地高辛抗血清对缺氧损伤心肌组织内洋地黄素和心肌细胞膜ATP酶活性的影响
作者：柳兆芳 柯永胜 程光华 汪佑霞
单位：柳兆芳(皖南医学院弋矶山医院麻醉科，安徽 芜湖 241001)；柯永胜 程光华 汪佑霞(弋矶山医院实验室)
关键词：心肌；低氧；洋地黄；腺苷三磷酸酶，钠，钾；地高辛
中国病理生理杂志000510
[摘 要] 目的：评价地高辛抗血清对抗心肌缺氧损伤的作用与机制。方法： 制备心肌组织缺氧模型，观察不同剂量的地高辛抗血清对缺氧损伤心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响。结果： 缺氧损伤时心肌组织内洋地黄素水平明显高于正常对照组，心肌细胞膜ATP酶活性明显低于正常对照组；地高辛抗血清能明显拮抗缺氧对心肌细胞膜ATP酶活性的抑制作用。结论： 缺氧所致心肌组织内洋地黄素水平升高是缺氧介导心肌损伤的分子生物学基础，地高辛抗血清通过拮抗内洋地黄素的作用，减轻缺氧所致心肌损伤，对缺氧心肌具有保护作用。
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[中图分类号] R541 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0418-03
The effect of anti-digoxin antiserum on endoxin and membrane ATPase activity in hypoxic myocardium
LIU Zhao-fang, KE Yong-sheng,CHENG Guang-hua, WANG You-xia
(Department of Anesthesiology,Yijishan Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001, China)
[Abstract] AIM: To evaluate the antagonistic effect of anti-digoxin antiserum on hypoxic myocardium and its mechanism. METHODS: It was observed that different concentration of anti-digoxin antiserum effect on endoxin and cell membrane ATPase activity in hypoxic myocardium model.RESULTS: The endoxin level was much higher,cell membrane ATPase activity was much lower in hypoxic myocardium than those of normal; anti-digoxin antiserum can resume membrane ATPase activity. CONCLUSION: Rise of endoxin was basic in molecular biology of myocardial damage during myocardial hypoxia. Anti-digoxin antiserum decreased myocardial damage and has protective effect on hypoxic myocardium by antagonistic effect of endoxin.
, 百拇医药
[MeSH] Myocardium; Anoxia; Digitalis; Adenosine triphosphatase, sodium, potassium; Digoxin
心肌缺氧损伤的分子生物学基础是细胞内钙超载，而细胞内钙超载与很多体液因子对细胞膜ATP酶的抑制作用有关，内洋地黄素(endoxin or endogenous digitalis-like factor)是一种具有与洋地黄生物活性相似的体液因子，可能是洋地黄受体的内源性递质，与地高辛抗体有交叉性结合，可明显抑制细胞膜ATP酶，具有强心、利尿和收缩血管作用，在急性心肌缺血时明显升高[1,2]。本实验采用心肌组织匀浆制成缺氧模型(此模型类似于在体的心脏缺血损伤)[3]，利用内洋地黄素与地高辛抗体具有交叉结合的特点，观察不同剂量的地高辛抗血清对缺氧损伤心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响，以阐明地高辛抗血清对缺氧损伤的心肌是否具有保护作用及其作用机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
新西兰白兔8只，雌雄兼有，体重(2.5±0.5)kg，由皖南医学院实验动物中心提供。用2%硫喷妥钠40 mg.kg-1腹腔注射麻醉，麻醉成功后，立即剖胸取出心脏，用预冷的生理盐水作主动脉逆行灌注冲洗，滤纸吸干，取左心室心肌组织2 g，加入预冷的生理盐水10mL，用匀浆器制成匀浆，4℃ 3 000 r/min离心5 min，各取上清液0.9 mL分置于试管中，并分4组：(A组)正常对照组：向试管中通入95% O2和5% CO2，持续20 min；(B组)缺氧组：向试管中通入95%的N2和5%的CO2，持续20 min；(C组)缺氧加低浓度地高辛抗血清组：先向试管中加入1∶30 000兔抗兔地高辛抗血清(北京邦定生物医学公司提供)0.1 mL，再作缺氧处理；(D组)缺氧加高浓度地高辛抗血清组：先向试管中加入1∶10 000兔抗兔地高辛抗血清0.1 mL，再作缺氧处理。
, 百拇医药
心肌组织匀浆内洋地黄素浓度测定采用放射免疫分析法，试剂盒由同济大学放射免疫技术研究所提供；ATP酶活性测定采用化学比色法，测定原理：ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷的量，以判断ATP酶活性的高低，ATP酶活性单位是以每小时分解每毫克组织蛋白产生的无机磷的含量来表示(μmolPi.mg Pro-1.h-1)；考马斯亮兰蛋白含量测定原理：蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的CBBG250显色剂加入蛋白标准液或样品时，CBBG250染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过计算吸光度可计算出蛋白含量。ATP酶试剂盒及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
统计学处理：各组数据采用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验；两因素间相互关系采用简单直线相关回归分析。
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结 果
一、地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响，见表1。
表1 地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素
和ATP酶活性的影响
Tab 1 The effect of anti-digoxin antiserum on
endoxin and membrane ATPase activity in
hypoxic myocardium (±s, n=8) Group
Endoxin
, 百拇医药
(ng.mL-1)
Na+-K+-
ATPase(μmol.mg
Pro-1.h-1)
Ca2+-
ATPase(μmol.mg
Pro-1.h-1)
Group A
Group B
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Group C
Group D
0.11±0.04
0.16±0.04*
0.56±0.05**##
0.61±0.13**##
3.04±0.28
1.43±0.24**
3.08±0.15##
3.22±0.39##
, 百拇医药
2.79±0.43
1.78±0.37**
2.39±0.39##
2.67±0.50##
*P<0.05， **P<0.01， vs group A; ##P<0.01， vs group B
由表1可见，缺氧组心肌内洋地黄素水平明显高于正常对照组，而心肌细胞膜ATP酶活性明显低于正常对照组；预先使用地高辛抗血清后，心肌组织内洋地黄素水平升高更明显，但心肌细胞膜ATP酶活性也明显升高。
二、地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性影响的量效关系
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经相关分析发现，地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响呈明显的剂量效应关系，即地高辛抗血清浓度越高，缺氧心肌组织内洋地黄素水平越高，心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性也明显升高，r分别为0.6725、0.6843和0.7966，P均<0.01。内洋地黄素水平与心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性呈明显正相关，r分别为0.9457、0.9561，P均<0.01。
讨 论
实验研究表明，心肌细胞在缺氧时，细胞内Ca2+浓度上升是导致心肌细胞不可逆损伤的主要原因[4]，因此，抑制缺氧心肌细胞内的Ca2+浓度上升，就有可能对细胞产生保护作用[5]。缺氧时心肌细胞内Ca2+浓度升高的机制与缺氧所致心肌细胞膜ATP酶活性受抑制有关，即心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶受抑制，其转运和泵出细胞内Ca2+的能力减弱，致使细胞内Ca2+积聚。但缺氧条件下，心肌细胞膜ATP酶受抑制的机制是什么，是否通过某些介质介导，仍不清楚。
, 百拇医药
内洋地黄素是一种具有洋地黄样生物活性的因子，是公认的钠泵抑制剂，可能是洋地黄受体的内源性递质，其在高血压和心力衰竭的发生与发展过程中起十分重要的作用。由于其能特异性与洋地黄抗体结合，故利用这一特点，可用放射免疫方法检测之；同时，也利用这一特点，使用洋地黄抗体治疗高血压取得成功[6]。
本研究发现，心肌组织缺氧时，心肌组织匀浆内洋地黄素水平较正常对照组明显升高，而与此同时，心肌细胞膜ATP酶活性则较正常对照组明显下降，表明缺氧可促使心肌细胞合成和释放内洋地黄素，升高的内洋地黄素与其受体结合，抑制心肌细胞膜ATP酶活性，使细胞内Ca2+升高。预先使用地高辛抗血清后，心肌组织内洋地黄素水平进一步升高，但心肌细胞膜ATP酶活性也明显升高；而且，地高辛抗血清浓度越高，心肌细胞膜ATP酶活性升高程度也越明显，说明地高辛抗血清通过与内洋地黄素结合使后者与心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶结合量减少，使酶受抑制程度减轻，并得到恢复。使用地高辛抗血清后，心肌组织匀浆内洋地黄素水平的升高可能与地高辛抗血清将内洋地黄素从心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶受体位置上置换出来有关。因为放射免疫方法只能测定游离的内洋地黄素或其抗原抗体复合物，而不能测定与细胞膜结合的内洋地黄素。
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本研究初步证实，缺氧性心肌细胞损伤可能与内洋地黄素有关，地高辛抗血清通过拮抗内洋地黄素的作用而对缺氧心肌具有保护作用。
[参 考 文 献]
[1] 柯永胜，陶月玉，杨尚印，等.慢性充血性心力衰竭患者内源性洋地黄样因子浓度变化的意义[J].中华内科杂志，1990， 29:11.
[2] 柯永胜，陶月玉，杨尚印，等.急性心肌梗死患者血清内源性洋地黄样因子的动态变化[J].中华心血管病杂志，1990，18:360.
[3] 张昀昀，王 军，章 鲁，等.氨氯地平对缺氧和复氧损伤心肌细胞内pH值及Ca2+浓度的影响[J].中华心血管病杂志，1997，25:219.
[4] Silverman HS,Stern MD.Zonic basis of ischemic cardiac injury:insights from cellular studies[J].Cardiovasc Res,1994，28:581.
[5] 王 军，张佩瑾，章 鲁，等.维拉帕米和Mn2+对缺氧和复氧单心肌细胞游离Ca2+的影响[J].中国病理生理杂志，1996，12:95～98.
[6] 柯永胜.抗地高辛抗体与心血管系统疾病[J].心血管病学进展，1991，12:35.
[收稿日期] 1999-04-07 [修回日期] 1999-09-03, 百拇医药
单位：柳兆芳(皖南医学院弋矶山医院麻醉科，安徽 芜湖 241001)；柯永胜 程光华 汪佑霞(弋矶山医院实验室)
关键词：心肌；低氧；洋地黄；腺苷三磷酸酶，钠，钾；地高辛
中国病理生理杂志000510
[摘 要] 目的：评价地高辛抗血清对抗心肌缺氧损伤的作用与机制。方法： 制备心肌组织缺氧模型，观察不同剂量的地高辛抗血清对缺氧损伤心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响。结果： 缺氧损伤时心肌组织内洋地黄素水平明显高于正常对照组，心肌细胞膜ATP酶活性明显低于正常对照组；地高辛抗血清能明显拮抗缺氧对心肌细胞膜ATP酶活性的抑制作用。结论： 缺氧所致心肌组织内洋地黄素水平升高是缺氧介导心肌损伤的分子生物学基础，地高辛抗血清通过拮抗内洋地黄素的作用，减轻缺氧所致心肌损伤，对缺氧心肌具有保护作用。
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[中图分类号] R541 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0418-03
The effect of anti-digoxin antiserum on endoxin and membrane ATPase activity in hypoxic myocardium
LIU Zhao-fang, KE Yong-sheng,CHENG Guang-hua, WANG You-xia
(Department of Anesthesiology,Yijishan Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001, China)
[Abstract] AIM: To evaluate the antagonistic effect of anti-digoxin antiserum on hypoxic myocardium and its mechanism. METHODS: It was observed that different concentration of anti-digoxin antiserum effect on endoxin and cell membrane ATPase activity in hypoxic myocardium model.RESULTS: The endoxin level was much higher,cell membrane ATPase activity was much lower in hypoxic myocardium than those of normal; anti-digoxin antiserum can resume membrane ATPase activity. CONCLUSION: Rise of endoxin was basic in molecular biology of myocardial damage during myocardial hypoxia. Anti-digoxin antiserum decreased myocardial damage and has protective effect on hypoxic myocardium by antagonistic effect of endoxin.
, 百拇医药
[MeSH] Myocardium; Anoxia; Digitalis; Adenosine triphosphatase, sodium, potassium; Digoxin
心肌缺氧损伤的分子生物学基础是细胞内钙超载，而细胞内钙超载与很多体液因子对细胞膜ATP酶的抑制作用有关，内洋地黄素(endoxin or endogenous digitalis-like factor)是一种具有与洋地黄生物活性相似的体液因子，可能是洋地黄受体的内源性递质，与地高辛抗体有交叉性结合，可明显抑制细胞膜ATP酶，具有强心、利尿和收缩血管作用，在急性心肌缺血时明显升高[1,2]。本实验采用心肌组织匀浆制成缺氧模型(此模型类似于在体的心脏缺血损伤)[3]，利用内洋地黄素与地高辛抗体具有交叉结合的特点，观察不同剂量的地高辛抗血清对缺氧损伤心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响，以阐明地高辛抗血清对缺氧损伤的心肌是否具有保护作用及其作用机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
新西兰白兔8只，雌雄兼有，体重(2.5±0.5)kg，由皖南医学院实验动物中心提供。用2%硫喷妥钠40 mg.kg-1腹腔注射麻醉，麻醉成功后，立即剖胸取出心脏，用预冷的生理盐水作主动脉逆行灌注冲洗，滤纸吸干，取左心室心肌组织2 g，加入预冷的生理盐水10mL，用匀浆器制成匀浆，4℃ 3 000 r/min离心5 min，各取上清液0.9 mL分置于试管中，并分4组：(A组)正常对照组：向试管中通入95% O2和5% CO2，持续20 min；(B组)缺氧组：向试管中通入95%的N2和5%的CO2，持续20 min；(C组)缺氧加低浓度地高辛抗血清组：先向试管中加入1∶30 000兔抗兔地高辛抗血清(北京邦定生物医学公司提供)0.1 mL，再作缺氧处理；(D组)缺氧加高浓度地高辛抗血清组：先向试管中加入1∶10 000兔抗兔地高辛抗血清0.1 mL，再作缺氧处理。
, 百拇医药
心肌组织匀浆内洋地黄素浓度测定采用放射免疫分析法，试剂盒由同济大学放射免疫技术研究所提供；ATP酶活性测定采用化学比色法，测定原理：ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷的量，以判断ATP酶活性的高低，ATP酶活性单位是以每小时分解每毫克组织蛋白产生的无机磷的含量来表示(μmolPi.mg Pro-1.h-1)；考马斯亮兰蛋白含量测定原理：蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的CBBG250显色剂加入蛋白标准液或样品时，CBBG250染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过计算吸光度可计算出蛋白含量。ATP酶试剂盒及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
统计学处理：各组数据采用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验；两因素间相互关系采用简单直线相关回归分析。, http://www.100md.com
结 果
一、地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响，见表1。
表1 地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素
和ATP酶活性的影响
Tab 1 The effect of anti-digoxin antiserum on
endoxin and membrane ATPase activity in
hypoxic myocardium (
±s, n=8) GroupEndoxin
, 百拇医药
(ng.mL-1)
Na+-K+-
ATPase(μmol.mg
Pro-1.h-1)
Ca2+-
ATPase(μmol.mg
Pro-1.h-1)
Group A
Group B
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Group C
Group D
0.11±0.04
0.16±0.04*
0.56±0.05**##
0.61±0.13**##
3.04±0.28
1.43±0.24**
3.08±0.15##
3.22±0.39##
, 百拇医药
2.79±0.43
1.78±0.37**
2.39±0.39##
2.67±0.50##
*P<0.05， **P<0.01， vs group A; ##P<0.01， vs group B
由表1可见，缺氧组心肌内洋地黄素水平明显高于正常对照组，而心肌细胞膜ATP酶活性明显低于正常对照组；预先使用地高辛抗血清后，心肌组织内洋地黄素水平升高更明显，但心肌细胞膜ATP酶活性也明显升高。
二、地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性影响的量效关系
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经相关分析发现，地高辛抗血清对缺氧心肌组织内洋地黄素水平和心肌细胞膜ATP酶活性的影响呈明显的剂量效应关系，即地高辛抗血清浓度越高，缺氧心肌组织内洋地黄素水平越高，心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性也明显升高，r分别为0.6725、0.6843和0.7966，P均<0.01。内洋地黄素水平与心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性呈明显正相关，r分别为0.9457、0.9561，P均<0.01。
讨 论
实验研究表明，心肌细胞在缺氧时，细胞内Ca2+浓度上升是导致心肌细胞不可逆损伤的主要原因[4]，因此，抑制缺氧心肌细胞内的Ca2+浓度上升，就有可能对细胞产生保护作用[5]。缺氧时心肌细胞内Ca2+浓度升高的机制与缺氧所致心肌细胞膜ATP酶活性受抑制有关，即心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶受抑制，其转运和泵出细胞内Ca2+的能力减弱，致使细胞内Ca2+积聚。但缺氧条件下，心肌细胞膜ATP酶受抑制的机制是什么，是否通过某些介质介导，仍不清楚。
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内洋地黄素是一种具有洋地黄样生物活性的因子，是公认的钠泵抑制剂，可能是洋地黄受体的内源性递质，其在高血压和心力衰竭的发生与发展过程中起十分重要的作用。由于其能特异性与洋地黄抗体结合，故利用这一特点，可用放射免疫方法检测之；同时，也利用这一特点，使用洋地黄抗体治疗高血压取得成功[6]。
本研究发现，心肌组织缺氧时，心肌组织匀浆内洋地黄素水平较正常对照组明显升高，而与此同时，心肌细胞膜ATP酶活性则较正常对照组明显下降，表明缺氧可促使心肌细胞合成和释放内洋地黄素，升高的内洋地黄素与其受体结合，抑制心肌细胞膜ATP酶活性，使细胞内Ca2+升高。预先使用地高辛抗血清后，心肌组织内洋地黄素水平进一步升高，但心肌细胞膜ATP酶活性也明显升高；而且，地高辛抗血清浓度越高，心肌细胞膜ATP酶活性升高程度也越明显，说明地高辛抗血清通过与内洋地黄素结合使后者与心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶结合量减少，使酶受抑制程度减轻，并得到恢复。使用地高辛抗血清后，心肌组织匀浆内洋地黄素水平的升高可能与地高辛抗血清将内洋地黄素从心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶受体位置上置换出来有关。因为放射免疫方法只能测定游离的内洋地黄素或其抗原抗体复合物，而不能测定与细胞膜结合的内洋地黄素。
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本研究初步证实，缺氧性心肌细胞损伤可能与内洋地黄素有关，地高辛抗血清通过拮抗内洋地黄素的作用而对缺氧心肌具有保护作用。
[参 考 文 献]
[1] 柯永胜，陶月玉，杨尚印，等.慢性充血性心力衰竭患者内源性洋地黄样因子浓度变化的意义[J].中华内科杂志，1990， 29:11.
[2] 柯永胜，陶月玉，杨尚印，等.急性心肌梗死患者血清内源性洋地黄样因子的动态变化[J].中华心血管病杂志，1990，18:360.
[3] 张昀昀，王 军，章 鲁，等.氨氯地平对缺氧和复氧损伤心肌细胞内pH值及Ca2+浓度的影响[J].中华心血管病杂志，1997，25:219.
[4] Silverman HS,Stern MD.Zonic basis of ischemic cardiac injury:insights from cellular studies[J].Cardiovasc Res,1994，28:581.
[5] 王 军，张佩瑾，章 鲁，等.维拉帕米和Mn2+对缺氧和复氧单心肌细胞游离Ca2+的影响[J].中国病理生理杂志，1996，12:95～98.
[6] 柯永胜.抗地高辛抗体与心血管系统疾病[J].心血管病学进展，1991，12:35.
[收稿日期] 1999-04-07 [修回日期] 1999-09-03, 百拇医药