内毒素对山羊肝线粒体膜磷脂代谢及膜流动性的影响
作者：高洪 谭丽勤 李卫真 唐兆新 陈万芳
单位：高洪 谭丽勤 李卫(云南农业大学动物科技学院，云南 昆明 650201)；唐兆新(华南农业大学动物医学系， 广东 广州 510642)；陈万芳(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210014)
关键词：内毒素类；膜；磷脂类；膜流动性；线粒体；红细胞膜
中国病理生理杂志000111
[摘 要] 目的和方法：应用高效液相色谱法(HPLC)测定了正常健康山羊内毒素(ET)处理后，肝线粒体膜(MiM)中磷脂酰肌醇(PtdIns)，磷脂酰丝氨酸(PtdSer)，磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)及磷脂酰胆碱(PtdCho)的变化，同时用DPH探针标记红细胞膜(ECM)和肝MiM制剂，采用分子荧光偏振技术测定了膜流动性的改变。结果：ET处理组在处理后5h PtdIns, PtdSer, PtdEtn, PtdCho的含量明显低于对照组(P<0.01)，ECM和MiM的荧光各向异性(A)显著高于对照组(P<0.01)。结论：ET可诱导膜磷脂含量的改变并对膜流动性有明显的影响。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 244 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0039-03
Effects of endotoxin on phospholipid metabolism and membrane fluidity in liver mitochondria of goats
GAO Hong， TAN Li-qin，LI Wei-zhen
( College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)
TANG Zhao-xin
, 百拇医药
(Animal Medicine Department of South China Agricultural University)
CHEN Wan-fang
(College of Animal Medicine, Nanjing Agricultural University)
[Abstract] AIM and METHOD:To study the changes of contents of phosphatidyl inositol (PtdIns),phosphatidylserine (Ptdser),phosphatidylethanolamine (PtdEtn) and phosphatidylcholine(PtdCho) in hepatic mitochondria membrane of goats in vivo at 5 h after administration of E. coli endotoxin(1800 U/kg body weight) with HPLC. The membrane fluidity of the erythrocyte and liver mitochondria of E. coli endotoxin treated group was examined with the fluorescence polarization technique, in which 1,6-diphenyl-1,3,5,-hexatriene was used as a fluorescence probe. RESULTS:E. coli endotoxin treated group (group II) led to a marked decrease of PtdIns, PtdSer, PtdEtn, PtdCho contents of hepatic mitochondria in vivo at 5 h as compare to the normal control (group I) (P<0.01). The fluorescence anisotropy (A) parameters of erythrocytic and liver mitochondria membrane in group II were higher than those in group I(P<0.01). CONCLUSION: E. coli endotoxin could induced marked decrease of membrane phospholipid contents and membrane fluidity.
, 百拇医药
[MeSH] Endotoxins; Membranes; Phospholipids; Membrane fluidity; Mitochondria; Erythrocyte membrane
内毒素(endotoxin, ET)是感染性休克的主要致病因素，其膜损伤的机制有待进一步阐明。细胞与周围环境的联系和反应都要通过细胞膜来完成。很多疾病与膜磷脂含量和膜流动性变化有关，研究细胞膜磷脂含量和膜流动性的变化不仅可阐明细胞的生理过程和病理现象，且有助于疾病的诊断和治疗。我们曾经报道，ET可使山羊红细胞膜(erythrocytic membrane, ECM)和肝线粒体膜(mitochondria membrane, MiM)ATPase活性降低[1，2]。为了进一步了解ET对山羊细胞膜磷脂代谢及膜流动性的影响，本研究使用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)测定了山羊ET处理后肝MiM中磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PtdIns)，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PtdSer)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PtdEtn)及磷脂酰胆碱(phosphatidylCholine, PtdCho)的变化，用分子荧光偏振技术测定了ECM 和肝MiM 制剂流动性的改变。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、 膜磷脂测定：
(一)主要仪器和试剂：日本Shimadzu LG-6A HPLC仪，PtdlIns、PtdSer、PtdEtn 和PtdCho 均系Sigma 产品。乙腈和甲醇为国产光谱纯，氯仿和磷酸为国产分析纯。
(二)色谱条件[3]：流动相选用甲醇-乙腈-85%磷酸(3:100:1V/V/V)；柱子为 YWG-SiO2 柱(7 μm,4.6 mmID×250 mm)，中科院大连化物所填装；流速1.4 mL/min; 柱压77 kgf/cm2;检测灵敏度0.04 AUFS;25℃下进行色谱分析。
(三)MiM 磷脂的制备：选用健康杂交山羊12只，雌雄各半，体重8～13 kg，按以前的方法[1，2]进行ET处理。实验分为对照组(I组)和ET处理组(Ⅱ组)，处理后5 h处死。
, 百拇医药
山羊处死后，按 Sayeed等[4]的方法制备山羊肝细胞线粒体悬液，采用Sedmak等[5]的方法测定MiM蛋白含量。参照Folch 等[6]的方法，略加改动提取 MiM磷脂。
二、膜流动性的测定：
将上述各组山羊经颈静脉采取新鲜血，按 Pearson 的方法[7]制备ECM 制剂。分别取出定量的ECM制剂和上述制备的MiM悬液，用DPH (1,6-dipheny1-1,3,5-hexatrene) 分子荧光探针标记，pH 7.4,37℃温育并不断振荡30 min, 用Hitachi 850 型分子荧光分光光度计测量荧光偏振值，计算出膜脂的荧光各向异性(anisotropy,A)以判定膜的流动性。A的大小与膜流动性呈相反关系。
结 果
, 百拇医药
一、肝MiM 中 PtdIns、PtdSer、PtdEtn 及 PtdCho 的改变：
图1是用 HPLC 方法测定肝 MiM中PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho 含量的色谱图，从图中可见，肝MiM的磷脂组分得到较好的基线分离。可观察到4个峰，与标准品的色谱图比较，从保留时间 (retention time, tR)及加量效应上可以确定出图中P1峰(tR=2.470 min)为 PtdIns,P2峰(tR=4.430 min)为 PtdSer, P3峰(tR=6.602 min)为 PtdEtn, P4峰(tR=11.958 min)为 PtdCho，根据 PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho 的浓度和峰面积的标准曲线分别计算出 PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho 的含量，结果见表1。
, 百拇医药
表1 山羊肝线粒体膜 PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho含量变化
Tab 1 Changes of PtdIns, PtdSer, PtdEtn, PtdCho contents in hepatic mitochondria membrane of goats (
±s,μg/mg protein，n=6) Group
PtdIns
PtdSer
PtdEtn
PtdCho
Control (5 h)
, http://www.100md.com
1.412±0.351
0.433±0.047
13.328±1.680
23.223±2.731
ET treated (5 h)
0.692±0.139**
0.261±0.022**
9.279±1.103**
16.462±1.786**
**P<0.01, vs control
, 百拇医药
Fig 1 HPLC spectrum in membrane phospholipids
of goat liver mitochondria
图1 山羊肝线粒体膜磷脂的HPLC谱图
从表1得知，Ⅱ组(ET treatment group)PtdIns、 PtdSer、 PtdEtn、 PtdCho的含量在5 h均显著低于I组(control group)。
二、膜流动性的改变：
ET处理后5 h，肝MiM的荧光各向异性(A)明显增加(P<0.01)，而肝MiM A 的变化与ECM的一致(表2)。A的改变反映膜流动性的变化，两者呈相反关系，A大表明膜流动性小，A小表明膜流动性大，因此，上述结果提示，山羊经ET处理后5h，肝MiM和ECM的流动性都变小。
, http://www.100md.com
表2 山羊肝线粒体膜和红细胞膜的荧光各向异性(A)
Tab 2 Fluorescence anisotropy (A) of hepatic mitochondria and erythrocytic membrane from goats (±s，n=6) Group
Anisotropy (5 h)
ECM
MiM
Control
0.126±0.009
0.101±0.009
ET treated
, 百拇医药
0.162±0.011**
0.127±0.011**
**P<0.01, vs control讨 论
生物膜是具有流动性的脂质双分子层结构，其功能的正常依赖于膜的稳定性。本研究显示，ET可使膜系统磷脂(phospholipid,PL) 主要组分减少，膜的A增加，膜流动性降低。笔者认为，ET通过改变内外膜系统膜脂区微环境的成分和生物物理特性而实现其毒性损伤作用。
线粒体是机体的能源中心，其正常功能的实现有赖于MiM PL组分的相对恒定。本研究表明，机体的“动力中心”线粒体是ET定位的部位，且在膜水平上导致细胞器等内膜系统主要PL成分减少和严重的毒性损害。其结果，破坏了MiM的完整性，致使线粒体氧化呼吸功能障碍。所以，ET诱导的MiM PL主要成分的减少在ET诱导的细胞损伤中起着直接和关键的作用，是ET诱导细胞损害和肝损伤的重要机制之一。
, http://www.100md.com
此外，膜PL中 PtdIns 的减少，说明ET诱导的磷酸肌醇系统的周转增强，“双信使系统”的信使分子IP3和DG形成增加，使膜Ca2+通道开放，胞内Ca2+富集而成为细胞损伤的又一机制。再者，膜主要PL PtdEtn 和 PtdCho[8]减少，势必影响细胞的PL代谢，进而导致膜和细胞的损害。本实验显示，肝MiM中主要PL PtdCho 明显减少，生成PtdCho 的前体物——PtdSer和PtdEtn 也减少，进而使膜流动性下降。因此，笔者认为，ET诱导PL成分的比例改变，阻抑PtdSer脱羧和PtdEtn甲基化向PtdCho转化的进程，最终导致PtdCho减少是ET引起生物膜损伤的另一个重要通路。而膜主要PL的减少，是ET损害中膜稳定性降低的关键和ET生物学效应进一步扩大的基础。该结果将为临床上治疗ET性休克提供重要的理论依据。
[基金项目] 云南省应用基础研究基金和国家自然科学基金资助
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] 高 洪，唐兆新，陈万芳.大肠埃希氏菌内毒素诱导山羊肝线粒体膜损伤过程中ATP酶活性变化及654-2的保护效应[J].中国兽医科技，1998，28(5)：18～19.
[2] 高 洪，谭丽勤，李卫真，等.内毒素诱导的山羊红细胞膜和肝线粒体膜Ca2+-ATP酶活性的改变及654-2的保护作用[J].云南农业大学学报，1998，13(3)：301～305.
[3] Rehman SU.Rapid isocratic method for the separation and quantification of major phospholipid classes by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr Biomed App1,1991,567:29～37.
, 百拇医药
[4] Sayeed MM, Baue AE. Mitochondrial metabolism of succinate, β-hydroxybutyrate and α-ketoglutarate in hemorrhage shock[J]. Am J Physiol, 1971,220:1275～1280.
[5] Sedmak JJ, Grossberg SE.A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blu G-250[J]. Anal Biochem,1977,79:544～552.
[6] Folch BJ, Lees M, Stanley GHS. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues[J]. J Biol Chem, 1957,226:497～509.
, 百拇医药
[7] Pearson TM.( Na+,K+)-ATPase of Duchenne muscular dystrophy erythrocyte ghost[J]. Life Sci,1979,21:127～131.
[8] Elabbdi N, Ancelin ML, Vial HJ. Phospholipid metabolism of serin in plasmodium infected erythrocytes involves phosphatidylserine and direct serin decarboxylation[J]. Biochem J,1997,324：435～445.
[收稿日期]1998-10-22 [修回日期]1999-03-24, 百拇医药
单位：高洪 谭丽勤 李卫(云南农业大学动物科技学院，云南 昆明 650201)；唐兆新(华南农业大学动物医学系， 广东 广州 510642)；陈万芳(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210014)
关键词：内毒素类；膜；磷脂类；膜流动性；线粒体；红细胞膜
中国病理生理杂志000111
[摘 要] 目的和方法：应用高效液相色谱法(HPLC)测定了正常健康山羊内毒素(ET)处理后，肝线粒体膜(MiM)中磷脂酰肌醇(PtdIns)，磷脂酰丝氨酸(PtdSer)，磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)及磷脂酰胆碱(PtdCho)的变化，同时用DPH探针标记红细胞膜(ECM)和肝MiM制剂，采用分子荧光偏振技术测定了膜流动性的改变。结果：ET处理组在处理后5h PtdIns, PtdSer, PtdEtn, PtdCho的含量明显低于对照组(P<0.01)，ECM和MiM的荧光各向异性(A)显著高于对照组(P<0.01)。结论：ET可诱导膜磷脂含量的改变并对膜流动性有明显的影响。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 244 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0039-03
Effects of endotoxin on phospholipid metabolism and membrane fluidity in liver mitochondria of goats
GAO Hong， TAN Li-qin，LI Wei-zhen
( College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)
TANG Zhao-xin
, 百拇医药
(Animal Medicine Department of South China Agricultural University)
CHEN Wan-fang
(College of Animal Medicine, Nanjing Agricultural University)
[Abstract] AIM and METHOD:To study the changes of contents of phosphatidyl inositol (PtdIns),phosphatidylserine (Ptdser),phosphatidylethanolamine (PtdEtn) and phosphatidylcholine(PtdCho) in hepatic mitochondria membrane of goats in vivo at 5 h after administration of E. coli endotoxin(1800 U/kg body weight) with HPLC. The membrane fluidity of the erythrocyte and liver mitochondria of E. coli endotoxin treated group was examined with the fluorescence polarization technique, in which 1,6-diphenyl-1,3,5,-hexatriene was used as a fluorescence probe. RESULTS:E. coli endotoxin treated group (group II) led to a marked decrease of PtdIns, PtdSer, PtdEtn, PtdCho contents of hepatic mitochondria in vivo at 5 h as compare to the normal control (group I) (P<0.01). The fluorescence anisotropy (A) parameters of erythrocytic and liver mitochondria membrane in group II were higher than those in group I(P<0.01). CONCLUSION: E. coli endotoxin could induced marked decrease of membrane phospholipid contents and membrane fluidity.
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[MeSH] Endotoxins; Membranes; Phospholipids; Membrane fluidity; Mitochondria; Erythrocyte membrane
内毒素(endotoxin, ET)是感染性休克的主要致病因素，其膜损伤的机制有待进一步阐明。细胞与周围环境的联系和反应都要通过细胞膜来完成。很多疾病与膜磷脂含量和膜流动性变化有关，研究细胞膜磷脂含量和膜流动性的变化不仅可阐明细胞的生理过程和病理现象，且有助于疾病的诊断和治疗。我们曾经报道，ET可使山羊红细胞膜(erythrocytic membrane, ECM)和肝线粒体膜(mitochondria membrane, MiM)ATPase活性降低[1，2]。为了进一步了解ET对山羊细胞膜磷脂代谢及膜流动性的影响，本研究使用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)测定了山羊ET处理后肝MiM中磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PtdIns)，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PtdSer)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PtdEtn)及磷脂酰胆碱(phosphatidylCholine, PtdCho)的变化，用分子荧光偏振技术测定了ECM 和肝MiM 制剂流动性的改变。
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材 料 和 方 法
一、 膜磷脂测定：
(一)主要仪器和试剂：日本Shimadzu LG-6A HPLC仪，PtdlIns、PtdSer、PtdEtn 和PtdCho 均系Sigma 产品。乙腈和甲醇为国产光谱纯，氯仿和磷酸为国产分析纯。
(二)色谱条件[3]：流动相选用甲醇-乙腈-85%磷酸(3:100:1V/V/V)；柱子为 YWG-SiO2 柱(7 μm,4.6 mmID×250 mm)，中科院大连化物所填装；流速1.4 mL/min; 柱压77 kgf/cm2;检测灵敏度0.04 AUFS;25℃下进行色谱分析。
(三)MiM 磷脂的制备：选用健康杂交山羊12只，雌雄各半，体重8～13 kg，按以前的方法[1，2]进行ET处理。实验分为对照组(I组)和ET处理组(Ⅱ组)，处理后5 h处死。
, 百拇医药
山羊处死后，按 Sayeed等[4]的方法制备山羊肝细胞线粒体悬液，采用Sedmak等[5]的方法测定MiM蛋白含量。参照Folch 等[6]的方法，略加改动提取 MiM磷脂。
二、膜流动性的测定：
将上述各组山羊经颈静脉采取新鲜血，按 Pearson 的方法[7]制备ECM 制剂。分别取出定量的ECM制剂和上述制备的MiM悬液，用DPH (1,6-dipheny1-1,3,5-hexatrene) 分子荧光探针标记，pH 7.4,37℃温育并不断振荡30 min, 用Hitachi 850 型分子荧光分光光度计测量荧光偏振值，计算出膜脂的荧光各向异性(anisotropy,A)以判定膜的流动性。A的大小与膜流动性呈相反关系。
结 果
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一、肝MiM 中 PtdIns、PtdSer、PtdEtn 及 PtdCho 的改变：
图1是用 HPLC 方法测定肝 MiM中PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho 含量的色谱图，从图中可见，肝MiM的磷脂组分得到较好的基线分离。可观察到4个峰，与标准品的色谱图比较，从保留时间 (retention time, tR)及加量效应上可以确定出图中P1峰(tR=2.470 min)为 PtdIns,P2峰(tR=4.430 min)为 PtdSer, P3峰(tR=6.602 min)为 PtdEtn, P4峰(tR=11.958 min)为 PtdCho，根据 PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho 的浓度和峰面积的标准曲线分别计算出 PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho 的含量，结果见表1。
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表1 山羊肝线粒体膜 PtdIns、PtdSer、PtdEtn、PtdCho含量变化
Tab 1 Changes of PtdIns, PtdSer, PtdEtn, PtdCho contents in hepatic mitochondria membrane of goats (
±s,μg/mg protein，n=6) GroupPtdIns
PtdSer
PtdEtn
PtdCho
Control (5 h)
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1.412±0.351
0.433±0.047
13.328±1.680
23.223±2.731
ET treated (5 h)
0.692±0.139**
0.261±0.022**
9.279±1.103**
16.462±1.786**
**P<0.01, vs control
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Fig 1 HPLC spectrum in membrane phospholipids
of goat liver mitochondria
图1 山羊肝线粒体膜磷脂的HPLC谱图
从表1得知，Ⅱ组(ET treatment group)PtdIns、 PtdSer、 PtdEtn、 PtdCho的含量在5 h均显著低于I组(control group)。
二、膜流动性的改变：
ET处理后5 h，肝MiM的荧光各向异性(A)明显增加(P<0.01)，而肝MiM A 的变化与ECM的一致(表2)。A的改变反映膜流动性的变化，两者呈相反关系，A大表明膜流动性小，A小表明膜流动性大，因此，上述结果提示，山羊经ET处理后5h，肝MiM和ECM的流动性都变小。
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表2 山羊肝线粒体膜和红细胞膜的荧光各向异性(A)
Tab 2 Fluorescence anisotropy (A) of hepatic mitochondria and erythrocytic membrane from goats (±s，n=6) Group
Anisotropy (5 h)
ECM
MiM
Control
0.126±0.009
0.101±0.009
ET treated
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0.162±0.011**
0.127±0.011**
**P<0.01, vs control讨 论
生物膜是具有流动性的脂质双分子层结构，其功能的正常依赖于膜的稳定性。本研究显示，ET可使膜系统磷脂(phospholipid,PL) 主要组分减少，膜的A增加，膜流动性降低。笔者认为，ET通过改变内外膜系统膜脂区微环境的成分和生物物理特性而实现其毒性损伤作用。
线粒体是机体的能源中心，其正常功能的实现有赖于MiM PL组分的相对恒定。本研究表明，机体的“动力中心”线粒体是ET定位的部位，且在膜水平上导致细胞器等内膜系统主要PL成分减少和严重的毒性损害。其结果，破坏了MiM的完整性，致使线粒体氧化呼吸功能障碍。所以，ET诱导的MiM PL主要成分的减少在ET诱导的细胞损伤中起着直接和关键的作用，是ET诱导细胞损害和肝损伤的重要机制之一。
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此外，膜PL中 PtdIns 的减少，说明ET诱导的磷酸肌醇系统的周转增强，“双信使系统”的信使分子IP3和DG形成增加，使膜Ca2+通道开放，胞内Ca2+富集而成为细胞损伤的又一机制。再者，膜主要PL PtdEtn 和 PtdCho[8]减少，势必影响细胞的PL代谢，进而导致膜和细胞的损害。本实验显示，肝MiM中主要PL PtdCho 明显减少，生成PtdCho 的前体物——PtdSer和PtdEtn 也减少，进而使膜流动性下降。因此，笔者认为，ET诱导PL成分的比例改变，阻抑PtdSer脱羧和PtdEtn甲基化向PtdCho转化的进程，最终导致PtdCho减少是ET引起生物膜损伤的另一个重要通路。而膜主要PL的减少，是ET损害中膜稳定性降低的关键和ET生物学效应进一步扩大的基础。该结果将为临床上治疗ET性休克提供重要的理论依据。
[基金项目] 云南省应用基础研究基金和国家自然科学基金资助
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[参 考 文 献]
[1] 高 洪，唐兆新，陈万芳.大肠埃希氏菌内毒素诱导山羊肝线粒体膜损伤过程中ATP酶活性变化及654-2的保护效应[J].中国兽医科技，1998，28(5)：18～19.
[2] 高 洪，谭丽勤，李卫真，等.内毒素诱导的山羊红细胞膜和肝线粒体膜Ca2+-ATP酶活性的改变及654-2的保护作用[J].云南农业大学学报，1998，13(3)：301～305.
[3] Rehman SU.Rapid isocratic method for the separation and quantification of major phospholipid classes by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr Biomed App1,1991,567:29～37.
, 百拇医药
[4] Sayeed MM, Baue AE. Mitochondrial metabolism of succinate, β-hydroxybutyrate and α-ketoglutarate in hemorrhage shock[J]. Am J Physiol, 1971,220:1275～1280.
[5] Sedmak JJ, Grossberg SE.A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blu G-250[J]. Anal Biochem,1977,79:544～552.
[6] Folch BJ, Lees M, Stanley GHS. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues[J]. J Biol Chem, 1957,226:497～509.
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[7] Pearson TM.( Na+,K+)-ATPase of Duchenne muscular dystrophy erythrocyte ghost[J]. Life Sci,1979,21:127～131.
[8] Elabbdi N, Ancelin ML, Vial HJ. Phospholipid metabolism of serin in plasmodium infected erythrocytes involves phosphatidylserine and direct serin decarboxylation[J]. Biochem J,1997,324：435～445.
[收稿日期]1998-10-22 [修回日期]1999-03-24, 百拇医药