血小板生成素对体外人血小板活化的影响
作者：杜新 汪明春 李明 万军梅
单位：杜新 汪明春(深圳市红十字会医院血液科， 广东 深圳 518029)；李明 万军梅(深圳市血液病研究所)
关键词：血小板生成素；血小板活化；荧光抗体技术；流式细胞术
中国病理生理杂志000507
[摘 要] 目的：研究血小板生成素(TPO)及其他造血生长因子在体外对人血小板活化的影响。方法：应用荧光标记单克隆抗体和流式细胞技术。结果：终浓度120 ng/mL的TPO在体外能直接诱导人血小板活化，活化率为8.89%～39.92%,中位数17.43%,40 ng/mL的较低浓度TPO及100 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-3(IL-3)对血小板活化无影响。结论：TPO对血小板功能有促进作用，较高浓度的TPO可直接诱导血小板活化。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R558+.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0409-03
Effect of thrombopoietin on platelet activation in vitro
DU Xin，WANG Ming-chun
(Dept.of Hematology，Shenzhen Red Cross Hospital,Shenzhen 518029, China;)
LI Ming， WAN Jun-mei
(The Institute of Hematology of Shenzhen)
, 百拇医药
[Abstract] AIM:To study the effects of thrombopoietin(TPO) and other hematopoietic cytokines on platelet activation. METHODS: Using fluorescent-labeled monoclonal antibodies and flow cytometry. RESULTS:The percentage range of platelets activated by 120 ng/mL TPO was 8.89%～39.92%，mean value was 17.43%; However，there were no effects of TPO 40 ng/mL and GM-CSF 100 ng/mL and IL-3 100 ng/mL on platelet activation. CONCLUSION:Higher concentration of TPO directly stimulated platelet activation.
, http://www.100md.com
[MeSH] Thrombopoietin; Platelet activation; Fluorescent antibody technique; Flow cytometry
血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是近年来发现的具有调节巨核细胞生长和血小板生成的造血生长因子[1]。有关临床实验表明,TPO可促进肿瘤患者化疗后血小板数量的恢复,因此将TPO应用于治疗放、化疗所致的血小板减少症,具有重要的实践意义。然而，TPO对血小板功能的影响迄今国内未见报道。本文应用荧光标记单克隆抗体和流式细胞术研究TPO以及其他造血生长因子在体外对人血小板活化的影响。
材 料 和 方 法
一、材料
rhTPO英国Pepro Tech产品;rhGM-CSF美国Schering-Plough公司产品;rhIL-3深圳南方制药厂产品;抗CD61-FITC、抗CD62-PE及IgG1-FITC、IgG1-PE美国BD公司产品。流式细胞仪为美国BD公司产品，型号FACS Calibur。
, 百拇医药
二、方法
(一)富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)制备 实验对象为健康体检者9人，其中男6人，女3人，年龄20～32岁，平均26岁。无心脑血管及血液系统疾患,近一周内未服用任何影响血小板功能的药物。空腹抽静脉血3 mL置塑料管内，3.8%枸橼酸钠抗凝，800 r/min离心8 min，分离上层PRP备用。
(二)细胞因子与血小板孵育 各取PRP 50μL于塑料试管内，分别与生理盐水(空白对照组)或与终浓度分别为120 ng/mL、40 ng/mL的rhTPO,终浓度100 ng/mL的rhIL-3，终浓度100 ng/mL的rhGM-CSF(细胞因子组)室温下孵育5 min，反应体系容积为300 μL。
(三)荧光抗体标记 孵育后，各取上液50 μL于塑料试管内，依次分别加入下列单抗各20μL。①IgG1-FITC及IgG1-PE(isotype对照)；②抗CD61-FITC及抗CD62-PE。在黑暗中室温条件下孵育30 min，以新鲜配制的1%多聚甲醛1 mL终止反应。
, http://www.100md.com
(四)FCM检测 按流式细胞仪常规操作方法进行。每份检测血小板数20 000个。经自动分析后得出结果，CD62阳性表达率(CD62占CD61的比率)即为血小板活化率。
三、统计处理
采用Wilcoxon符号配对秩和检验。中位数表示平均活化率。
结 果
结果显示:终浓度为120ng/mL的TPO诱导血小板活化率为8.89%～39.92%，中位数17.43%,明显高于生理盐水对照组3.82%(P<0.01)；而终浓度为40 ng/mL的TPO及终浓度为100 ng/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和白细胞介素-3(interleukin 3, IL-3)对血小板活化无影响(P>0.05),(见表1)。
, http://www.100md.com
表1 三种细胞因子作用下的血小板活化率
Tab 1 The ratio of activated platelet in actions of
three kinds of cytokines(%) Sample
Control
TPO(120
ng/mL)
TPO(40
ng/mL)
GM
-CSF
, 百拇医药 IL-3
1
3.77
11.83
4.20
4.33
4.10
2
1.57
17.43
2.88
1.35
3.25
, 百拇医药
3
4.15
11.81
3.31
1.53
4.41
4
4.56
39.92
5.22
4.82
3.22
5
, 百拇医药
3.25
20.69
3.10
3.83
2.87
6
3.94
8.89
4.12
1.84
1.72
7
1.93
, 百拇医药
27.92
4.10
3.40
3.20
8
3.83
25.24
3.78
1.88
2.40
9
4.64
11.20
, 百拇医药
3.28
3.24
4.12
Mean(%)
3.82
17.43*
3.72△
2.84△
3.24△
*P<0.01, vs control; △P>0.05, vs control讨 论
已有研究表明，TPO可增强ADP诱导的血小板聚集反应；还可直接增强血小板与胶原的粘附及增加血小板与纤维蛋白原的结合[2]。这初步证实TPO对血小板活化功能具有一定的协同和促进作用。然而，要进一步探讨TPO在血小板活化中的作用，则需要更直观、更灵敏的检测手段。
, 百拇医药
P-选择素(P-Selectin，CD62P，GMP-140)是血小板α-颗粒膜蛋白的组成部分，它在血小板活化时暴露于血小板表面，是血小板活化的重要分子标志物。因此,测定CD62的表达能更直观地判定血小板活化程度。我们应用双色标记流式细胞术,研究发现在体外终浓度120 ng/mL的TPO增强CD62的表达，即促进血小板活化，活化率8.89%～39.92%,中位数为17.43%(P<0.01)，明显高于生理盐水对照；但随TPO浓度的降低，其促血小板活化的作用减弱，终浓度为40 ng/mL的TPO对血小板的活化作用与对照组相比无差异(P>0.05)。上述结果表明，较高浓度的TPO具有直接诱导血小板活化、增强血小板功能的作用。其最低有效浓度以及与血小板活化率的量效关系有待进一步研究阐明。已知血小板膜表面存在TPO受体(c-Mpl)。Wun等[3]实验发现，将PRP中预先加入可溶性TPO受体s-Mpl，再加入TPO共同孵育，则CD62表达受到完全抑制，这说明TPO诱导血小板活化是通过与血小板膜上c-Mpl结合而实现的。
, http://www.100md.com
Meng等报道[4]，正常人血浆TPO浓度仅0～0.16 ng/mL；肿瘤化疗后伴血小板减少患者血浆TPO浓度为1.33～2.37 ng/mL。本文实验表明终浓度为40 ng/mL的TPO无诱导血小板活化的作用，因此我们认为，在生理和病理状态下内源性TPO对血小板活化无影响。而值得注意的是，临床应用rhTPO治疗血小板减少症时应适量掌握其用量；否则，过量应用使血液内外源性TPO浓度过高进而可能导致血小板活化，而活化后的血小板则失去其参与止血的功能。
GM-CSF和IL-3是已用于临床的造血细胞生长因子。临床研究表明，大剂量化疗或体内注射GM-CSF或IL-3后，其血清浓度皆可达100 ng/mL以上。故本实验选择终浓度100 ng/mL的GM-CSF和IL-3，观察其在体外对血小板活化的影响。结果表明，100 ng/mL的GM-CSF及IL-3并不增加CD62的表达，初步证实其在体外无诱导血小板活化的作用。
总之，TPO对血小板功能具有促进作用，较高浓度的TPO能直接诱导血小板活化；较低浓度的TPO对血小板的活化无影响。这对今后临床应用rhTPO治疗血小板减少症可能具有一定的指导意义。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Kanshansky K，LoK S，Holly RD，et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin [J].Nature, 1994, 369:568～571.
[2] Chen J，Herceg-Harjacek L，Groopman JE，et al.Regulation of platelet activation in vitro by the c-Mpl ligand, thrombopoietin [J]. Blood,1995,86:4054～4062.
[3] Wun T，Paglieroni T，Hammond WP，et al.Thrombopoietin is synergistic with other hematopoietico growth factors and physiologic platelet agonist for platelet activation in vitro[J]. Am J Hematol,1997,54:225～232.
[4] Meng YG,Martin TG, Peterson ML,et al.Circulating thrombopoietin concentration in thrombocytopenic patients,including cancer patients following chemotherapy, with or without peripheral blood progenitor cell transplantation [J].Br J Haematol,1996,95:535～541.
[收稿日期]1999-03-16 [修回日期]1999-07-05, http://www.100md.com
单位：杜新 汪明春(深圳市红十字会医院血液科， 广东 深圳 518029)；李明 万军梅(深圳市血液病研究所)
关键词：血小板生成素；血小板活化；荧光抗体技术；流式细胞术
中国病理生理杂志000507
[摘 要] 目的：研究血小板生成素(TPO)及其他造血生长因子在体外对人血小板活化的影响。方法：应用荧光标记单克隆抗体和流式细胞技术。结果：终浓度120 ng/mL的TPO在体外能直接诱导人血小板活化，活化率为8.89%～39.92%,中位数17.43%,40 ng/mL的较低浓度TPO及100 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-3(IL-3)对血小板活化无影响。结论：TPO对血小板功能有促进作用，较高浓度的TPO可直接诱导血小板活化。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R558+.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0409-03
Effect of thrombopoietin on platelet activation in vitro
DU Xin，WANG Ming-chun
(Dept.of Hematology，Shenzhen Red Cross Hospital,Shenzhen 518029, China;)
LI Ming， WAN Jun-mei
(The Institute of Hematology of Shenzhen)
, 百拇医药
[Abstract] AIM:To study the effects of thrombopoietin(TPO) and other hematopoietic cytokines on platelet activation. METHODS: Using fluorescent-labeled monoclonal antibodies and flow cytometry. RESULTS:The percentage range of platelets activated by 120 ng/mL TPO was 8.89%～39.92%，mean value was 17.43%; However，there were no effects of TPO 40 ng/mL and GM-CSF 100 ng/mL and IL-3 100 ng/mL on platelet activation. CONCLUSION:Higher concentration of TPO directly stimulated platelet activation.
, http://www.100md.com
[MeSH] Thrombopoietin; Platelet activation; Fluorescent antibody technique; Flow cytometry
血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是近年来发现的具有调节巨核细胞生长和血小板生成的造血生长因子[1]。有关临床实验表明,TPO可促进肿瘤患者化疗后血小板数量的恢复,因此将TPO应用于治疗放、化疗所致的血小板减少症,具有重要的实践意义。然而，TPO对血小板功能的影响迄今国内未见报道。本文应用荧光标记单克隆抗体和流式细胞术研究TPO以及其他造血生长因子在体外对人血小板活化的影响。
材 料 和 方 法
一、材料
rhTPO英国Pepro Tech产品;rhGM-CSF美国Schering-Plough公司产品;rhIL-3深圳南方制药厂产品;抗CD61-FITC、抗CD62-PE及IgG1-FITC、IgG1-PE美国BD公司产品。流式细胞仪为美国BD公司产品，型号FACS Calibur。
, 百拇医药
二、方法
(一)富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)制备 实验对象为健康体检者9人，其中男6人，女3人，年龄20～32岁，平均26岁。无心脑血管及血液系统疾患,近一周内未服用任何影响血小板功能的药物。空腹抽静脉血3 mL置塑料管内，3.8%枸橼酸钠抗凝，800 r/min离心8 min，分离上层PRP备用。
(二)细胞因子与血小板孵育 各取PRP 50μL于塑料试管内，分别与生理盐水(空白对照组)或与终浓度分别为120 ng/mL、40 ng/mL的rhTPO,终浓度100 ng/mL的rhIL-3，终浓度100 ng/mL的rhGM-CSF(细胞因子组)室温下孵育5 min，反应体系容积为300 μL。
(三)荧光抗体标记 孵育后，各取上液50 μL于塑料试管内，依次分别加入下列单抗各20μL。①IgG1-FITC及IgG1-PE(isotype对照)；②抗CD61-FITC及抗CD62-PE。在黑暗中室温条件下孵育30 min，以新鲜配制的1%多聚甲醛1 mL终止反应。
, http://www.100md.com
(四)FCM检测 按流式细胞仪常规操作方法进行。每份检测血小板数20 000个。经自动分析后得出结果，CD62阳性表达率(CD62占CD61的比率)即为血小板活化率。
三、统计处理
采用Wilcoxon符号配对秩和检验。中位数表示平均活化率。
结 果
结果显示:终浓度为120ng/mL的TPO诱导血小板活化率为8.89%～39.92%，中位数17.43%,明显高于生理盐水对照组3.82%(P<0.01)；而终浓度为40 ng/mL的TPO及终浓度为100 ng/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和白细胞介素-3(interleukin 3, IL-3)对血小板活化无影响(P>0.05),(见表1)。
, http://www.100md.com
表1 三种细胞因子作用下的血小板活化率
Tab 1 The ratio of activated platelet in actions of
three kinds of cytokines(%) Sample
Control
TPO(120
ng/mL)
TPO(40
ng/mL)
GM
-CSF
, 百拇医药 IL-3
1
3.77
11.83
4.20
4.33
4.10
2
1.57
17.43
2.88
1.35
3.25
, 百拇医药
3
4.15
11.81
3.31
1.53
4.41
4
4.56
39.92
5.22
4.82
3.22
5
, 百拇医药
3.25
20.69
3.10
3.83
2.87
6
3.94
8.89
4.12
1.84
1.72
7
1.93
, 百拇医药
27.92
4.10
3.40
3.20
8
3.83
25.24
3.78
1.88
2.40
9
4.64
11.20
, 百拇医药
3.28
3.24
4.12
Mean(%)
3.82
17.43*
3.72△
2.84△
3.24△
*P<0.01, vs control; △P>0.05, vs control讨 论
已有研究表明，TPO可增强ADP诱导的血小板聚集反应；还可直接增强血小板与胶原的粘附及增加血小板与纤维蛋白原的结合[2]。这初步证实TPO对血小板活化功能具有一定的协同和促进作用。然而，要进一步探讨TPO在血小板活化中的作用，则需要更直观、更灵敏的检测手段。
, 百拇医药
P-选择素(P-Selectin，CD62P，GMP-140)是血小板α-颗粒膜蛋白的组成部分，它在血小板活化时暴露于血小板表面，是血小板活化的重要分子标志物。因此,测定CD62的表达能更直观地判定血小板活化程度。我们应用双色标记流式细胞术,研究发现在体外终浓度120 ng/mL的TPO增强CD62的表达，即促进血小板活化，活化率8.89%～39.92%,中位数为17.43%(P<0.01)，明显高于生理盐水对照；但随TPO浓度的降低，其促血小板活化的作用减弱，终浓度为40 ng/mL的TPO对血小板的活化作用与对照组相比无差异(P>0.05)。上述结果表明，较高浓度的TPO具有直接诱导血小板活化、增强血小板功能的作用。其最低有效浓度以及与血小板活化率的量效关系有待进一步研究阐明。已知血小板膜表面存在TPO受体(c-Mpl)。Wun等[3]实验发现，将PRP中预先加入可溶性TPO受体s-Mpl，再加入TPO共同孵育，则CD62表达受到完全抑制，这说明TPO诱导血小板活化是通过与血小板膜上c-Mpl结合而实现的。
, http://www.100md.com
Meng等报道[4]，正常人血浆TPO浓度仅0～0.16 ng/mL；肿瘤化疗后伴血小板减少患者血浆TPO浓度为1.33～2.37 ng/mL。本文实验表明终浓度为40 ng/mL的TPO无诱导血小板活化的作用，因此我们认为，在生理和病理状态下内源性TPO对血小板活化无影响。而值得注意的是，临床应用rhTPO治疗血小板减少症时应适量掌握其用量；否则，过量应用使血液内外源性TPO浓度过高进而可能导致血小板活化，而活化后的血小板则失去其参与止血的功能。
GM-CSF和IL-3是已用于临床的造血细胞生长因子。临床研究表明，大剂量化疗或体内注射GM-CSF或IL-3后，其血清浓度皆可达100 ng/mL以上。故本实验选择终浓度100 ng/mL的GM-CSF和IL-3，观察其在体外对血小板活化的影响。结果表明，100 ng/mL的GM-CSF及IL-3并不增加CD62的表达，初步证实其在体外无诱导血小板活化的作用。
总之，TPO对血小板功能具有促进作用，较高浓度的TPO能直接诱导血小板活化；较低浓度的TPO对血小板的活化无影响。这对今后临床应用rhTPO治疗血小板减少症可能具有一定的指导意义。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Kanshansky K，LoK S，Holly RD，et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin [J].Nature, 1994, 369:568～571.
[2] Chen J，Herceg-Harjacek L，Groopman JE，et al.Regulation of platelet activation in vitro by the c-Mpl ligand, thrombopoietin [J]. Blood,1995,86:4054～4062.
[3] Wun T，Paglieroni T，Hammond WP，et al.Thrombopoietin is synergistic with other hematopoietico growth factors and physiologic platelet agonist for platelet activation in vitro[J]. Am J Hematol,1997,54:225～232.
[4] Meng YG,Martin TG, Peterson ML,et al.Circulating thrombopoietin concentration in thrombocytopenic patients,including cancer patients following chemotherapy, with or without peripheral blood progenitor cell transplantation [J].Br J Haematol,1996,95:535～541.
[收稿日期]1999-03-16 [修回日期]1999-07-05, http://www.100md.com