N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍诱发的vero细胞JNK/SAPK通路的激活
作者：鲁靖 余应年 谢海洋
单位：(浙江大学医学院病理生理学教研室， 浙江 杭州 310031)
关键词：亚硝基胍类；印迹法，蛋白质；磷酸转移酶类，ATP
中国病理生理杂志000601
[摘 要] 目的和方法：为了研究DNA损伤剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发vero细胞非定标性突变发生的信号转导机制，我们观察了MNNG诱发vero细胞c-Jun NH2-terminal kinase/stress activated protein kinase(JNK/SAPK)通路激活的情况：分别用Western印迹法和固相激酶活性测定法检测JNK1磷酸化和JNKs激酶活性。结果：发现用0.2 μmol/L MNNG和1 mg/L放线菌素酮(CHM)分别处理vero细胞2.5 h和1 h后，都引起细胞抽提液中磷酸化JNK1的比例明显增高。同时通过测定JNKs的底物c-Jun的磷酸化程度，发现这两种处理也都可引起JNKs激酶活性显著增高(分别增高6.7和3.0倍)。结论：证明0.2 μmol/L MNNG和1 mg/L CHM分别处理vero细胞2.5 h和1 h都可引起vero细胞内JNK/SAPK通路被激活。
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[中图分类号] Q257 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0481-05
Activation of JNK/SAPK pathway in vero cells induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine
LU Jing, YU Yin-nian, XIE Hai-yang
(Department of Pathophysiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031, China)
[Abstract] AIM and METHODES: To evaluate the possible signal transduction mechanism of nontargeted mutagenesis in vero cells induced by DNA damaging agent N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG),the activation of c-Jun NH2-terminal kinase/stress activated protein kinase(SAPK/JNK) pathway in vero cells induced by MNNG was studied. Western Blot analysis and Solid-phase kinase assay were used to measure the phosphorylation of JNK1 and kinase activity of JNKs, respectively. RESULTS: After 0.2 μmol/L, 2.5 h MNNG or 1 mg/L, 1 h cycloheximide (CHM) treatment, the proportion of phosphorylated JNK1 in cell extract increased significantly, simultaneously the kinase activity of JNKs increased dramatically(6.7 and 3.0 folds respectively), as measured by the phosphorylation of c-Jun, a substrate of JNKs. CONCLUSION: Both 0.2 μmol/L 2.5 h MNNG and 1 mg/L 1 h CHM treatment can induce the activation of JNK/SAPK pathway, one of the stress signal transduction pathways, in vero cells.
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[MeSH] Nitrosoguanidines; Blotting, Western; Phosphotransferases, ATP
在对哺乳类细胞非定标性突变发生机制的研究中，我们已经证明DNA烷化剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导猴肾vero细胞产生的非定标性突变有一定的时相特征。转录和释译抑制剂处理，放射性同位素标记磷酸化蛋白质等一系列实验提示非定标性突变的形成有细胞信号转导通路的介入[1，2]。用Western印迹法发现0.2 μmol/L MNNG处理vero细胞2.5 h后以及处理2.5 h后再常规培养12 h都可引起45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化程度增高，1 mg/L 放线菌素酮(cycloheximide, CHM)处理12 h也可引起45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化程度增高[3]，直接提示MNNG处理vero细胞可能诱发应激相关信号转导通路的激活。
c-Jun N-末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)/应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase, SAPK)是一类近年来被深入研究的应激反应性蛋白激酶[4]，其中的JNK1分子量为46 kD。许多外界应激原都可以使JNKs/SAPKs磷酸化而活化，JNKs/SAPKs可使转录因子(如c-jun)磷酸化，实现对基因的调控[5]。为探讨本实验室用来诱导vero细胞产生非定标性突变的条件能否激活JNK/SAPK信号转导通路，本实验用Western印迹法(Western blot)和固相激酶活性测定法(solid-phase kinase assay)在不同的时点分别观察了MNNG和CHM处理所引起的vero细胞JNK1磷酸化程度和JNKs的激酶活性的改变。
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材 料 和 方 法
一、细胞培养
猴肾vero细胞在DMEM(Dulbeccos modified eagle medium)培养基(Gibco BRL)中(含10% V/V小牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素，200 mg/L卡那霉素)常规贴壁培养，当细胞处于对数生长期，贴壁面积达80%汇合时分组处理。
二、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)及放线菌素酮(CHM)处理细胞
MNNG处理：分为4组：用含0.2 μmol/L MNNG(Sigma)的无血清DMEM培养基处理vero细胞1 h(标为M1(0)组)和2.5 h后，换以新鲜DMEM全培养基，继续培养0，6，12 h(分别标为M2.5(0)，M2.5(6)，M2.5(12)组)，在4个不同时点收集细胞。对照组除用MNNG溶液的溶剂二甲基亚砜(DMSO)(0.2% V/V)代替MNNG以外，其余处理相同(分别标为D1(0)，D2.5(0)，D2.5(6)，D2.5(12)组)。
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CHM处理：分为3组：用含1 mg/L CHM(Sigma)的无血清DMEM处理vero细胞1， 6，12 h后收集细胞(标为C1，C6，C12组)。其对照用CHM的溶剂Hanks液(0.1% V/V)代替CHM，其余处理相同(分别标为H1，H6，H12组)。
三、全细胞抽提液的制备及蛋白浓度测定
各组细胞收集完毕，用细胞裂解液[6](25 mmol/L HEPES(pH 7.7),0.3 mol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L Na3VO4, 20 mmol/L β-glycerophosphate, 1% V/V Triton-X-100, 0.5 mmol/L DTT, 2 mg/L leupeptin, 100 mg/L PMSF)4℃裂解细胞45 min,15 600×g 4℃离心30 min后，上清(即全细胞抽提液)分装，储于-70℃备用。用改良Lowry法[3]测各组全细胞抽提液中蛋白质总浓度。
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四、Western印迹[7]
各组全细胞抽提液加上样缓冲液(终浓度为62.5 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，2% W/V SDS， 50 mmol/L DTT,7.5% V/V glycerol)后加样进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)(5% W/V积层胶，10% W/V分离胶)。SDS-PAGE结束后，将凝胶上蛋白质电转移至硝酸纤维素膜(NC膜Amersham)。NC膜用TBS(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),150 mmol/L NaCl)漂洗后，加Blotto A(含5% W/V milk,0.05% V/V Tween-20的TBS)室温缓摇20 min，弃Blotto A,加含0.5 mg/L抗JNK1兔多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology)的Blotto A室温缓摇60 min,用TBST(含0.05% V/V Tween-20的TBS)洗NC膜后加含0.75% V/V羊抗兔IgG-HRP(华美)的Blotto A室温缓摇45 min,用TBST和TBS洗膜后进行增强化学发光(ECL)反应60 s，压片后取出胶片进行显影和定影。由于磷酸化JNK1和非磷酸化JNK1的电泳迁移率不同[8]，可用Kodak 1D analysis 2.0软件对各组的磷酸化JNK1(P)和非磷酸化JNK1(N)条带进行光密度扫描，计算各组磷酸化JNK1光密度占非磷酸化JNK1光密度的百分比(P/N)，把各对照组与相应处理组的P/N进行比较，对照组的P/N定为1.0，相应处理组P/N与前者相比的倍数为相对P/N光密度值。
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五、固相激酶活性测定[6]
细胞抽提液被稀释成终浓度为20 mmol/L HEPES(pH 7.7)，75 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 0.1% V/V Triton X-100, 0.5 mmol/L DTT, 20 mmol/L β-glycerophosphate,0.1 mmol/L Na3VO4, 2 mg/mL leupeptin,100 mg/mL PMSF。取适当体积的细胞抽提液(使其蛋白质含量为50μg)，加入5μg GST-c-Jun(79)-agarose(Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育3 h，离心后沉淀用0.5 mL 4℃HEPES binding buffer(20 mmol/L HEPES (pH 7.7),50 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L EDTA,0.05% V/V Triton X-100)洗4遍，沉淀重悬于15μL kinase buffer(20 mmol/L HEPES(pH 7.7),20 mmol/L MgCl2,20 mmol/L β-glycerophosphate,20 mmol/L p-nitrophenyl phosphate,0.1 mmol/L Na3VO4,2 mmol/L DTT,20μmol/L ATP, 9.25×104 Bq[γ-32P]ATP),30℃孵育25 min，离心后沉淀用0.5 mL 4℃HEPES binding buffer洗4遍，加上样缓冲液变性后离心，取上清进行SDS-PAGE。电泳结束后进行干胶，最后胶压储磷屏(storage-phosphoscreen,Packard)3.5 h，用Kodak 1D analysis 2.0软件对储磷屏上37 kD的GST-c-Jun(79)条带进行光密度扫描，以对照组的光密度为1.0，相应处理组的光密度为相对光密度。
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结 果
一、JNK1磷酸化测定
由图1可见：3个时间点的MNNG处理组(M1(0),M2.5(6),M2.5(12)组)和各自对照组(D1(0),D2.5(6),D2.5(12)组)相比，JNK1的磷酸化程度无明显变化：M1(0),M2.5(6),M2.5(12)的相对P/N光密度值分别为1.07,0.99,0.99。而M2.5(0)组与其对照组D2.5(0)相比，JNK1的磷酸化程度明显增高：M2.5(0)的相对P/N光密度值为1.75。由图2可见：2个时间点的CHM处理组(C6,C12组)和各自对照组(H6,H12组)相比，JNK1的磷酸化程度无明显变化：C6,C12的相对P/N光密度值分别为1.0和1.07。而C1组与其对照H1组相比，JNK1的磷酸化程度明显增高：C1的相对P/N光密度值为1.4。
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二、固相激酶活性测定
根据JNK1磷酸化测定的结果，取M2.5(0),D2.5(0)组和C1，H1组进行JNKs的激酶活性测定。如图3所示：M2.5(0)组和C1组的相对光密度分别为6.7和3.0。由于c-Jun是JNKs比较特异的底物，所以这表明M2.5(0)组和C1组的JNKs的激酶活性分别为其对照D2.5(0)组和H1组的6.7倍和3.0倍。
讨 论
细胞在外界应激原(stressor)的刺激下可引起细胞在基因表达，蛋白合成以及细胞代谢等方面的改变，而这些都是通过细胞信号转导通路的改变引起的。细胞最终的命运决定于凋亡性和抗凋亡性信号转导通路的竞争以及应激适应性信号转导通路是否被激活。MNNG对哺乳类细胞来说是一种化学性应激原，已经证明MNNG可引起vero细胞基因表达改变[9]，这必定是细胞信号转导通路改变的结果。JNKs是属于广义的MAPK(mitogen-activated protein kinase)超家族的一类成员，许多外界应激原(如紫外线，热休克，渗透压休克，一些蛋白合成抑制剂，神经酰胺等)可使JNK1的Thr-183和Tyr-185被磷酸化而活化[4,10]，c-Jun是JNKs比较特异的底物，可自身形成同二聚体或与c-Fos形成异二聚体而成为一种转录因子，c-Jun的转录活性可通过其上Ser63和Ser73被JNKs磷酸化所调节[6]。
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Fig 1 Western Blot analysis of phosphorylated (P) and nonphosphorylated(N) JNK1 in whole cell extracts of vero cells pretreated with N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)
M1(0),D1(0):extracts of vero cells after 0.2 μmol/L, 1 h MNNG or 0.2% V/V, 1 h DMSO treatment, respectively; M2.5(0)， M2.5(6), M2.5(12)：extracts of vero cells prepared at 0,6,12 h after 0.2 μmol/L MNNG 2.5 h treatment, respectively; D2.5(0),D2.5(6), D2.5(12):extracts of vero cells prepared at 0,6,12 h after 0.2% V/V, 2.5 h DMSO treatment, respectively; OD: optical density
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图1 经N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理的vero细胞的全细胞抽提液中磷酸化(P)与非磷酸化(N)JNK1的Western印迹分析
Fig 2 Western Blot analysis of phosphorylated (P) and nonphosphorylated (N) JNK1 in whole cell extracts of vero cells pretreated with cycloheximide(CHM)
H1,H6，H12:extracts of vero cells after 1, 6, 12 h 0.1% V/V Hanks solution treatment, respectively; C1，C6，C12:extracts of vero cells after 1,6,12 h 1 mg/L CHM treatment, respectively; OD: optical density
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图2 经放线菌素酮(CHM)处理的vero细胞的全细胞抽提液中磷酸化(P)与非磷酸化(N)JNK1的Western印迹分析
Fig 3 The JNKs kinase activity induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG) or cycloheximide (CHM) in vero cells
M2.5(0),D2.5(0):extracts of vero cells after 0.2 μmol/L,2.5 h MNNG or 0.2% V/V, 2.5 h DMSO treatment, respectively; C1,H1;extracts of vero cells after 1 mg/L, 1 h CHM or 0.1% V/V, 1 h Hanks solution treatment, respectively; OD:optical density
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图3 vero细胞内经N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或放线菌素酮(CHM)诱导的JNKs激酶活性
在本实验的JNK1磷酸化测定中，经0.2 μmol/L MNNG处理1 h后，以及0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后再继续培养6，12 h，JNK1磷酸化程度与对照相比没有明显差别，而0.2μmol/L MNNG处理2.5 h后即时可发现JNK1磷酸化程度比对照明显增高。另外，1 mg/L CHM处理vero细胞1 h也可使JNK1磷酸化程度比对照明显增高，而1 mg/L CHM处理6 h和12 h后JNK1磷酸化程度与对照相比没有明显差别。在JNKs的固相激酶活性测定实验中，vero细胞经0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h和1 mg/L CHM处理1 h可引起c-Jun的磷酸化程度明显增高。由于c-Jun是JNKs比较特异的底物，所以这反映了JNKs的激酶活性明显增强。
JNKs的主要形式是46 kD的JNK1，另外还有54 kD的JNK2。本实验Western印迹法中所用的一抗虽为抗JNK1抗体，但在54 kD左右分子量也有明显蛋白条带，可能是该抗体与JNK2的交叉反应。另外有学者报道较强的外界应激原激活JNKs多在处理1 h内达到高峰[10]，本实验CHM处理组确符合这种情况。但0.2 μmol/L MNNG处理细胞不是在1 h而是在2.5 h达到高峰，这可能是由于我们所用的低浓度MNNG对细胞来说仅是弱应激原，它所引起的JNKs磷酸化和活化与较强应激原引起的JNKs磷酸化和活化在时相特征上有所区别。另外在JNK1磷酸化测定实验中发现除了M2.5(0)，D2.5(0)组以外，其余各MNNG处理组与其对照组相比，都有相同程度的磷酸化JNK1条带，并可测得一定水平的JNKs激酶活性，说明在我们的实验条件下vero细胞内存在一定水平的本底JNKs激酶活性。我们以前曾发现0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后再经12 h和1 mg/L CHM处理12 h也都可引起vero细胞45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化增强[3]，但本实验中在这两种条件下并未发现JNK1磷酸化程度比对照有所增高，提示0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后再经12 h和1 mg/L CHM处理vero细胞12 h所引起vero细胞酪氨酸磷酸化增强的45 kD蛋白质是JNK1以外的另一种蛋白质。
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本实验的结果证明用于诱导vero细胞产生非定标性突变的实验条件可以激活vero细胞内JNK/SAPK通路。但是要明确JNK/SAPK通路的的激活与非定标性突变的产生之间的因果关系以及非定标性突变的产生与其他信号转导通路改变之间的关系仍需进一步的研究。
[基金项目] 国家和浙江省自然科学基金资助，编号为No.39670641和No.396054
[参 考 文 献]
[1] 孙雪敏，余应年，张小山，等. 转录与翻译抑制剂对哺乳类细胞非定标性突变形成的影响[J]. 癌变*畸变*突变，1996，8(5)：286～289.
[2] 孙雪敏，余应年，陈星若. MNNG处理的vero细胞中磷酸化蛋白的差异显示[J]. 中国病理生理杂志，1999，15(2)：97～99.
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[3] 鲁 靖，余应年，谢海洋. N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍诱发的vero细胞蛋白酪氨酸磷酸化改变[J]. 中国药理学与毒理学杂志，2000,14(1):49～53.
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[5] Krause A, Holtmann H, Eickemeier S, et al. Stress-activated protein kinase/Jun N-terminal kinase is required for interleukin(IL)-1-induced IL-6 and IL-8 gene expression in the human epidermal carcinoma cell line KB[J]. J Biol Chem, 1998,273(37):23681～23689.
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[7] 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T， 主编.分子克隆实验指南[M].第2版. 北京：科学出版社，1996. 880～898.
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[9] 胡文蔚，余应年，张小山,等. N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定[J]. 中国药理学与毒理学杂志，1998，12(1)：62～66.
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[收稿日期] 1999-03-31 [修回日期] 1999-06-29
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单位：(浙江大学医学院病理生理学教研室， 浙江 杭州 310031)
关键词：亚硝基胍类；印迹法，蛋白质；磷酸转移酶类，ATP
中国病理生理杂志000601
[摘 要] 目的和方法：为了研究DNA损伤剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发vero细胞非定标性突变发生的信号转导机制，我们观察了MNNG诱发vero细胞c-Jun NH2-terminal kinase/stress activated protein kinase(JNK/SAPK)通路激活的情况：分别用Western印迹法和固相激酶活性测定法检测JNK1磷酸化和JNKs激酶活性。结果：发现用0.2 μmol/L MNNG和1 mg/L放线菌素酮(CHM)分别处理vero细胞2.5 h和1 h后，都引起细胞抽提液中磷酸化JNK1的比例明显增高。同时通过测定JNKs的底物c-Jun的磷酸化程度，发现这两种处理也都可引起JNKs激酶活性显著增高(分别增高6.7和3.0倍)。结论：证明0.2 μmol/L MNNG和1 mg/L CHM分别处理vero细胞2.5 h和1 h都可引起vero细胞内JNK/SAPK通路被激活。
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[中图分类号] Q257 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0481-05
Activation of JNK/SAPK pathway in vero cells induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine
LU Jing, YU Yin-nian, XIE Hai-yang
(Department of Pathophysiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031, China)
[Abstract] AIM and METHODES: To evaluate the possible signal transduction mechanism of nontargeted mutagenesis in vero cells induced by DNA damaging agent N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG),the activation of c-Jun NH2-terminal kinase/stress activated protein kinase(SAPK/JNK) pathway in vero cells induced by MNNG was studied. Western Blot analysis and Solid-phase kinase assay were used to measure the phosphorylation of JNK1 and kinase activity of JNKs, respectively. RESULTS: After 0.2 μmol/L, 2.5 h MNNG or 1 mg/L, 1 h cycloheximide (CHM) treatment, the proportion of phosphorylated JNK1 in cell extract increased significantly, simultaneously the kinase activity of JNKs increased dramatically(6.7 and 3.0 folds respectively), as measured by the phosphorylation of c-Jun, a substrate of JNKs. CONCLUSION: Both 0.2 μmol/L 2.5 h MNNG and 1 mg/L 1 h CHM treatment can induce the activation of JNK/SAPK pathway, one of the stress signal transduction pathways, in vero cells.
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[MeSH] Nitrosoguanidines; Blotting, Western; Phosphotransferases, ATP
在对哺乳类细胞非定标性突变发生机制的研究中，我们已经证明DNA烷化剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导猴肾vero细胞产生的非定标性突变有一定的时相特征。转录和释译抑制剂处理，放射性同位素标记磷酸化蛋白质等一系列实验提示非定标性突变的形成有细胞信号转导通路的介入[1，2]。用Western印迹法发现0.2 μmol/L MNNG处理vero细胞2.5 h后以及处理2.5 h后再常规培养12 h都可引起45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化程度增高，1 mg/L 放线菌素酮(cycloheximide, CHM)处理12 h也可引起45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化程度增高[3]，直接提示MNNG处理vero细胞可能诱发应激相关信号转导通路的激活。
c-Jun N-末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)/应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase, SAPK)是一类近年来被深入研究的应激反应性蛋白激酶[4]，其中的JNK1分子量为46 kD。许多外界应激原都可以使JNKs/SAPKs磷酸化而活化，JNKs/SAPKs可使转录因子(如c-jun)磷酸化，实现对基因的调控[5]。为探讨本实验室用来诱导vero细胞产生非定标性突变的条件能否激活JNK/SAPK信号转导通路，本实验用Western印迹法(Western blot)和固相激酶活性测定法(solid-phase kinase assay)在不同的时点分别观察了MNNG和CHM处理所引起的vero细胞JNK1磷酸化程度和JNKs的激酶活性的改变。
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材 料 和 方 法
一、细胞培养
猴肾vero细胞在DMEM(Dulbeccos modified eagle medium)培养基(Gibco BRL)中(含10% V/V小牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素，200 mg/L卡那霉素)常规贴壁培养，当细胞处于对数生长期，贴壁面积达80%汇合时分组处理。
二、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)及放线菌素酮(CHM)处理细胞
MNNG处理：分为4组：用含0.2 μmol/L MNNG(Sigma)的无血清DMEM培养基处理vero细胞1 h(标为M1(0)组)和2.5 h后，换以新鲜DMEM全培养基，继续培养0，6，12 h(分别标为M2.5(0)，M2.5(6)，M2.5(12)组)，在4个不同时点收集细胞。对照组除用MNNG溶液的溶剂二甲基亚砜(DMSO)(0.2% V/V)代替MNNG以外，其余处理相同(分别标为D1(0)，D2.5(0)，D2.5(6)，D2.5(12)组)。
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CHM处理：分为3组：用含1 mg/L CHM(Sigma)的无血清DMEM处理vero细胞1， 6，12 h后收集细胞(标为C1，C6，C12组)。其对照用CHM的溶剂Hanks液(0.1% V/V)代替CHM，其余处理相同(分别标为H1，H6，H12组)。
三、全细胞抽提液的制备及蛋白浓度测定
各组细胞收集完毕，用细胞裂解液[6](25 mmol/L HEPES(pH 7.7),0.3 mol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L Na3VO4, 20 mmol/L β-glycerophosphate, 1% V/V Triton-X-100, 0.5 mmol/L DTT, 2 mg/L leupeptin, 100 mg/L PMSF)4℃裂解细胞45 min,15 600×g 4℃离心30 min后，上清(即全细胞抽提液)分装，储于-70℃备用。用改良Lowry法[3]测各组全细胞抽提液中蛋白质总浓度。
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四、Western印迹[7]
各组全细胞抽提液加上样缓冲液(终浓度为62.5 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，2% W/V SDS， 50 mmol/L DTT,7.5% V/V glycerol)后加样进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)(5% W/V积层胶，10% W/V分离胶)。SDS-PAGE结束后，将凝胶上蛋白质电转移至硝酸纤维素膜(NC膜Amersham)。NC膜用TBS(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),150 mmol/L NaCl)漂洗后，加Blotto A(含5% W/V milk,0.05% V/V Tween-20的TBS)室温缓摇20 min，弃Blotto A,加含0.5 mg/L抗JNK1兔多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology)的Blotto A室温缓摇60 min,用TBST(含0.05% V/V Tween-20的TBS)洗NC膜后加含0.75% V/V羊抗兔IgG-HRP(华美)的Blotto A室温缓摇45 min,用TBST和TBS洗膜后进行增强化学发光(ECL)反应60 s，压片后取出胶片进行显影和定影。由于磷酸化JNK1和非磷酸化JNK1的电泳迁移率不同[8]，可用Kodak 1D analysis 2.0软件对各组的磷酸化JNK1(P)和非磷酸化JNK1(N)条带进行光密度扫描，计算各组磷酸化JNK1光密度占非磷酸化JNK1光密度的百分比(P/N)，把各对照组与相应处理组的P/N进行比较，对照组的P/N定为1.0，相应处理组P/N与前者相比的倍数为相对P/N光密度值。
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五、固相激酶活性测定[6]
细胞抽提液被稀释成终浓度为20 mmol/L HEPES(pH 7.7)，75 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 0.1% V/V Triton X-100, 0.5 mmol/L DTT, 20 mmol/L β-glycerophosphate,0.1 mmol/L Na3VO4, 2 mg/mL leupeptin,100 mg/mL PMSF。取适当体积的细胞抽提液(使其蛋白质含量为50μg)，加入5μg GST-c-Jun(79)-agarose(Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育3 h，离心后沉淀用0.5 mL 4℃HEPES binding buffer(20 mmol/L HEPES (pH 7.7),50 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L EDTA,0.05% V/V Triton X-100)洗4遍，沉淀重悬于15μL kinase buffer(20 mmol/L HEPES(pH 7.7),20 mmol/L MgCl2,20 mmol/L β-glycerophosphate,20 mmol/L p-nitrophenyl phosphate,0.1 mmol/L Na3VO4,2 mmol/L DTT,20μmol/L ATP, 9.25×104 Bq[γ-32P]ATP),30℃孵育25 min，离心后沉淀用0.5 mL 4℃HEPES binding buffer洗4遍，加上样缓冲液变性后离心，取上清进行SDS-PAGE。电泳结束后进行干胶，最后胶压储磷屏(storage-phosphoscreen,Packard)3.5 h，用Kodak 1D analysis 2.0软件对储磷屏上37 kD的GST-c-Jun(79)条带进行光密度扫描，以对照组的光密度为1.0，相应处理组的光密度为相对光密度。
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结 果
一、JNK1磷酸化测定
由图1可见：3个时间点的MNNG处理组(M1(0),M2.5(6),M2.5(12)组)和各自对照组(D1(0),D2.5(6),D2.5(12)组)相比，JNK1的磷酸化程度无明显变化：M1(0),M2.5(6),M2.5(12)的相对P/N光密度值分别为1.07,0.99,0.99。而M2.5(0)组与其对照组D2.5(0)相比，JNK1的磷酸化程度明显增高：M2.5(0)的相对P/N光密度值为1.75。由图2可见：2个时间点的CHM处理组(C6,C12组)和各自对照组(H6,H12组)相比，JNK1的磷酸化程度无明显变化：C6,C12的相对P/N光密度值分别为1.0和1.07。而C1组与其对照H1组相比，JNK1的磷酸化程度明显增高：C1的相对P/N光密度值为1.4。
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二、固相激酶活性测定
根据JNK1磷酸化测定的结果，取M2.5(0),D2.5(0)组和C1，H1组进行JNKs的激酶活性测定。如图3所示：M2.5(0)组和C1组的相对光密度分别为6.7和3.0。由于c-Jun是JNKs比较特异的底物，所以这表明M2.5(0)组和C1组的JNKs的激酶活性分别为其对照D2.5(0)组和H1组的6.7倍和3.0倍。
讨 论
细胞在外界应激原(stressor)的刺激下可引起细胞在基因表达，蛋白合成以及细胞代谢等方面的改变，而这些都是通过细胞信号转导通路的改变引起的。细胞最终的命运决定于凋亡性和抗凋亡性信号转导通路的竞争以及应激适应性信号转导通路是否被激活。MNNG对哺乳类细胞来说是一种化学性应激原，已经证明MNNG可引起vero细胞基因表达改变[9]，这必定是细胞信号转导通路改变的结果。JNKs是属于广义的MAPK(mitogen-activated protein kinase)超家族的一类成员，许多外界应激原(如紫外线，热休克，渗透压休克，一些蛋白合成抑制剂，神经酰胺等)可使JNK1的Thr-183和Tyr-185被磷酸化而活化[4,10]，c-Jun是JNKs比较特异的底物，可自身形成同二聚体或与c-Fos形成异二聚体而成为一种转录因子，c-Jun的转录活性可通过其上Ser63和Ser73被JNKs磷酸化所调节[6]。
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Fig 1 Western Blot analysis of phosphorylated (P) and nonphosphorylated(N) JNK1 in whole cell extracts of vero cells pretreated with N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)
M1(0),D1(0):extracts of vero cells after 0.2 μmol/L, 1 h MNNG or 0.2% V/V, 1 h DMSO treatment, respectively; M2.5(0)， M2.5(6), M2.5(12)：extracts of vero cells prepared at 0,6,12 h after 0.2 μmol/L MNNG 2.5 h treatment, respectively; D2.5(0),D2.5(6), D2.5(12):extracts of vero cells prepared at 0,6,12 h after 0.2% V/V, 2.5 h DMSO treatment, respectively; OD: optical density
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图1 经N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理的vero细胞的全细胞抽提液中磷酸化(P)与非磷酸化(N)JNK1的Western印迹分析
Fig 2 Western Blot analysis of phosphorylated (P) and nonphosphorylated (N) JNK1 in whole cell extracts of vero cells pretreated with cycloheximide(CHM)
H1,H6，H12:extracts of vero cells after 1, 6, 12 h 0.1% V/V Hanks solution treatment, respectively; C1，C6，C12:extracts of vero cells after 1,6,12 h 1 mg/L CHM treatment, respectively; OD: optical density
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图2 经放线菌素酮(CHM)处理的vero细胞的全细胞抽提液中磷酸化(P)与非磷酸化(N)JNK1的Western印迹分析
Fig 3 The JNKs kinase activity induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG) or cycloheximide (CHM) in vero cells
M2.5(0),D2.5(0):extracts of vero cells after 0.2 μmol/L,2.5 h MNNG or 0.2% V/V, 2.5 h DMSO treatment, respectively; C1,H1;extracts of vero cells after 1 mg/L, 1 h CHM or 0.1% V/V, 1 h Hanks solution treatment, respectively; OD:optical density
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图3 vero细胞内经N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或放线菌素酮(CHM)诱导的JNKs激酶活性
在本实验的JNK1磷酸化测定中，经0.2 μmol/L MNNG处理1 h后，以及0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后再继续培养6，12 h，JNK1磷酸化程度与对照相比没有明显差别，而0.2μmol/L MNNG处理2.5 h后即时可发现JNK1磷酸化程度比对照明显增高。另外，1 mg/L CHM处理vero细胞1 h也可使JNK1磷酸化程度比对照明显增高，而1 mg/L CHM处理6 h和12 h后JNK1磷酸化程度与对照相比没有明显差别。在JNKs的固相激酶活性测定实验中，vero细胞经0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h和1 mg/L CHM处理1 h可引起c-Jun的磷酸化程度明显增高。由于c-Jun是JNKs比较特异的底物，所以这反映了JNKs的激酶活性明显增强。
JNKs的主要形式是46 kD的JNK1，另外还有54 kD的JNK2。本实验Western印迹法中所用的一抗虽为抗JNK1抗体，但在54 kD左右分子量也有明显蛋白条带，可能是该抗体与JNK2的交叉反应。另外有学者报道较强的外界应激原激活JNKs多在处理1 h内达到高峰[10]，本实验CHM处理组确符合这种情况。但0.2 μmol/L MNNG处理细胞不是在1 h而是在2.5 h达到高峰，这可能是由于我们所用的低浓度MNNG对细胞来说仅是弱应激原，它所引起的JNKs磷酸化和活化与较强应激原引起的JNKs磷酸化和活化在时相特征上有所区别。另外在JNK1磷酸化测定实验中发现除了M2.5(0)，D2.5(0)组以外，其余各MNNG处理组与其对照组相比，都有相同程度的磷酸化JNK1条带，并可测得一定水平的JNKs激酶活性，说明在我们的实验条件下vero细胞内存在一定水平的本底JNKs激酶活性。我们以前曾发现0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后再经12 h和1 mg/L CHM处理12 h也都可引起vero细胞45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化增强[3]，但本实验中在这两种条件下并未发现JNK1磷酸化程度比对照有所增高，提示0.2 μmol/L MNNG处理2.5 h后再经12 h和1 mg/L CHM处理vero细胞12 h所引起vero细胞酪氨酸磷酸化增强的45 kD蛋白质是JNK1以外的另一种蛋白质。
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本实验的结果证明用于诱导vero细胞产生非定标性突变的实验条件可以激活vero细胞内JNK/SAPK通路。但是要明确JNK/SAPK通路的的激活与非定标性突变的产生之间的因果关系以及非定标性突变的产生与其他信号转导通路改变之间的关系仍需进一步的研究。
[基金项目] 国家和浙江省自然科学基金资助，编号为No.39670641和No.396054
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-03-31 [修回日期] 1999-06-29
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