense TNF-α ODN could be s een obviously
, 百拇医药
图2 RT-PCR检测LPS诱导的感染性休克小鼠脾细胞TNF-α mRNA
三、 反义TNF-α ODN对感染性休克小鼠TNF-α 产量的影响：
从表1可以看出，反义TNF-α ODN抑制感染性休克小鼠TNF-α的释放，但对TNF-α的基础释 放无影响。
表1 反义TNF-α ODN对感染性休克小鼠TNF-α 产量的影响
Tab 1 TNF-α release after LPS administration(±s,n=7 ，ng/mL) Group
TNF-α (Hours after LPS injection)
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1
2
3
4
Control
120.0±29.2
156.0±35.4
65.9±24.6
20.5±9.1
Sense
118.0±30.1
140.0±40.1
, 百拇医药
70.8±18.5
21.1±5.2
Antisense
38.5±8.9*
40.8±10.2*
17.2±7.9*
18.9±7.3*
Mismatch
126.0±26.3
170.0±39.9
69.1±20.1
, 百拇医药
25.3±8.9
* P<0.01, vs control; Sense=sense TNF-α ODN ; Antisense=antisense T NF-α ODN;Mismatch=mismatch TNF-α ODN
讨 论
目前大多数学者认为感染性休克是由感染促发的全身炎症反应为介导的多器官损害的病 理过程，这种失控的、逐级放大的损伤性的连锁反应是由细胞因子介导的，炎症反应所导 致的二次打击(double-hit)对器官的损害较原发感染大得多，往往造成血流动力学的不稳 定和器官衰竭[4]。而TNF-α被认为在这一连锁反应中起轴心作用的前炎症因子， 降低TNF-α的水平能提高感染性休克小鼠的死亡率[5]。众多实验提示，采用设计 恰当的反义ODN能明显降低细胞因子的生成[6]。
, http://www.100md.com
大量研究证实，与某一特定mRNA互补的ODN，能通过受体介导的胞饮作用进入细胞，阻断核 糖体的移位[7,8]或通过RNase H 介导的消化降解mRNA从而阻断蛋白质的翻译 [9]。我们设计的反义TNF-α ODN所针对的靶序列是小鼠TNF-α mRNA翻译起始区的前5 个密码子，为避免ODN在细胞内受各种核酸酶的快速降解，本研究对ODN两端进行了硫代磷酸 修饰，它能起抵抗核酸酶的作用，而反义TNF-α ODN与TNF-α mRNA的亲和性不会降低。以D OTAP作为转染系统，它能增加细胞对TNF-α ODN的摄取，避免了核酸酶的快速降解。
本研究采用针对小鼠TNF-α mRNA包括腺嘌呤(AUG)在内的前5个密码子的翻译起始区的 反义TNF-α ODN，以DOTAP为转染导入系统，采用腹腔注射方法，能显著抑制LPS诱导的小鼠 单核吞噬细胞系统TNF-α mRNA的表达，降低了感染性休克小鼠TNF-α的释放，提高了感染 性休克小鼠的生存率。本研究结果说明，反义TNF-α ODN对降低感染性休克死亡率有潜在的 应用前景，为采用反义技术降低感染性休克死亡率的早期临床试验奠定了基础。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Fong Y, Moldawer LL.The biologic characteristics of cytokines and th eir implication in surgical injury.Surg Gynecol Obstet, 1990, 170(4):363.
2 van der Poll T,Buller HR,Ten Cate H,et al.Activation of coagulation after administeration of tumor necrosis factor to normal subjects.N Engl J Med, 1990, 322(23):1622.
3 王申五主编.基因诊断技术——非放射性操作手册.第1版.北京：北京医科大学中 国协和医科大学联合出版社,1992.39,46,109.
, 百拇医药
4 Shapira L, Soskolne WA, Houri Y ,et al. Protection against endotoxic shock and lipopolysaccharide-induced local inflammation by tetracycline: corr elation with inhibition of cytokine secretion. Infect Immun, 1996, 64(3): 8 25.
5 Ashkenazi A,Marsters SA, Capon DJ, et al. Protection against endot oxic shock by a tumor necrosis factor receptor immunoadehesion. Proc Natl Acad Sci USA,1991, 88:10535.
6 Ding MZ, Zhang M,Joyce L Wong.Cutting edge:antisense knockdown of inducible nitric oxide synthase inhibites induction of experitment autoimmune encephalomyelitis in SJL/J mice. J Immunol,1998, 160:2560.
, 百拇医药
7 Loke S,Stein CA, Zhang XH,et al.Characterization of oligonucleoti de transport into living cells.Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:3474.
8 Boiziau C, Thuong NT, Toulme JJ.Mechanism of the inhibition of rev erse transcription by antisense oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA, 199 2, 89:768.
9 Dash P,Lotan I,Knapp M,et al.Selective elimination of mRNA in vivo :co mplementary oligodeoxynucleotides promote RNA degeradation by RNase H-like ac tivity. Proc Natl Acad Sci USA,1987, 84:7896.
(1998年9月21日收稿，1999年4月1日修回), http://www.100md.com
单位：余学清 李锦华 广州中山医科大学附属第一医院 肾内科；唐皓 急诊 科 (广州510080)
关键词：寡核苷酸类；反义；肿瘤坏死因子；休克；脓毒性；小鼠
中国病理生理杂志/990715 摘要 目的： 观察反义肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)寡脱氧核苷酸对LPS诱导的感染性休克小鼠的影响，为采用反义技术 降低感染性休克死亡率的早期临床试验奠定基础。 方法：通过腹腔注射LP S建立感染性休克小鼠模型。采用腹腔注射方法，通过DOTAP转染导入系统，使反义TNF-α寡 脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)作用于小鼠单核吞噬细胞系统；采用RT-PCR ，E LISA检测TNF-α的mRN A和蛋白质的表达水平。结果： 反义TNF-α ODN降低了LPS诱导的感染性休 克小鼠的TNF-α的释放，降低了感染性休克小鼠的死亡率，而正义TNF-α ODN和错配TNF-α ODN与对照组相比，对TNF-α的释放无影响，未能降低感染性休克小鼠的死亡率。 结论：反义TNF-α ODN以序列特异性方式抑制了LPS诱导的感染性休克小鼠的TNF- α 的释放，降低了感染性休克小鼠的死亡率。
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Antisense TNF-α oligodeoxynucleotide decreases death rate in se ptic shock mice
LI Jin-Hua1, TANG Hao2, YU Xue-Qing1
1 Department of Nephrology, 2 Emergency Department , The First Affi liated Hospital of
Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou (510080)
Abstract AIM：To evaluate the effect of antisense ph osphrothioate tumor necr osis factor-alpha(TNF-α) oligodeoxynucleotide(ODN) on death rate in septic mic e induced by LPS.METHODS: Septic shock mice model was induced by in traperitoneal injection of LPS.Mouse antisense TNF-α ODN was applied to the ret icular-endothelial system in septic shock BALB/c mice introduced by DOTAP delive ry system . RT-PCR and ELISA were used to detect TNF-α mRNA and protein.R ESULTS: The antisense TNF-α ODN can suppress releasing of TNF-α and re d uce death rate in septic shock mice induced by LPS, and neither sense nor misma t ched TNF-α ODN can. CONCLUSION: Antisense TNF-α ODN significantly suppressed production of TNF-α in septic shock.The investigation provides the b asis for the early clinical trials assessing the therapeutic potential of antise nse TNF-α approach for decreasing death rate in septic shock.
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MeSH Oligonucleotides, antisense; Tumor necrosis factor; Shock ,septic; Mice
感染性休克是感染的严重并发症，病死率高。目前大多数学者认为革 兰阴性菌所致的感染性休克的许多病理结果是由于炎症细胞因子的过度产生所致[1] ，其中TNF-α是介导感染性休克的主要介质：(1)革兰阴性菌内毒素刺激机体产生过量 的TNF-α，引起发热，心脏和肾上腺严重受损，呼吸、循环衰竭，甚至死亡[2]； (2)TNF-α水平与病死率呈正相关；(3)注射TNF-α可再次产生显著的感染性休克的临床 和病理表现。本研究采用针对小鼠TNF-α mRNA包括腺嘌呤(AUG)在内 的前5个密码子的翻译起始区的反义TNF-α ODN，以DOTAP为转染 导入系统，采用腹腔注射方法，观察反义TNF-α ODN对LPS诱导的感染性休克小鼠的影响， 为采用反义技术降低感染性休克死亡率的早期临床试验奠定基础。
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材料与方法
一、材料：
DOTAP，Boehringer Marmnnheim；E.coli 0127:B8LPS, Sigma; RT-PCR kit, Promega; Mouse TNF-α ELISA kit,深圳晶美公司; Balb/c小鼠, 中山医科大学实验动物中心。
二、方法：
(一)TNF-α ODN:中国科学院上海生物工程研究中心合成；ODN的5'和3'端各3个磷酸二酯键 经过硫代磷酸修饰。正义TNF-α ODN：5' ATG AGC ACA GAA AGC ATG 3';反义TNF-α ODN: 5'CAT GCT TTC TGT GCT CAT 3';错配TNF-α ODN：5' CAT TCT GTC CGT GTT ATC 3'。
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(二)感染性休克小鼠模型的制备：每只小鼠腹腔注射100 μL PBS，含LPS 350 μg。
(三)实验分组：每组10只BALB/c小鼠(雌性，6～8 weeks)。腹腔注射LPS 30 min前，进行 下面实验。
1.对照组:腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg；正义TNF-α ODN组：腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg+正义TNF-α ODN 100 μg。
2.反义TNF-α ODN组：腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg+反义TNF-α ODN 100 μ g。
3.错配TNF-α ODN组：腹腔注射100 μL PBS/只，含DOTAP 5 μg+错配TNF-α ODN 100 μ g。
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(四)小鼠单核吞噬细胞系统TNF-α mRNA的测定：腹腔注射LPS 150 min后各组随机处死3只小鼠，按文献[3]提取小鼠脾脏总RNA,按RT-PCR Kit提供的方法进行RT-PCR 。反转录后PCR所用的引物如下述。扩增TNF-α mRNA:上游引物：5'-CAA ACC ACC AAG TGG A GG AG-3';下游引物：5'-GTA GAC CTG CCC GGA CTC CG -3'，产物398bp。Denaturation 9 3℃×1 min,Annealing 50℃×1 min,extension 72 ℃×2 min ,35 cycles,final exte nsion 72 ℃×5 min。以一对引物(sense： 5'- CCT GGT CTT TCT GGT GCT TG -3', anti -sense: 5'-GTA GGT TAC AAG GAA GGT GAT G-3')扩增小鼠β2微球蛋白基因的mRNA为阳 性内参照，反转录后PCR方法同上，产物472 bp。
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(五)小鼠血清TNF-α的测定：腹腔注射LPS 150 min后取小鼠静脉血按照mouse TNF-α ELIS A kit提供的方法测定TNF-α。
(六)资料统计：每个样本重复测定6次，求其均值，实验数据用
±s表示。采用 计算机医用统计程序(SPSS/PC)对数据进行F及q检验。结 果
一、 TNF-α ODN对小鼠生存率的影响：
反义TNF-α ODN组LPS诱导的感染性休克小鼠死亡率显著低于对照组，正义、错配TNF-α ODN组与对照组相比，无显著差异(见图1)。
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Fig 1 Antisense TNF-α ODN protects mice from lethal endotoxemia
Four groups of 10 BALB/c mice were injected intraperitoneally with 350 μg LPS, before 30 minutes with 100 μL PBS (containing DOTAP 5 μg,□) or an equivalent volume containing the following dose of DOTAP 5 μg+Sense TNF- α ODN 100 μg (○), DOTAP 5 μg+Antisense TNF-α ODN 100 μg ( ●), DOTAP 5 μg +Mismatch TNF-α ODN 100 μg(■). Death was monitored over the f ollowing 7d
图1 反义TNF-α ODN降低感染性休克小鼠死亡率
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二、 反义TNF-α ODN对感染性休克小鼠单核吞噬细胞系统TNF-α mRNA表达的影响：
按上述实验分组提取脾细胞总RNA，采用RT-PCR方法，检测了TNF-α mRNA的表达水 平。结果发现，与对照组相比，反义TNF-α ODN组显著抑制LPS诱导小鼠单核吞噬细胞系统 TNF-α mRNA的表达；而正义、错配TNF-α ODN组与对照组相比，无显著差 异(见图2)。
Fig 2 TNF-α mRNA RT-PCR of splenocytes of septic shock mice induced by LPS Lane1,2,3,4： indicates sense,mismatched and antisense TNF-α ODN group respec ticely.Electrophoreses with 5 μL TNF-α mRNA RT-PCR product(392bp) per lane was performed.Mouse β2-microglobulin (β2-MG) mRNA RT-PCR product(478bp) was us ed as a loading internal control. Lane 5: PCR marker:1543,994,695,515,377, 237bp.Inhi bition of TNF-α mRNA in septic shock mouse by antisense TNF-α ODN could be s een obviously
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图2 RT-PCR检测LPS诱导的感染性休克小鼠脾细胞TNF-α mRNA
三、 反义TNF-α ODN对感染性休克小鼠TNF-α 产量的影响：
从表1可以看出，反义TNF-α ODN抑制感染性休克小鼠TNF-α的释放，但对TNF-α的基础释 放无影响。
表1 反义TNF-α ODN对感染性休克小鼠TNF-α 产量的影响
Tab 1 TNF-α release after LPS administration(
±s,n=7 ，ng/mL) GroupTNF-α (Hours after LPS injection)
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1
2
3
4
Control
120.0±29.2
156.0±35.4
65.9±24.6
20.5±9.1
Sense
118.0±30.1
140.0±40.1
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70.8±18.5
21.1±5.2
Antisense
38.5±8.9*
40.8±10.2*
17.2±7.9*
18.9±7.3*
Mismatch
126.0±26.3
170.0±39.9
69.1±20.1
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25.3±8.9
* P<0.01, vs control; Sense=sense TNF-α ODN ; Antisense=antisense T NF-α ODN;Mismatch=mismatch TNF-α ODN
讨 论
目前大多数学者认为感染性休克是由感染促发的全身炎症反应为介导的多器官损害的病 理过程，这种失控的、逐级放大的损伤性的连锁反应是由细胞因子介导的，炎症反应所导 致的二次打击(double-hit)对器官的损害较原发感染大得多，往往造成血流动力学的不稳 定和器官衰竭[4]。而TNF-α被认为在这一连锁反应中起轴心作用的前炎症因子， 降低TNF-α的水平能提高感染性休克小鼠的死亡率[5]。众多实验提示，采用设计 恰当的反义ODN能明显降低细胞因子的生成[6]。
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大量研究证实，与某一特定mRNA互补的ODN，能通过受体介导的胞饮作用进入细胞，阻断核 糖体的移位[7,8]或通过RNase H 介导的消化降解mRNA从而阻断蛋白质的翻译 [9]。我们设计的反义TNF-α ODN所针对的靶序列是小鼠TNF-α mRNA翻译起始区的前5 个密码子，为避免ODN在细胞内受各种核酸酶的快速降解，本研究对ODN两端进行了硫代磷酸 修饰，它能起抵抗核酸酶的作用，而反义TNF-α ODN与TNF-α mRNA的亲和性不会降低。以D OTAP作为转染系统，它能增加细胞对TNF-α ODN的摄取，避免了核酸酶的快速降解。
本研究采用针对小鼠TNF-α mRNA包括腺嘌呤(AUG)在内的前5个密码子的翻译起始区的 反义TNF-α ODN，以DOTAP为转染导入系统，采用腹腔注射方法，能显著抑制LPS诱导的小鼠 单核吞噬细胞系统TNF-α mRNA的表达，降低了感染性休克小鼠TNF-α的释放，提高了感染 性休克小鼠的生存率。本研究结果说明，反义TNF-α ODN对降低感染性休克死亡率有潜在的 应用前景，为采用反义技术降低感染性休克死亡率的早期临床试验奠定了基础。
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参考文献
1 Fong Y, Moldawer LL.The biologic characteristics of cytokines and th eir implication in surgical injury.Surg Gynecol Obstet, 1990, 170(4):363.
2 van der Poll T,Buller HR,Ten Cate H,et al.Activation of coagulation after administeration of tumor necrosis factor to normal subjects.N Engl J Med, 1990, 322(23):1622.
3 王申五主编.基因诊断技术——非放射性操作手册.第1版.北京：北京医科大学中 国协和医科大学联合出版社,1992.39,46,109.
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4 Shapira L, Soskolne WA, Houri Y ,et al. Protection against endotoxic shock and lipopolysaccharide-induced local inflammation by tetracycline: corr elation with inhibition of cytokine secretion. Infect Immun, 1996, 64(3): 8 25.
5 Ashkenazi A,Marsters SA, Capon DJ, et al. Protection against endot oxic shock by a tumor necrosis factor receptor immunoadehesion. Proc Natl Acad Sci USA,1991, 88:10535.
6 Ding MZ, Zhang M,Joyce L Wong.Cutting edge:antisense knockdown of inducible nitric oxide synthase inhibites induction of experitment autoimmune encephalomyelitis in SJL/J mice. J Immunol,1998, 160:2560.
, 百拇医药
7 Loke S,Stein CA, Zhang XH,et al.Characterization of oligonucleoti de transport into living cells.Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:3474.
8 Boiziau C, Thuong NT, Toulme JJ.Mechanism of the inhibition of rev erse transcription by antisense oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA, 199 2, 89:768.
9 Dash P,Lotan I,Knapp M,et al.Selective elimination of mRNA in vivo :co mplementary oligodeoxynucleotides promote RNA degeradation by RNase H-like ac tivity. Proc Natl Acad Sci USA,1987, 84:7896.
(1998年9月21日收稿，1999年4月1日修回), http://www.100md.com