内源性碱性成纤维细胞生长因子是大鼠对抗心脏缺血/再灌注损伤的保护因子
作者：姜志胜 王晓红 符民桂 赵文 李淑莲 唐朝枢
单位：(北京医科大学第一医院心血管病研究所， 北京 100034)
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；心脏；再灌注损伤；信号传递；大鼠
中国病理生理杂志000602
[摘 要] 目的：观察内、外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)损伤中的作用。方法：在大鼠离体心脏I/R模型上分别给以bFGF和bFGF抗血清，以生理多导仪测定心率、±LV dp/dtmax及左心室终末舒张压(LVEDP)变化，并测定冠脉流量、冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、乳酸盐脱氢酶(LDH)活性以及心肌组织钙、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和蛋白激酶(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性。结果：I/R组心功能显著低于对照组，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、LDH活性及心肌MDA、钙含量显著升高，ATP含量显著降低(均P<0.01)。bFGF组±LV dp/dtmax较I/R组分别高42.8%和25.6%，LVEDP低40.0%，再灌末心率/预灌末心率(HRr/HRi)及冠脉流量的(B/A)分别高42.3%和20.3%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量及LDH活性分别少28.8%、30.2%(均P<0.01)和32.3%(P<0.05)，心肌MDA和钙含量分别少44.4%和35.6%，ATP含量高33.8%。心肌PKC、MAPK活性分别高41.3%和10.1%(均P<0.01)；bFGF抗血清组±LV dp/dtmax较I/R组分别低35.1%和38.1%，LVEDP高92.5%，HRr/HRi及冠脉流量的B/A分别少36.0%和45.4%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白和LDH漏出分别多54.3%、96.2%和34.4%，心肌MDA和钙含量分别高23.6%和49.7%，ATP含量低27.8%，心肌PKC及MAPK活性分别低20.9%和7.7%(均P<0.01)。结论：内源性bFGF是大鼠对抗心脏缺血/再灌注损伤的保护因子。观察内、外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)损伤中的作用。方法：在大鼠离体心脏I/R模型上分别给以bFGF和bFGF抗血清，以生理多导仪测定心率、±LV dp/dtmax及左心室终末舒张压(LVEDP)变化，并测定冠脉流量、冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、乳酸盐脱氢酶(LDH)活性以及心肌组织钙、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和蛋白激酶(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性。结果：I/R组心功能显著低于对照组，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、LDH活性及心肌MDA、钙含量显著升高，ATP含量显著降低(均P<0.01)。bFGF组±LV dp/dtmax较I/R组分别高42.8%和25.6%，LVEDP低40.0%，再灌末心率/预灌末心率(HRr/HRi)及冠脉流量的(B/A)分别高42.3%和20.3%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量及LDH活性分别少28.8%、30.2%(均P<0.01)和32.3%(P<0.05)，心肌MDA和钙含量分别少44.4%和35.6%，ATP含量高33.8%。心肌PKC、MAPK活性分别高41.3%和10.1%(均P<0.01)；bFGF抗血清组±LV dp/dtmax较I/R组分别低35.1%和38.1%，LVEDP高92.5%，HRr/HRi及冠脉流量的B/A分别少36.0%和45.4%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白和LDH漏出分别多54.3%、96.2%和34.4%，心肌MDA和钙含量分别高23.6%和49.7%，ATP含量低27.8%，心肌PKC及MAPK活性分别低20.9%和7.7%(均P<0.01)。结论：内源性bFGF是大鼠对抗心脏缺血/再灌注损伤的保护因子。
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[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0486-05
Endogenous basic fibroblst growth factor is a protective factor against myocardial ischemia/reperfusion injury of rats
JIANG Zhi-sheng， WANG Xiao-hong， FU Min-gui，ZHAO Wen， LI Shu-lian, TANG Chao-shu
(Institute of Cardiovascular Research, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)
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[Abstract] AIM: To observe the role of exogenous and endogenous basic fibroblst growth factor (bFGF) on myocardial ischemia/reperfusion(I/R) injury of rats.METHODS:bFGF and bFGF antiserum were applied to rat isolated I/R heart. Myocardial function, coronary effluent volume,protein and myoglobin content as well as LDH activity in coronary effluent fluid, myocardial calcium， MDA and ATP concentration as well as PKC， MAPK activity were measured. RESULTS:Compared with control, myocardial function in I/R group significantly decreased. Protein, myoglobin content and LDH activity in coronary effluent liquid as well as myocardial MDA and calcium content increased, while myocardial ATP concentration decreased(all P<0.01). Compared with I/R group, ±LV dp/dtmax in bFGF group increased by 43% and 26%, respectively. LVEDP decreased by 40%. HRr/HRi and B/A augmented by 42% and 20%, respectively. Protein and myoglobin content as well as LDH activity lowered by 29%，30% (all P<0.01) and 33% (P<0.05) respectively. Myocardial MDA and calcium content decreased by 44% and 35%, respectively, while myocardial ATP level as well as PKC and MAPK activity increased by 34%，41% and 10% (all P<0.01), respectively. In bFGF antiserum group, ±LV dp/dtmax were 35% and 38% lower than those in I/R group. LVEDP increased by 93%. HRr/HRi and B/A decreased by 36% and 45%, respectively. Protein and myoglobin content as well as LDH activity augmented by 54%，96% (all P<0.01) and 34% (P<0.05) respectively. Myocardial MDA and calcium content increased by 24% and 50%, respectively, while myocardial ATP level as well as PKC and MAPK activity lowered by 28%，21% and 8% (all P<0.01), respectively. CONCLUSION:Endogenous bFGF is a protective factor against myocardial ischemia/reperfusion injury of rats.
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[MeSH] Fibroblast growth factor,basic; Heart; Reperfusion injury; Signal transduction; Rats
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)广泛分布于体内各组织中，具有促进细胞分化、发育、迁移、增殖等与丝裂作用有关的多种生物学效应。近来研究发现，该因子还可诱导血管壁一氧化氮合酶(NOS)活性，促进一氧化氮(nitric oxide，NO)产生[1]，舒张血管，拮抗高血压的形成[2]，并能缩小心肌梗塞的面积[3]等。提示bFGF的非丝裂作用亦具有重要的生理、病理意义。有报道，心肌缺血、缺氧时，bFGF的产生增加[4]，但内源性bFGF在心脏缺血缺氧损伤中的作用尚不十分清楚。本工作在离体大鼠心脏缺血/再灌损伤模型上，通过使用bFGF抗体，观察内源性bFGF的作用。
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材 料 和 方 法
一、 大鼠离体心脏灌流模型制备[5]及实验分组
雄性Wistar大鼠24只，体重(220±10) g。术前禁食过夜，自由饮水。以20%乌拉坦(5 mL/kg,ip)麻醉动物，摘取心脏迅速悬挂于Langendorff灌流装置上，用37℃、95%O2-5%CO2持续平衡的Krebs-Henseleit(KH)液自主动脉逆行恒压灌流，灌流压为7.8 kPa。实验分为4组：(1)对照组，持续灌流90 min。(2)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组，预灌15 min，停灌(保温、保湿)45 min，再灌注30 min。(3)bFGF组，灌流方法同I/R组，再灌注的最初5 min给予8 μg bFGF。(4)bFGF抗体组，灌流方法同I/R组，再灌注的最初5 min给予1%bFGF抗血清灌流。
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二、心功能测定
从左心耳插入球囊，通过压力换能器连接生理多导仪，记录预灌末及再灌末左室内压最大变化速率(±LV dp/dtmax)和左室舒张末期压(LVEDP)。
三、冠脉流量及冠脉流出液中乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、蛋白及肌红蛋白含量的测定
分别收集预灌末5 min或相应时间(对照组)及再灌末5 min或相应时间(对照组)的冠脉流出液，测定冠脉流量，并用Brabford法[6]、Elz法[7]及全自动生化分析仪分别测定冠脉流出液中蛋白含量、肌红蛋白含量及LDH活性。
四、心肌组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)及钙含量的测定
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灌流结束后，取约50 mg心室肌以硫代巴比妥酸法测定MDA含量，以原子吸收分光光度法测定心肌组织钙含量，以放免药盒测定三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量。
五、心肌组织蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性测定[8]
将心肌组织以穿细胞液(mmol/L: HEPES 12.5,EGTA 12.5,pH 7.4,MgCl2 5.2, KCl 194.0, CaCl2 8.2, PKC底物肽0.2 IU/管, streptolysin 0.3 IU/管)匀浆(4℃)，取匀浆液150 μL，37℃孵育10 min，加入[γ-32P](ATP(37 kBq/管)启动反应，再孵育10 min后加入冷终止液(25%三氯醋酸-2mol/L乙酸 )100 μL终止反应。冰浴10 min 后离心(3000 r/min,15 min)，取上清液120 μL点于p81离子交换色谱滤纸上，晾干后以洗脱液(30%乙酸-1%磷酸)洗2次，再以无水乙醇洗1次，干燥后加入闪烁液，以液闪仪(Backman LS6000)测定放射活性。同时作不加PKC底物肽的对照检测，实验管与对照管的差值表示PKC活性(counts*min-1/3×105 cells) 。
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六、心肌组织丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性测定
参照本室报告的方法[9]测定心肌组织MAPK活性。心肌组织以细胞溶解液(mmol/L: HEPES 50.0, pH7.5, NaCl 150.0, Na4P2O2 10.0, Na3VO4 2.0, NaF 100.0, PMSF 1.0, DTT 2.0, aprotin 100 U/mL, leupeptin 20 μmol/L,Triton-100 1%)匀浆，匀浆液离心，13 000×g,10 min。取上清液0.1 mL加入0.1 mL激酶缓冲液(mmol/L: HEPES 20.0, pH 7.2, MgCl2 10.0, MnCl2 2.0, DTT 2.0, Na2VO4 0.5, EGTA 1.0, 蛋白激酶A抑制剂 2.0, BSA 0.1 mg/mL, ATP-Na2 50 μmol/L, [γ-32P]ATP (37 kBq),并加入髓磷脂碱性蛋白1.0 mg/mL)于30℃反应15 min。冰浴终止反应。取100 μL 反应液点于p81 phosphocellulose滤纸(Whatman)上，凉干后以0.5%磷酸液冲洗6次，烘干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液静息过夜。在液闪仪上测定放射活性，同时作空白对照检测，以实验管与空白管的差值表示MAPK活性(counts*min-1/3×105 cells)。
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七、材料
实验动物由本校实验动物部提供。重组人bFGF为北京白鹭园生物技术公司产品，bFGF抗血清(兔抗人)为本室制备，滴度1:25 000。ATP药盒、PKC底物肽、髓磷脂碱性蛋白、aprotin、leupeptin、蛋白激酶A抑制剂、ATP-Na2等均购自Sigma公司，[γ-32P]-ATP购自Dupont Co.。余均为市售分析纯试剂。
八、 统计方法
实验结果以
±s表示，one way ANOVA方差分析组间q检验做统计学处理。
结 果
一、 bFGF对离体大鼠心脏缺血/再灌损伤的影响
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心脏再灌后冠脉流量明显降低，其再灌末冠脉流量(B)与预灌末冠脉流量(A)之比值(B/A)较对照组少46.9%(表1,P<0.01)；冠脉流出液中蛋白含量、肌红蛋白含量及LDH活性较对照组分别高1.4、 2.3和3.2倍(均P<0.01)，心肌组织MDA和钙含量分别高212.4%和92.2%(图1，均P<0.01)，心肌ATP含量少53.0% (P<0.01)。说明心肌发生明显损伤。
表1 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌心脏冠脉流量及再灌末冠脉流
出液中蛋白、肌红蛋白含量和乳酸脱氢酶活性的影响
Tab 1 The effect of bFGF and bFGF antiserum on coronary effluent volume，protein and myoglobin content and LDH activity in coronary effluent fluid(±s ,n=6) Group
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RCEV(%)
Protein(μg/mL)
Myoglobin(μg/mL)
LDH(IU/L)
Control
90.8±3.9**
18.1±2.1**
1.6±0.3**
38.0±12.2**
I/R
, 百拇医药 48.2±3.2
43.1±2.2
5.3±0.5
160.0±41.2
bFGF
58.0±4.0**
30.7±2.5**
3.7±0.3**
108.3±16.5*
Anti-bFGF
26.3±3.4**
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66.5±8.6**
10.4±1.5**
215.0±44.7**
* P<0.05, ** P<0.01, vs I/R group； RCEV: ratio of coronary volume
Fig 1 The effect of bFGF and bFGF antiserum on calcium，ATP and MDA content of rat ischemia/reperfusion myocardium(±s,n=6)
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* P<0.05, ** P<0.01, vs I/R group
图1 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌注心肌钙、ATP和MDA含量的影响
应用bFGF抗血清明显加重心肌缺血/再灌注损伤，与I/R组比较，其冠脉流量的B/A值低45.4%(P<0.01)，心肌细胞内蛋白、肌红蛋白和LDH漏出分别多54.3%、96.2%和34.4%(均P<0.01)，心肌MDA和钙含量分别高23.6%和49.7%(P<0.01)，ATP含量少27.8%(P<0.05)。
给以外源bFGF后，心肌缺血/再灌注损伤程度显著减轻。与I/R组比较，冠脉流量的B/A值多20.3%(P<0.01)，再灌末冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量和LDH活性分别低28.8 %、30.2%(P<0.01)和32.3%(P<0.05)，心肌MDA和钙含量分别低44.4%和35.6% (P<0.01)。ATP含量多33.8%(P<0.01)。
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二、bFGF对缺血/再灌大鼠心脏心功能的影响
I/R组再灌末心功能明显受损，±LV dp/dtmax分别比对照组少41.8%和40.0%(P<0.01)，左心室终末舒张压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)高81.8%(P<0.01)，再灌末心率(HRr)与预灌末心率(HRi)之比(HRr/HRi)少45.0% (P<0.01)。
应用bFGF抗体使心功能进一步受损，与I/R组比较，±LV dp/dtmax分别低35.1%和38.1%(P<0.01)，LVEDP高92.5%(P<0.01), HRr/Hri低36.0%(P<0.01)。
应用外源bFGF显著改善I/R后受损的心功能，±LV dp/dtmax较I/R组分别高42.8%和25.6%(P<0.01),LVEDP低40.0%(P<0.01), HRr/Hri高42.3%(P<0.01)。结果见表2所示。
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表2 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌注心脏心功能的影响
Tab 2 The effect of bFGF and bFGF antiserum on myocardial function of rat
isolated ischemia/reperfusion heart(±s，n=6) Group
RHR(%)
R+dp/dtmax(%)
R-dp/dtmax(%)
RLVEDP
, 百拇医药
Control
88.9±4.1*
91.6±3.0*
91.4±5.4*
1.1±0.1*
I/R
48.9±10.6
53.3±4.4
54.8±7.3
2.0±0.3
bFGF
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69.6±11.1*
76.0±6.6*
68.8±6.8*
1.2±0.1*
Anti-bFGF
31.3±5.6*
34.6±5.4*
33.9±6.0*
3.7±0.6*
* P<0.01, vs I/R group；RHR: ratio of heart rate；R+dp/dt max: ratio of +dp/dtmax；R-dp/dtmax: ratio of -dp/dtmax；RLVEDP: ratio of LVEDP
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三、 bFGF对大鼠缺血/再灌注心肌PKC及MAPK活性的影响
I/R组心肌PKC及MAPK活性较对照组分别高46.8%和6.2%(P<0.01)；与I/R组比较，bFGF抗体组心肌PKC及MAPK活性分别低20.9%和7.7%(P<0.01)，而给以外源bFGF后这两种蛋白激酶活性分别高41.3%和10.1%(P<0.01)。结果见图2。
Fig 2 The effect of bFGF and bFGF antiserum on PKC and MAPK
activity of rat ischemia/reperfusion myocardium(±s,n=6)
* P<0.01, vs I/R group
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图2 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌注心肌
PKC和MAPK活性的影响
讨 论
bFGF为体内广泛分布的一种多功能生长因子，它对组织细胞的促丝裂作用已获得公认。近年来，该因子的非丝裂作用愈来愈引起人们的重视。有报道，bFGF可上调血管壁L-精氨酸/一氧化氮系统[1]，参与对血管壁张力及血压的调节[2]，并与体内多种心血管活性肽形成网络调控，对细胞损伤具有明显的拮抗作用。
心肌缺血时可诱导bFGF的产生。Cohen等[4]发现，结扎狗冠脉左前降枝2 h后，缺血心肌中bFGF活性即明显增加，2周时达高峰。bFGF表达增加的远期效应与缺血组织血管新生增强及促进损伤组织的修复有关，但其急性效应的作用及机制尚不十分清楚。本实验在大鼠离体心脏缺血/再灌模型上发现，外源bFGF可显著拮抗缺血/再灌注损伤，表现为 改善心功能，减少冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量及LDH活性，降低心肌组织MDA和钙含量，增加心肌ATP含量；而使用bFGF抗体阻断内源性bFGF的作用后，心肌缺血/再灌注损伤进一步加重，心功能明显恶化，心肌组织MDA及钙含量显著增高。表明bFGF为一内源性保护因子。
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bFGF的生物学效应通过其受体的功能实现，后者属酪氨酸蛋白激酶受体，当该因子与受体结合后，激活了蛋白激酶活性，引起细胞内一系列蛋白磷酸化，导致PKC、MAPK的激活，介导了信号向细胞核内的转导，引发了bFGF的有关生物学功能。本研究发现，外源bFGF显著刺激了I/R心肌组织的PKC与MAPK活性，而使用bFGF抗体导致I/R心肌组织中这两种激酶的活性较I/R组显著降低。提示PKC和MAPK的激活与bFGF引起的对I/R心肌损伤的保护作用密切相关。我们认为，bFGF对组织细胞的保护作用通过两种方式来实现，一种是间接作用，既通过扩张血管及促进血管新生[10]，增加缺血组织的血液供应，改善细胞的功能与代谢状态；另一种是直接作用。文献报道，bFGF对神经细胞的变性、损伤具有保护作用，并能保护培养的心肌细胞免受H2O2或血清饥饿的损伤。我们在心肌细胞缺氧/复氧损伤实验中发现(资料另文报道)，bFGF可减轻缺氧/复氧对心肌细胞造成的损伤，而使用PKC阻断剂H7或MAPK阻断剂PD98059显著抑制了bFGF对心肌细胞缺氧/复氧损伤的拮抗作用，进一步说明bFGF对细胞的直接保护作用的机理与激活心肌内PKC、MAPK活性有关，详细机制尚待深入探索。
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bFGF的细胞保护作用对缺血心肌的防治可能具有潜在的临床应用价值，值得进一步研究。
[基金项目]国家自然科学基金资助(No.39730220)
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-03-24 [修回日期]1999-06-03
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单位：(北京医科大学第一医院心血管病研究所， 北京 100034)
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；心脏；再灌注损伤；信号传递；大鼠
中国病理生理杂志000602
[摘 要] 目的：观察内、外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)损伤中的作用。方法：在大鼠离体心脏I/R模型上分别给以bFGF和bFGF抗血清，以生理多导仪测定心率、±LV dp/dtmax及左心室终末舒张压(LVEDP)变化，并测定冠脉流量、冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、乳酸盐脱氢酶(LDH)活性以及心肌组织钙、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和蛋白激酶(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性。结果：I/R组心功能显著低于对照组，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、LDH活性及心肌MDA、钙含量显著升高，ATP含量显著降低(均P<0.01)。bFGF组±LV dp/dtmax较I/R组分别高42.8%和25.6%，LVEDP低40.0%，再灌末心率/预灌末心率(HRr/HRi)及冠脉流量的(B/A)分别高42.3%和20.3%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量及LDH活性分别少28.8%、30.2%(均P<0.01)和32.3%(P<0.05)，心肌MDA和钙含量分别少44.4%和35.6%，ATP含量高33.8%。心肌PKC、MAPK活性分别高41.3%和10.1%(均P<0.01)；bFGF抗血清组±LV dp/dtmax较I/R组分别低35.1%和38.1%，LVEDP高92.5%，HRr/HRi及冠脉流量的B/A分别少36.0%和45.4%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白和LDH漏出分别多54.3%、96.2%和34.4%，心肌MDA和钙含量分别高23.6%和49.7%，ATP含量低27.8%，心肌PKC及MAPK活性分别低20.9%和7.7%(均P<0.01)。结论：内源性bFGF是大鼠对抗心脏缺血/再灌注损伤的保护因子。观察内、外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)损伤中的作用。方法：在大鼠离体心脏I/R模型上分别给以bFGF和bFGF抗血清，以生理多导仪测定心率、±LV dp/dtmax及左心室终末舒张压(LVEDP)变化，并测定冠脉流量、冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、乳酸盐脱氢酶(LDH)活性以及心肌组织钙、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和蛋白激酶(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性。结果：I/R组心功能显著低于对照组，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量、LDH活性及心肌MDA、钙含量显著升高，ATP含量显著降低(均P<0.01)。bFGF组±LV dp/dtmax较I/R组分别高42.8%和25.6%，LVEDP低40.0%，再灌末心率/预灌末心率(HRr/HRi)及冠脉流量的(B/A)分别高42.3%和20.3%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量及LDH活性分别少28.8%、30.2%(均P<0.01)和32.3%(P<0.05)，心肌MDA和钙含量分别少44.4%和35.6%，ATP含量高33.8%。心肌PKC、MAPK活性分别高41.3%和10.1%(均P<0.01)；bFGF抗血清组±LV dp/dtmax较I/R组分别低35.1%和38.1%，LVEDP高92.5%，HRr/HRi及冠脉流量的B/A分别少36.0%和45.4%，冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白和LDH漏出分别多54.3%、96.2%和34.4%，心肌MDA和钙含量分别高23.6%和49.7%，ATP含量低27.8%，心肌PKC及MAPK活性分别低20.9%和7.7%(均P<0.01)。结论：内源性bFGF是大鼠对抗心脏缺血/再灌注损伤的保护因子。
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[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0486-05
Endogenous basic fibroblst growth factor is a protective factor against myocardial ischemia/reperfusion injury of rats
JIANG Zhi-sheng， WANG Xiao-hong， FU Min-gui，ZHAO Wen， LI Shu-lian, TANG Chao-shu
(Institute of Cardiovascular Research, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)
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[Abstract] AIM: To observe the role of exogenous and endogenous basic fibroblst growth factor (bFGF) on myocardial ischemia/reperfusion(I/R) injury of rats.METHODS:bFGF and bFGF antiserum were applied to rat isolated I/R heart. Myocardial function, coronary effluent volume,protein and myoglobin content as well as LDH activity in coronary effluent fluid, myocardial calcium， MDA and ATP concentration as well as PKC， MAPK activity were measured. RESULTS:Compared with control, myocardial function in I/R group significantly decreased. Protein, myoglobin content and LDH activity in coronary effluent liquid as well as myocardial MDA and calcium content increased, while myocardial ATP concentration decreased(all P<0.01). Compared with I/R group, ±LV dp/dtmax in bFGF group increased by 43% and 26%, respectively. LVEDP decreased by 40%. HRr/HRi and B/A augmented by 42% and 20%, respectively. Protein and myoglobin content as well as LDH activity lowered by 29%，30% (all P<0.01) and 33% (P<0.05) respectively. Myocardial MDA and calcium content decreased by 44% and 35%, respectively, while myocardial ATP level as well as PKC and MAPK activity increased by 34%，41% and 10% (all P<0.01), respectively. In bFGF antiserum group, ±LV dp/dtmax were 35% and 38% lower than those in I/R group. LVEDP increased by 93%. HRr/HRi and B/A decreased by 36% and 45%, respectively. Protein and myoglobin content as well as LDH activity augmented by 54%，96% (all P<0.01) and 34% (P<0.05) respectively. Myocardial MDA and calcium content increased by 24% and 50%, respectively, while myocardial ATP level as well as PKC and MAPK activity lowered by 28%，21% and 8% (all P<0.01), respectively. CONCLUSION:Endogenous bFGF is a protective factor against myocardial ischemia/reperfusion injury of rats.
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[MeSH] Fibroblast growth factor,basic; Heart; Reperfusion injury; Signal transduction; Rats
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)广泛分布于体内各组织中，具有促进细胞分化、发育、迁移、增殖等与丝裂作用有关的多种生物学效应。近来研究发现，该因子还可诱导血管壁一氧化氮合酶(NOS)活性，促进一氧化氮(nitric oxide，NO)产生[1]，舒张血管，拮抗高血压的形成[2]，并能缩小心肌梗塞的面积[3]等。提示bFGF的非丝裂作用亦具有重要的生理、病理意义。有报道，心肌缺血、缺氧时，bFGF的产生增加[4]，但内源性bFGF在心脏缺血缺氧损伤中的作用尚不十分清楚。本工作在离体大鼠心脏缺血/再灌损伤模型上，通过使用bFGF抗体，观察内源性bFGF的作用。
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材 料 和 方 法
一、 大鼠离体心脏灌流模型制备[5]及实验分组
雄性Wistar大鼠24只，体重(220±10) g。术前禁食过夜，自由饮水。以20%乌拉坦(5 mL/kg,ip)麻醉动物，摘取心脏迅速悬挂于Langendorff灌流装置上，用37℃、95%O2-5%CO2持续平衡的Krebs-Henseleit(KH)液自主动脉逆行恒压灌流，灌流压为7.8 kPa。实验分为4组：(1)对照组，持续灌流90 min。(2)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组，预灌15 min，停灌(保温、保湿)45 min，再灌注30 min。(3)bFGF组，灌流方法同I/R组，再灌注的最初5 min给予8 μg bFGF。(4)bFGF抗体组，灌流方法同I/R组，再灌注的最初5 min给予1%bFGF抗血清灌流。
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二、心功能测定
从左心耳插入球囊，通过压力换能器连接生理多导仪，记录预灌末及再灌末左室内压最大变化速率(±LV dp/dtmax)和左室舒张末期压(LVEDP)。
三、冠脉流量及冠脉流出液中乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、蛋白及肌红蛋白含量的测定
分别收集预灌末5 min或相应时间(对照组)及再灌末5 min或相应时间(对照组)的冠脉流出液，测定冠脉流量，并用Brabford法[6]、Elz法[7]及全自动生化分析仪分别测定冠脉流出液中蛋白含量、肌红蛋白含量及LDH活性。
四、心肌组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)及钙含量的测定
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灌流结束后，取约50 mg心室肌以硫代巴比妥酸法测定MDA含量，以原子吸收分光光度法测定心肌组织钙含量，以放免药盒测定三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量。
五、心肌组织蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性测定[8]
将心肌组织以穿细胞液(mmol/L: HEPES 12.5,EGTA 12.5,pH 7.4,MgCl2 5.2, KCl 194.0, CaCl2 8.2, PKC底物肽0.2 IU/管, streptolysin 0.3 IU/管)匀浆(4℃)，取匀浆液150 μL，37℃孵育10 min，加入[γ-32P](ATP(37 kBq/管)启动反应，再孵育10 min后加入冷终止液(25%三氯醋酸-2mol/L乙酸 )100 μL终止反应。冰浴10 min 后离心(3000 r/min,15 min)，取上清液120 μL点于p81离子交换色谱滤纸上，晾干后以洗脱液(30%乙酸-1%磷酸)洗2次，再以无水乙醇洗1次，干燥后加入闪烁液，以液闪仪(Backman LS6000)测定放射活性。同时作不加PKC底物肽的对照检测，实验管与对照管的差值表示PKC活性(counts*min-1/3×105 cells) 。
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六、心肌组织丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性测定
参照本室报告的方法[9]测定心肌组织MAPK活性。心肌组织以细胞溶解液(mmol/L: HEPES 50.0, pH7.5, NaCl 150.0, Na4P2O2 10.0, Na3VO4 2.0, NaF 100.0, PMSF 1.0, DTT 2.0, aprotin 100 U/mL, leupeptin 20 μmol/L,Triton-100 1%)匀浆，匀浆液离心，13 000×g,10 min。取上清液0.1 mL加入0.1 mL激酶缓冲液(mmol/L: HEPES 20.0, pH 7.2, MgCl2 10.0, MnCl2 2.0, DTT 2.0, Na2VO4 0.5, EGTA 1.0, 蛋白激酶A抑制剂 2.0, BSA 0.1 mg/mL, ATP-Na2 50 μmol/L, [γ-32P]ATP (37 kBq),并加入髓磷脂碱性蛋白1.0 mg/mL)于30℃反应15 min。冰浴终止反应。取100 μL 反应液点于p81 phosphocellulose滤纸(Whatman)上，凉干后以0.5%磷酸液冲洗6次，烘干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液静息过夜。在液闪仪上测定放射活性，同时作空白对照检测，以实验管与空白管的差值表示MAPK活性(counts*min-1/3×105 cells)。
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七、材料
实验动物由本校实验动物部提供。重组人bFGF为北京白鹭园生物技术公司产品，bFGF抗血清(兔抗人)为本室制备，滴度1:25 000。ATP药盒、PKC底物肽、髓磷脂碱性蛋白、aprotin、leupeptin、蛋白激酶A抑制剂、ATP-Na2等均购自Sigma公司，[γ-32P]-ATP购自Dupont Co.。余均为市售分析纯试剂。
八、 统计方法
实验结果以
±s表示，one way ANOVA方差分析组间q检验做统计学处理。结 果
一、 bFGF对离体大鼠心脏缺血/再灌损伤的影响
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心脏再灌后冠脉流量明显降低，其再灌末冠脉流量(B)与预灌末冠脉流量(A)之比值(B/A)较对照组少46.9%(表1,P<0.01)；冠脉流出液中蛋白含量、肌红蛋白含量及LDH活性较对照组分别高1.4、 2.3和3.2倍(均P<0.01)，心肌组织MDA和钙含量分别高212.4%和92.2%(图1，均P<0.01)，心肌ATP含量少53.0% (P<0.01)。说明心肌发生明显损伤。
表1 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌心脏冠脉流量及再灌末冠脉流
出液中蛋白、肌红蛋白含量和乳酸脱氢酶活性的影响
Tab 1 The effect of bFGF and bFGF antiserum on coronary effluent volume，protein and myoglobin content and LDH activity in coronary effluent fluid(
±s ,n=6) Group, 百拇医药
RCEV(%)
Protein(μg/mL)
Myoglobin(μg/mL)
LDH(IU/L)
Control
90.8±3.9**
18.1±2.1**
1.6±0.3**
38.0±12.2**
I/R
, 百拇医药 48.2±3.2
43.1±2.2
5.3±0.5
160.0±41.2
bFGF
58.0±4.0**
30.7±2.5**
3.7±0.3**
108.3±16.5*
Anti-bFGF
26.3±3.4**
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66.5±8.6**
10.4±1.5**
215.0±44.7**
* P<0.05, ** P<0.01, vs I/R group； RCEV: ratio of coronary volume
Fig 1 The effect of bFGF and bFGF antiserum on calcium，ATP and MDA content of rat ischemia/reperfusion myocardium(
±s,n=6), 百拇医药
* P<0.05, ** P<0.01, vs I/R group
图1 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌注心肌钙、ATP和MDA含量的影响
应用bFGF抗血清明显加重心肌缺血/再灌注损伤，与I/R组比较，其冠脉流量的B/A值低45.4%(P<0.01)，心肌细胞内蛋白、肌红蛋白和LDH漏出分别多54.3%、96.2%和34.4%(均P<0.01)，心肌MDA和钙含量分别高23.6%和49.7%(P<0.01)，ATP含量少27.8%(P<0.05)。
给以外源bFGF后，心肌缺血/再灌注损伤程度显著减轻。与I/R组比较，冠脉流量的B/A值多20.3%(P<0.01)，再灌末冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量和LDH活性分别低28.8 %、30.2%(P<0.01)和32.3%(P<0.05)，心肌MDA和钙含量分别低44.4%和35.6% (P<0.01)。ATP含量多33.8%(P<0.01)。
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二、bFGF对缺血/再灌大鼠心脏心功能的影响
I/R组再灌末心功能明显受损，±LV dp/dtmax分别比对照组少41.8%和40.0%(P<0.01)，左心室终末舒张压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)高81.8%(P<0.01)，再灌末心率(HRr)与预灌末心率(HRi)之比(HRr/HRi)少45.0% (P<0.01)。
应用bFGF抗体使心功能进一步受损，与I/R组比较，±LV dp/dtmax分别低35.1%和38.1%(P<0.01)，LVEDP高92.5%(P<0.01), HRr/Hri低36.0%(P<0.01)。
应用外源bFGF显著改善I/R后受损的心功能，±LV dp/dtmax较I/R组分别高42.8%和25.6%(P<0.01),LVEDP低40.0%(P<0.01), HRr/Hri高42.3%(P<0.01)。结果见表2所示。
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表2 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌注心脏心功能的影响
Tab 2 The effect of bFGF and bFGF antiserum on myocardial function of rat
isolated ischemia/reperfusion heart(
±s，n=6) GroupRHR(%)
R+dp/dtmax(%)
R-dp/dtmax(%)
RLVEDP
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Control
88.9±4.1*
91.6±3.0*
91.4±5.4*
1.1±0.1*
I/R
48.9±10.6
53.3±4.4
54.8±7.3
2.0±0.3
bFGF
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69.6±11.1*
76.0±6.6*
68.8±6.8*
1.2±0.1*
Anti-bFGF
31.3±5.6*
34.6±5.4*
33.9±6.0*
3.7±0.6*
* P<0.01, vs I/R group；RHR: ratio of heart rate；R+dp/dt max: ratio of +dp/dtmax；R-dp/dtmax: ratio of -dp/dtmax；RLVEDP: ratio of LVEDP
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三、 bFGF对大鼠缺血/再灌注心肌PKC及MAPK活性的影响
I/R组心肌PKC及MAPK活性较对照组分别高46.8%和6.2%(P<0.01)；与I/R组比较，bFGF抗体组心肌PKC及MAPK活性分别低20.9%和7.7%(P<0.01)，而给以外源bFGF后这两种蛋白激酶活性分别高41.3%和10.1%(P<0.01)。结果见图2。
Fig 2 The effect of bFGF and bFGF antiserum on PKC and MAPK
activity of rat ischemia/reperfusion myocardium(±s,n=6)
* P<0.01, vs I/R group
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图2 bFGF及其抗体对大鼠缺血/再灌注心肌
PKC和MAPK活性的影响
讨 论
bFGF为体内广泛分布的一种多功能生长因子，它对组织细胞的促丝裂作用已获得公认。近年来，该因子的非丝裂作用愈来愈引起人们的重视。有报道，bFGF可上调血管壁L-精氨酸/一氧化氮系统[1]，参与对血管壁张力及血压的调节[2]，并与体内多种心血管活性肽形成网络调控，对细胞损伤具有明显的拮抗作用。
心肌缺血时可诱导bFGF的产生。Cohen等[4]发现，结扎狗冠脉左前降枝2 h后，缺血心肌中bFGF活性即明显增加，2周时达高峰。bFGF表达增加的远期效应与缺血组织血管新生增强及促进损伤组织的修复有关，但其急性效应的作用及机制尚不十分清楚。本实验在大鼠离体心脏缺血/再灌模型上发现，外源bFGF可显著拮抗缺血/再灌注损伤，表现为 改善心功能，减少冠脉流出液中蛋白、肌红蛋白含量及LDH活性，降低心肌组织MDA和钙含量，增加心肌ATP含量；而使用bFGF抗体阻断内源性bFGF的作用后，心肌缺血/再灌注损伤进一步加重，心功能明显恶化，心肌组织MDA及钙含量显著增高。表明bFGF为一内源性保护因子。
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bFGF的生物学效应通过其受体的功能实现，后者属酪氨酸蛋白激酶受体，当该因子与受体结合后，激活了蛋白激酶活性，引起细胞内一系列蛋白磷酸化，导致PKC、MAPK的激活，介导了信号向细胞核内的转导，引发了bFGF的有关生物学功能。本研究发现，外源bFGF显著刺激了I/R心肌组织的PKC与MAPK活性，而使用bFGF抗体导致I/R心肌组织中这两种激酶的活性较I/R组显著降低。提示PKC和MAPK的激活与bFGF引起的对I/R心肌损伤的保护作用密切相关。我们认为，bFGF对组织细胞的保护作用通过两种方式来实现，一种是间接作用，既通过扩张血管及促进血管新生[10]，增加缺血组织的血液供应，改善细胞的功能与代谢状态；另一种是直接作用。文献报道，bFGF对神经细胞的变性、损伤具有保护作用，并能保护培养的心肌细胞免受H2O2或血清饥饿的损伤。我们在心肌细胞缺氧/复氧损伤实验中发现(资料另文报道)，bFGF可减轻缺氧/复氧对心肌细胞造成的损伤，而使用PKC阻断剂H7或MAPK阻断剂PD98059显著抑制了bFGF对心肌细胞缺氧/复氧损伤的拮抗作用，进一步说明bFGF对细胞的直接保护作用的机理与激活心肌内PKC、MAPK活性有关，详细机制尚待深入探索。
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bFGF的细胞保护作用对缺血心肌的防治可能具有潜在的临床应用价值，值得进一步研究。
[基金项目]国家自然科学基金资助(No.39730220)
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-03-24 [修回日期]1999-06-03
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