碱性成纤维细胞生长因子在低氧大鼠肺动脉的表达及其对肺动脉张力的影响
作者：冉丕鑫 聂胜利 陈颜芳 陈顺存
单位：冉丕鑫 陈顺存(广州医学院附一院 广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510182)；聂胜利(中山医科大学孙逸仙纪念医院)；陈颜芳(广东省人民医院心研所)
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；肺动脉；大鼠；低氧
中国病理生理杂志000618
[摘 要] 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在低氧性肺动脉高压发病中的可能作用。方法：应用逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)技术观察低氧大鼠肺动脉bFGF的表达水平，并观察bFGF对离体大鼠肺动脉环收缩功能的影响。结果：①低氧时，肺动脉bFGF mRNA表达明显增加，bFGF与β-actin的RT-PCR反应产物的放射强度(counts*min-1)之比由对照的0.5074上升到0.9182(低氧1周)和0.7812(低氧2周)(P均<0.05)。②bFGF能收缩离体大鼠肺血管环，收缩强度与剂量相关(r=0.695,P<0.05),其EC50 为2.62×10-7mol/L。结论：提示bFGF可能参与低氧性肺动脉高压的发病过程。
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[中图分类号] R543.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0549-03
Expression of bFGF mRNA in pulmonary artery of rat with chronic hypoxia and its effect on tension of rat pulmonary artery in vitro
RAN Pi-xin, CHEN Shun-cun
(Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, China)
NIE Sheng-li
, 百拇医药
(The Second Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)
CHEN Yan-fang
(Guangdong Provincial Hospital)
[Abstract] AIM: To explore the role of basic-fibroblast growth factor (bFGF) in the development of pulmonary hypertension induced by hypoxia. METHODS: 1) The pulmonary arteries of SD rats with hypoxia for one and two weeks were isolated, from which the total RNA were extracted by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorform .Then the levels of mRNA were measured by RT-PCR. 2) About 3mm-long arterial rings cut from SD rat pulmonary arterial stem were suspended between stainless steelhooks in chamber with warmed (37℃) Kreb's solution. Different concentrations of bFGF were added in a cumulative fashion into the chamber where the rings were suspended. The cumulative concentration response curve was obtained. RESULTS: 1)The levels of bFGF mRNA in pulmonary artery of rats with hypoxia were increased significantly compared with those that without hypoxia (2578±384 counts*min-1 (control) vs 5303±756 (hypoxia) for 1 week and 4054±547 (hypoxia) for 2 weeks, P all <0.05). 2) bFGF at concentrations ranged from 5.56×10-10～2.78×10-7mol/L caused dose-dependent contraction of vessel rings of rat pulmonary artery (r=0.695,P<0.05), with EC50 being 2.62×10-7mol/L. CONCLUSION: bFGF may play an important role in the hypoxic pulmonary hypertension.
, 百拇医药
[MeSH] Fibroblast growth factor, basic; Pulmonary artery; Rats; Anoxia
肺小动脉结构改建是慢性低氧性肺动脉高压的主要病理特征。一些生长因子和癌基因可能与该改建过程相关[1，2]。 碱性成纤维细胞生长因子(basic-fibroblast growth factor, bFGF)作为主要的促血管生长因子之一，其能促进内皮细胞与平滑肌细胞的增生[3]，我们以前用免疫组织化学染色法发现低氧两周时，肺血管壁bFGF的阳性染色颗粒明显多于对照组，故推测bFGF也可能参与肺血管的改建过程[4] 。本实验用逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)技术进一步观察低氧对大鼠肺动脉壁表达bFGF mRNA的影响，同时观察bFGF对肺血管收缩的作用，以探讨它在低氧性肺血管收缩过程中的作用。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、大鼠肺动脉壁bFGF检测
(一)动物来源及低氧方法 体重250～300 g雄性SD 大鼠30只(广东省卫生厅医用实验动物厂提供)，随机分成对照组，低氧1周组和低氧2周组，每组各10只。低氧大鼠置于自制常压低氧箱内，调节箱内氧浓度为10%，每天低氧8 h，对照组除不给低氧外，其它饲养条件与低氧组相同。
(二)标本取材及处理 处死动物开胸取出心肺，小心分离肺动脉，立即置液氮内冻存待用。实验用所有器皿均在泡酸冲洗后于180℃干烤8 h以上或以DEPC水在37℃处理12 h，再高温高压消毒。
(三)细胞总RNA提取 按文献报道之异硫氰酸胍法提取肺动脉壁总RNA[5] 。
(四)逆转录反应 采用美国promega公司的逆转录试剂盒，按盒内说明书操作：在4℃按下列顺序取各试剂加入灭菌的EP管中：25 mmol/L MgCl2 4 μL 、10×缓冲液2 μL,10 mmol/L dNTP混合物2 μL、RNase抑制剂20 μL、15-寡聚胸腺嘧啶核苷酸0.1 μg 、禽源反转录酶20 U、总RNA 4 μL，加水至总体积20 μL，于42℃水浴60 min，反转录完成后再95℃水浴中加热10 min，灭活AMV反转录酶，终止反应。
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(五) 定量PCR 本实验所用引物由上海细胞所合成。引物序列为：β-actin：5’-ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’；5’-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’，由该对引物可扩增出一长度为838bp的β-actin片段。bFGF[6]：5’-GTATGAAACGGCGGCTTCTT-3’，5’-TGAGTCAGCTCTTAGCAGAC-3’，用这对引物扩增出的bFGF片段长度为364 bp。
β-actin扩增反应步骤如下：在4℃时依次向无菌EP管中加入10×PCR缓冲液5 μL，上、下游引物各1 μL， Taq酶1.25 U，混合dNTP 2 μL、逆转录混合产物4 μL、 α-[32P] dCTP0.1 μCi，加水至50 μL。变性、退火与延伸条件分别为90℃ 1 min 、50℃ 1 min 、70℃ 1 min，共30个循环，最后72℃ 延伸10 min 后4℃保存。bFGF的扩增反应步骤为：依次于无菌EP管中加入：10×PCR缓冲液5 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物4 μL，逆转录产物4 μL，α-[32P] dCTP 0.37×104 Bq，加水至50 μL；反应条件为变性94℃ 1 min ，退火50℃ 1 min ， 延伸70℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。反应完毕取10 μL 扩增产物行1% 琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下切取含有PCR产物的凝胶条带，用液体闪烁计数仪检测扩增物中[32P]的放射强度(counts*min-1)。
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二、大鼠肺动脉环离体收缩实验
(一) 主要仪器与试剂 bFGF为Sigma公司产品，Kreb氏液购自市售商店。八道生理记录仪为日本光电公司产品。
(二) 实验动物与标本制备 断头处死体重300～350 g 的雄性SD大鼠，制成长约3 mm 的血管环，置入盛37℃ Kreb氏液的浴槽内，能通入95% O2-5% CO2 混合气体，平衡备用。
(三)肺血管收缩反应 让血管环在最佳静息张力800 mg下稳定1 h，其间每隔15 min更换1次新鲜Kreb氏液，以张力传感器、八道生理记录仪等记录血管环的张力。按累积法给予bFGF，先从阈浓度开始，待出现收缩平台后，又给予既定剂量的bFGF，记录血管环张力变化。
结 果
, 百拇医药
一、低氧大鼠肺动脉bFGF的表达
低氧时SD大鼠肺动脉壁bFGF mRNA表达明显高于对照组，表1。
表1 大鼠肺动脉RT-PCR产物放射性强度
Tab 1 The radio-strength of RT-PCR product of rat
pulmonary artery (
±s,n=10) Group
bFGF
(counts.min-1)
β-actin
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(counts.min-1)
bFGF/β-actin
(%)
Control
2578±384
5081±287
50.74
Hypoxia 1 week
5303±756*
5375±253
91.82*
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Hypoxia 2 weeks
4054±547*
5197±207
78.12*
*P<0.05， vs control
二、bFGF对大鼠肺动脉的收缩作用
bFGF能引起大鼠离体肺动脉环的收缩，在浓度5.56×10-10～2.78×10-7mol/L时，其收缩强度与剂量呈正相关(r=0.695,P<0.05),其EC50为2.62×10-7mol/L， 图1。
, 百拇医药
Fig 1 The effect of bFGF on tension of the pulmonary arterial rings of rat in vitro (n=5, r=0.695, P<0.05)
图1 bFGF对离体大鼠肺血管环收缩功能的影响
讨 论
碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)刺激成纤维细胞及平滑肌细胞增殖的功能很强。成纤维细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞及神经细胞等均可产生bFGF。我们以前用免疫组织化学染色法发现，低氧大鼠肺组织内bFGF阳性染色物质明显多于非低氧对照组[4]。本实验用RT-PCR方法证实低氧可促进大鼠肺动脉bFGF mRNA的表达增加，根据bFGF的致分裂特性，我们认为它在低氧性肺血管结构的重建中可能起一定作用。
业已证明，低氧性肺动脉高压的发病包含有两个重要的发病环节，即低氧性肺血管收缩反应和血管重建。除一系列生长因子直接刺激肺动脉细胞成分分裂增殖外，持续的血管收缩也可引起血管壁的适应性增殖。因此，本实验还观察了bFGF对肺血管收缩功能的作用，发现bFGF能收缩大鼠离体肺动脉环。提示bFGF可能参与低氧性肺动脉高压发病的两个环节。
, 百拇医药
[基金项目] 广州市计委重大攻关项目(编号951030)
[参 考 文 献]
[1] 冉丕鑫，钟南山. 生长因子、原癌基因与低氧性肺动脉高压[J]. 基础医学与临床，1996，16(1)：1～5.
[2] Demiryurek AT, Wadsworth RM, Kane KA, et al. The role of endothelium in hypoxic constriction of human pulmonary artery rings[J]. Am Res Respir Dis, 1993,147:283～287.
[3] Slavin I. Fibroblast growth factors: At the heart of angiogenesis[J]. Cell Biol Int, 1995,19:431～435.
, 百拇医药
[4] 欧阳能太，冉丕鑫，杜志强，等. 缺氧对大鼠肺组织成纤维细胞生长因子和c-myc癌基因表达的影响[J]. 中华结核和呼吸杂志，1997，20(1)：22～24.
[5] Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chlorform extraction[J]. Anal Bioch,1987,162:156～159.
[6] Shima SS. Complementary DNA cloning and sequencing rat ovarian basic fibroblast growth factor and tissue distribution study of its mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1988,157:256～263.
[收稿日期] 2000-03-23 [修回日期] 2000-05-08
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单位：冉丕鑫 陈顺存(广州医学院附一院 广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510182)；聂胜利(中山医科大学孙逸仙纪念医院)；陈颜芳(广东省人民医院心研所)
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；肺动脉；大鼠；低氧
中国病理生理杂志000618
[摘 要] 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在低氧性肺动脉高压发病中的可能作用。方法：应用逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)技术观察低氧大鼠肺动脉bFGF的表达水平，并观察bFGF对离体大鼠肺动脉环收缩功能的影响。结果：①低氧时，肺动脉bFGF mRNA表达明显增加，bFGF与β-actin的RT-PCR反应产物的放射强度(counts*min-1)之比由对照的0.5074上升到0.9182(低氧1周)和0.7812(低氧2周)(P均<0.05)。②bFGF能收缩离体大鼠肺血管环，收缩强度与剂量相关(r=0.695,P<0.05),其EC50 为2.62×10-7mol/L。结论：提示bFGF可能参与低氧性肺动脉高压的发病过程。
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[中图分类号] R543.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0549-03
Expression of bFGF mRNA in pulmonary artery of rat with chronic hypoxia and its effect on tension of rat pulmonary artery in vitro
RAN Pi-xin, CHEN Shun-cun
(Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, China)
NIE Sheng-li
, 百拇医药
(The Second Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)
CHEN Yan-fang
(Guangdong Provincial Hospital)
[Abstract] AIM: To explore the role of basic-fibroblast growth factor (bFGF) in the development of pulmonary hypertension induced by hypoxia. METHODS: 1) The pulmonary arteries of SD rats with hypoxia for one and two weeks were isolated, from which the total RNA were extracted by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorform .Then the levels of mRNA were measured by RT-PCR. 2) About 3mm-long arterial rings cut from SD rat pulmonary arterial stem were suspended between stainless steelhooks in chamber with warmed (37℃) Kreb's solution. Different concentrations of bFGF were added in a cumulative fashion into the chamber where the rings were suspended. The cumulative concentration response curve was obtained. RESULTS: 1)The levels of bFGF mRNA in pulmonary artery of rats with hypoxia were increased significantly compared with those that without hypoxia (2578±384 counts*min-1 (control) vs 5303±756 (hypoxia) for 1 week and 4054±547 (hypoxia) for 2 weeks, P all <0.05). 2) bFGF at concentrations ranged from 5.56×10-10～2.78×10-7mol/L caused dose-dependent contraction of vessel rings of rat pulmonary artery (r=0.695,P<0.05), with EC50 being 2.62×10-7mol/L. CONCLUSION: bFGF may play an important role in the hypoxic pulmonary hypertension.
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[MeSH] Fibroblast growth factor, basic; Pulmonary artery; Rats; Anoxia
肺小动脉结构改建是慢性低氧性肺动脉高压的主要病理特征。一些生长因子和癌基因可能与该改建过程相关[1，2]。 碱性成纤维细胞生长因子(basic-fibroblast growth factor, bFGF)作为主要的促血管生长因子之一，其能促进内皮细胞与平滑肌细胞的增生[3]，我们以前用免疫组织化学染色法发现低氧两周时，肺血管壁bFGF的阳性染色颗粒明显多于对照组，故推测bFGF也可能参与肺血管的改建过程[4] 。本实验用逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)技术进一步观察低氧对大鼠肺动脉壁表达bFGF mRNA的影响，同时观察bFGF对肺血管收缩的作用，以探讨它在低氧性肺血管收缩过程中的作用。
材 料 和 方 法
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一、大鼠肺动脉壁bFGF检测
(一)动物来源及低氧方法 体重250～300 g雄性SD 大鼠30只(广东省卫生厅医用实验动物厂提供)，随机分成对照组，低氧1周组和低氧2周组，每组各10只。低氧大鼠置于自制常压低氧箱内，调节箱内氧浓度为10%，每天低氧8 h，对照组除不给低氧外，其它饲养条件与低氧组相同。
(二)标本取材及处理 处死动物开胸取出心肺，小心分离肺动脉，立即置液氮内冻存待用。实验用所有器皿均在泡酸冲洗后于180℃干烤8 h以上或以DEPC水在37℃处理12 h，再高温高压消毒。
(三)细胞总RNA提取 按文献报道之异硫氰酸胍法提取肺动脉壁总RNA[5] 。
(四)逆转录反应 采用美国promega公司的逆转录试剂盒，按盒内说明书操作：在4℃按下列顺序取各试剂加入灭菌的EP管中：25 mmol/L MgCl2 4 μL 、10×缓冲液2 μL,10 mmol/L dNTP混合物2 μL、RNase抑制剂20 μL、15-寡聚胸腺嘧啶核苷酸0.1 μg 、禽源反转录酶20 U、总RNA 4 μL，加水至总体积20 μL，于42℃水浴60 min，反转录完成后再95℃水浴中加热10 min，灭活AMV反转录酶，终止反应。
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(五) 定量PCR 本实验所用引物由上海细胞所合成。引物序列为：β-actin：5’-ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’；5’-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’，由该对引物可扩增出一长度为838bp的β-actin片段。bFGF[6]：5’-GTATGAAACGGCGGCTTCTT-3’，5’-TGAGTCAGCTCTTAGCAGAC-3’，用这对引物扩增出的bFGF片段长度为364 bp。
β-actin扩增反应步骤如下：在4℃时依次向无菌EP管中加入10×PCR缓冲液5 μL，上、下游引物各1 μL， Taq酶1.25 U，混合dNTP 2 μL、逆转录混合产物4 μL、 α-[32P] dCTP0.1 μCi，加水至50 μL。变性、退火与延伸条件分别为90℃ 1 min 、50℃ 1 min 、70℃ 1 min，共30个循环，最后72℃ 延伸10 min 后4℃保存。bFGF的扩增反应步骤为：依次于无菌EP管中加入：10×PCR缓冲液5 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物4 μL，逆转录产物4 μL，α-[32P] dCTP 0.37×104 Bq，加水至50 μL；反应条件为变性94℃ 1 min ，退火50℃ 1 min ， 延伸70℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。反应完毕取10 μL 扩增产物行1% 琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下切取含有PCR产物的凝胶条带，用液体闪烁计数仪检测扩增物中[32P]的放射强度(counts*min-1)。
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二、大鼠肺动脉环离体收缩实验
(一) 主要仪器与试剂 bFGF为Sigma公司产品，Kreb氏液购自市售商店。八道生理记录仪为日本光电公司产品。
(二) 实验动物与标本制备 断头处死体重300～350 g 的雄性SD大鼠，制成长约3 mm 的血管环，置入盛37℃ Kreb氏液的浴槽内，能通入95% O2-5% CO2 混合气体，平衡备用。
(三)肺血管收缩反应 让血管环在最佳静息张力800 mg下稳定1 h，其间每隔15 min更换1次新鲜Kreb氏液，以张力传感器、八道生理记录仪等记录血管环的张力。按累积法给予bFGF，先从阈浓度开始，待出现收缩平台后，又给予既定剂量的bFGF，记录血管环张力变化。
结 果
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一、低氧大鼠肺动脉bFGF的表达
低氧时SD大鼠肺动脉壁bFGF mRNA表达明显高于对照组，表1。
表1 大鼠肺动脉RT-PCR产物放射性强度
Tab 1 The radio-strength of RT-PCR product of rat
pulmonary artery (
±s,n=10) GroupbFGF
(counts.min-1)
β-actin
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(counts.min-1)
bFGF/β-actin
(%)
Control
2578±384
5081±287
50.74
Hypoxia 1 week
5303±756*
5375±253
91.82*
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Hypoxia 2 weeks
4054±547*
5197±207
78.12*
*P<0.05， vs control
二、bFGF对大鼠肺动脉的收缩作用
bFGF能引起大鼠离体肺动脉环的收缩，在浓度5.56×10-10～2.78×10-7mol/L时，其收缩强度与剂量呈正相关(r=0.695,P<0.05),其EC50为2.62×10-7mol/L， 图1。
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Fig 1 The effect of bFGF on tension of the pulmonary arterial rings of rat in vitro (n=5, r=0.695, P<0.05)
图1 bFGF对离体大鼠肺血管环收缩功能的影响
讨 论
碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)刺激成纤维细胞及平滑肌细胞增殖的功能很强。成纤维细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞及神经细胞等均可产生bFGF。我们以前用免疫组织化学染色法发现，低氧大鼠肺组织内bFGF阳性染色物质明显多于非低氧对照组[4]。本实验用RT-PCR方法证实低氧可促进大鼠肺动脉bFGF mRNA的表达增加，根据bFGF的致分裂特性，我们认为它在低氧性肺血管结构的重建中可能起一定作用。
业已证明，低氧性肺动脉高压的发病包含有两个重要的发病环节，即低氧性肺血管收缩反应和血管重建。除一系列生长因子直接刺激肺动脉细胞成分分裂增殖外，持续的血管收缩也可引起血管壁的适应性增殖。因此，本实验还观察了bFGF对肺血管收缩功能的作用，发现bFGF能收缩大鼠离体肺动脉环。提示bFGF可能参与低氧性肺动脉高压发病的两个环节。
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[基金项目] 广州市计委重大攻关项目(编号951030)
[参 考 文 献]
[1] 冉丕鑫，钟南山. 生长因子、原癌基因与低氧性肺动脉高压[J]. 基础医学与临床，1996，16(1)：1～5.
[2] Demiryurek AT, Wadsworth RM, Kane KA, et al. The role of endothelium in hypoxic constriction of human pulmonary artery rings[J]. Am Res Respir Dis, 1993,147:283～287.
[3] Slavin I. Fibroblast growth factors: At the heart of angiogenesis[J]. Cell Biol Int, 1995,19:431～435.
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[4] 欧阳能太，冉丕鑫，杜志强，等. 缺氧对大鼠肺组织成纤维细胞生长因子和c-myc癌基因表达的影响[J]. 中华结核和呼吸杂志，1997，20(1)：22～24.
[5] Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chlorform extraction[J]. Anal Bioch,1987,162:156～159.
[6] Shima SS. Complementary DNA cloning and sequencing rat ovarian basic fibroblast growth factor and tissue distribution study of its mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1988,157:256～263.
[收稿日期] 2000-03-23 [修回日期] 2000-05-08
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