乳猪肝胶原水解物的制备及其对荷瘤小鼠肿瘤生长影响的实验研究
作者：邹清雁 刘钢 孔祥平 邹晓军 曾平鲁 杨联萍 郑国池 张宜俊
单位：(解放军458医院，广东 广州 510602)
关键词：肿瘤；小鼠；胶原；生长抑制物
中国病理生理杂志000624
[摘 要] 目的：从乳猪肝中提取可溶性胶原，经水解后制备肝胶原水解物(HCH)，观察其对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤和HepA肝瘤增殖的影响。方法：从乳猪肝中用生化方法提取可溶性胶原，经胃蛋白酶水解制备HCH；采用SDS-PAGE电泳和激光飞行时间质谱测定其分子量。设立生理盐水阴性对照和阿霉素阳性对照组，观察HCH对荷瘤昆明小鼠S180纤维肉瘤和HepA肝瘤增殖的影响。结果：电泳结果显示，HCH的分子量范围为3.494～8.702 kD, 质谱结果显示，其分子量为2.313～8.809 kD。其对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤生长的抑制呈剂量相关性，25、50、100 mg.g-1.d-1的抑制率为53.87%、76.53%、58.20%，而阿霉素(2 mg.kg-1.d-1)阳性对照组的抑制率为62.41%；HCH能剂量依赖性地抑制HepA肝瘤生长，25、50、100、200 mg.kg-1.d-1的抑制率为43.26%、55.06%、74.71%、40.47%。结论：经此方法制备HCH，其分子量在2～9kDa之间，能抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R73-35+4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0565-03
[MeSH] Neoplasms; Mice; Collagen; Growth inhibitors
肿瘤血管异常增生是实体瘤生长和转移的必要条件[1]。O'Reilly等从小鼠血管内皮瘤(EOMA)的培养上清中发现了一种能特异性地抑制毛细血管内皮细胞生长的因子，其分子量为20 kD，命名为内皮抑素(endostatin, ES)，ES是胶原ⅩⅧ的酶解产物，为其非胶原区(NC区)C末端183 aa的片段；完整的胶原ⅩⅧ并不具备抑制肿瘤生长的活性[2]。胶原ⅩⅧ主要分布于肝、肺、肾等组织，其中肝实质细胞，胆管上皮细胞和新生血管内皮细胞能合成和分泌胶原ⅩⅧ[2]。根据以上研究结论，我们设计了从肝组织中提取可溶性胶原，经水解后制备肿瘤生长抑制物的研究思路，现将实验结果报道如下：
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、 肝胶原水解物的制备
(一) 肝可溶性胶原的提取 参考文献[3]的方法稍加改进从乳猪肝组织中制备肝可溶性胶原(30～40 g/L)。
(二) 水解 胶原用0.1 mol/L HCl调pH至4～5，加入胃蛋白酶使其终浓度为0.05%，4℃消化20 h。
(三) 用 0.1 mol/L NaOH调pH至7.0，离心，取上清液，用截止分子量为10 kD的超滤膜将消化后的小片段与酶及胶原分离，收集超滤液(<10 kD)，除菌分装，-20℃保存备用，以下称肝胶原水解物(hepatic collagenous hydrolysates, HCH)。 多肽测定采用改良福林-酚法。
二、 HCH的抑瘤活性测定
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(一) 鼠S180纤维肉瘤细胞株(腹水型) HepA小鼠肝瘤细胞株(腹水型)，引自中山医科大学实验动物中心。昆明小鼠：雄性，购自中山医科大学实验动物中心。
(二) 肿瘤细胞小鼠腹腔接种 用含10%小牛血清的DME/F12培养液培养，收集细胞，用无菌Hanks液将细胞稀释成1～2×109个/L，进行昆明小鼠(体重26～30 g)腹腔接种，每鼠0.3 mL，7～10 d后进行试验。
(三) 制做小鼠荷瘤模型 将有腹腔接种肿瘤细胞7～10 d的小鼠断颈处死，抽取腹水制备1～2×109个/L浓度的细胞悬液，活细胞数应大于85%。取该悬液0.1 mL种植于每只小鼠(体重18～24 g)腰部正中线皮下。随机分组。
(四) 种植后第7 d开始给药 荷S180纤维肉瘤小鼠，阴性对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL.d-1，阳性对照组腹腔注射阿霉素2 mg.kg-1.d-1, 治疗组分3个剂量组分别腹腔注射HCH 25、50、100 mg.kg-1.d-1。荷HepA肝瘤小鼠，阴性对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL.d-1，阳性对照组腹腔注射阿霉素2 mg.kg-1.d-1, 治疗组分4个剂量组分别腹腔注射HCH 25、50、100、200 mg.kg-1.d-1。停药后第2 d断颈处死小鼠，解剖皮下肿瘤并称重，取瘤时注意剔除周围正常组织。
, 百拇医药
三、 分子量范围测定
(一) SDS-PAGE电泳 具体方法与步骤参见文献[4]。
(二) 激光飞行时间质谱 激光波长355 nm，激光焦斑直径100 μm，加速电压18 kV，以胰岛素B链(Mr，3497.3)和细胞色素C(Mr,12361.0)为内标，检测样品的分子量。
四、数据以
±s表示，统计处理采用t检验或F方差检验。
结 果
一、 HCH对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤生长的影响(表1)
接种S180纤维肉瘤细胞后观察至24 d，阿霉素组出现2只小鼠死亡，即结束实验，称体重及瘤重进行统计学处理，结果见表1。
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表1 HCH对S180纤维肉瘤生长的影响
Tab 1 The effect of hepatic collagenous hydrolysates on the growth of S180 murine sarcoma transplanted in mice(±s,n=10)
Wt of mice at
inoculation(g)
Wt of mice
on biopsy(g)
Wt of tumors
, http://www.100md.com (g)
Inhibitory
rate(%)
Control
20.66±2.46
31.41±4.67
1.756±1.034
—
Doxorubicin
21.60±1.34
19.80±2.09*
0.660±0.821**
, http://www.100md.com
62.41
HCH(mg/kg)
100
21.60±1.82
31.05±1.52
0.734±0.744**
58.20
50
21.33±1.03
31.48±1.62
0.412±0.454**
, 百拇医药
76.53
25
22.20±1.92
30.59±1.33
0.810±0.595**
53.87
* P<0.01, vs the other groups; **P<0.01, vs control; Wt=Weight
二、 HCH对荷瘤小鼠HepA肝瘤生长的影响(表2)
接种HepA肝瘤细胞后共观察36 d，在观察到24 d时，除阿霉素组有一只小鼠死亡外，其它各组均无死亡。24～36 d 间对照组有3只小鼠因瘤体过重消耗或瘫痪而死亡，HCH组200 mg/kg剂量组有一只小鼠因瘫痪而死亡。中途死亡的小鼠称体重及瘤重，所得数据纳入整体数据进行统计学处理，结果见表2。
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表2 HCH对HepA肝瘤生长的作用
Tab 2 The effect of hepatic collagenous hydrolysates on the growth of HepA murine hepatoma transplanted in mice(±s,n=8)
Wt of mice at
inoculation (g)
Wt of mice
on biopsy (g)
Wt of tumors
, http://www.100md.com (g)
Death
rate (%)
Inhibitory
rate(%)
Control
22.58±1.44
32.91±5.61
8.019±5.136
37.5
—
HCH(mg/kg)
, 百拇医药
200
22.00±1.99
36.50±5.51
4.774±3.336
12.5
40.47
100
23.20±0.84
40.22±2.94**
2.028±2.184**
—
, 百拇医药 74.71
50
23.00±1.23
40.31±6.16**
3.604±4.364*
—
55.06
25
23.40±2.30
41.25±2.75**
4.550±3.328
, 百拇医药
—
43.26
* P<0.05， ** P<0.01， vs control
阿霉素组在治疗过程中第21 d即出现小鼠死亡，当即停用阿霉素，至第35 d共死亡6只，死亡率为75%(同对照组比，P<0.05)，体重及瘤重的数据没有详细统计，因而未列入表中。
三、 分子量测定结果表明
SDS-PAGE电泳结果显示，HCH的分子量范围为3.494～8.701 kD，呈连续带分布。激光飞行时间质谱测定其分子量为2.313～8.809 kD，呈连续分布。两者的差异可能与不同的检测系统有关。
讨 论
自从O'Reilly等报道endostatin能抑制肿瘤生长和转移以来，引起医学界的广泛关注，国内外对其进行了大量的研究。目前，拥有endostatinTM专利的Entremed公司已申请并通过美国FDA的批准进入Ⅱ期临床试验(Web site: Http：//www.entremed.com)。 EndostatinTM的作用与细胞粘附分子有关，如endostatin分子表面含有E-selectin的CRD区域，以及其分子表面带有11个精氨酸，具有强大的肝素结合功能。Endostatin 位于小鼠胶原ⅩⅧC末端非胶原(NC11)区，最近发现人类胶原ⅩⅤ非胶原(NC10)区同样具有抗血管增生的活性以及endostatin裂解的3～4 kD小分子量的多肽片段同样具有抑制肿瘤血管生长的活性[5]。具有抗血管生长和抑瘤的活性物质已达35种之多，其中包括鲨鱼软骨提取物，TNP-470，反应停等。我们从乳猪肝可溶性胶原中制备的小分子多肽，分子量为2～9 kD，也显示了一定抗荷瘤小鼠肿瘤生长的作用(表1、表2)，其机制可能与endostatin 的作用机制有关，同时证实了小分子量的多肽具有抑制肿瘤生长的作用。
, 百拇医药
HCH对上述二株瘤细胞在小鼠体内的生长均有明显的抑制作用，说明HCH对不同恶性程度和组织来源的肿瘤生长均有抑制作用。
我们曾报道,从肝提取物中纯化的肝提取肽，分子量为4.020 kD, 能抑制体外培养癌细胞的生长和荷瘤裸小鼠体内BEL-7402肝癌细胞的生长；其作用与凋亡有关[6]。是否这种凋亡小肽的作用机制与ES的作用机制相似目前还不清楚。
胶原ⅩⅧ在其胶原区由三股螺旋结构组成，其间有非螺旋结构的非胶原(NC)区。采用普通酶法消化主要是切断其非胶原(NC)区的多肽键，而胶原区除用胶原酶能解螺旋消化外，其它酶或轻微的物理化学因素对其影响不明显。因此，本研究采用酶法消化下来的多肽片段应属于NC区(包括C末端和N末端)的片段。
基因工程法生产的endostatin蛋白，每毫克需成本2～3千元，其产量少，成本高，难以满足临床需要，用量少则难以达到有效剂量(小鼠20～100 mg*kg-1*d-1为有效剂量)；因此，美国Entremed公司的Ⅱ期临床计划正因为Endostatin产量少而难以实施，目前正在寻找批量生产Endostatin的方案。利用生化提取水解法制备具有抑制肿瘤生长活性物质的方法，具有产量大，成本低，可满足临床用量的特点。同endostatin一样，它们的临床确切疗效还有待深入研究。
, 百拇医药
[基金项目] 广东省自然科学基金资助(99B04704G-47-2)
[参 考 文 献]
[1] Bouck N, Stellmach V, Hsu SC. How tumors become angiogenic[J]. Adv Cancer Res, 1996, 69:135～174.
[2] O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J]. Cell, 1997,88:277～285.
[3] 李成章，樊明文. 胚胎骨型胶原的提取与鉴定[J]. 生物化学与生物物理进展 ,1996,23(4)：373～375.
, http://www.100md.com
[4] 杨联萍，孔祥平，易学瑞. SDS-PAGE 电泳对小分子多肽的分析[J]. 生物工程进展, 1198,18(6):49～51.
[5] 李希，徐根兴，王建军.重组人Endostatin/MBP融合蛋白片段的构建及体外抑制内皮细胞增殖活性[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1999，6(3)：240～241.
[6] Kong XP, Zou QY, Li RB, et al. Apoptosis of neoplasm cell lines induced by hepatic peptides extracted from sucking porcine hepatocyte[J]. World J Gastroenterol, 1999, 5(5): 435～440.
[收稿日期] 1999-12-29 [修回日期] 2000-04-24, http://www.100md.com
单位：(解放军458医院，广东 广州 510602)
关键词：肿瘤；小鼠；胶原；生长抑制物
中国病理生理杂志000624
[摘 要] 目的：从乳猪肝中提取可溶性胶原，经水解后制备肝胶原水解物(HCH)，观察其对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤和HepA肝瘤增殖的影响。方法：从乳猪肝中用生化方法提取可溶性胶原，经胃蛋白酶水解制备HCH；采用SDS-PAGE电泳和激光飞行时间质谱测定其分子量。设立生理盐水阴性对照和阿霉素阳性对照组，观察HCH对荷瘤昆明小鼠S180纤维肉瘤和HepA肝瘤增殖的影响。结果：电泳结果显示，HCH的分子量范围为3.494～8.702 kD, 质谱结果显示，其分子量为2.313～8.809 kD。其对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤生长的抑制呈剂量相关性，25、50、100 mg.g-1.d-1的抑制率为53.87%、76.53%、58.20%，而阿霉素(2 mg.kg-1.d-1)阳性对照组的抑制率为62.41%；HCH能剂量依赖性地抑制HepA肝瘤生长，25、50、100、200 mg.kg-1.d-1的抑制率为43.26%、55.06%、74.71%、40.47%。结论：经此方法制备HCH，其分子量在2～9kDa之间，能抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。
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[中图分类号] R73-35+4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0565-03
[MeSH] Neoplasms; Mice; Collagen; Growth inhibitors
肿瘤血管异常增生是实体瘤生长和转移的必要条件[1]。O'Reilly等从小鼠血管内皮瘤(EOMA)的培养上清中发现了一种能特异性地抑制毛细血管内皮细胞生长的因子，其分子量为20 kD，命名为内皮抑素(endostatin, ES)，ES是胶原ⅩⅧ的酶解产物，为其非胶原区(NC区)C末端183 aa的片段；完整的胶原ⅩⅧ并不具备抑制肿瘤生长的活性[2]。胶原ⅩⅧ主要分布于肝、肺、肾等组织，其中肝实质细胞，胆管上皮细胞和新生血管内皮细胞能合成和分泌胶原ⅩⅧ[2]。根据以上研究结论，我们设计了从肝组织中提取可溶性胶原，经水解后制备肿瘤生长抑制物的研究思路，现将实验结果报道如下：
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材 料 和 方 法
一、 肝胶原水解物的制备
(一) 肝可溶性胶原的提取 参考文献[3]的方法稍加改进从乳猪肝组织中制备肝可溶性胶原(30～40 g/L)。
(二) 水解 胶原用0.1 mol/L HCl调pH至4～5，加入胃蛋白酶使其终浓度为0.05%，4℃消化20 h。
(三) 用 0.1 mol/L NaOH调pH至7.0，离心，取上清液，用截止分子量为10 kD的超滤膜将消化后的小片段与酶及胶原分离，收集超滤液(<10 kD)，除菌分装，-20℃保存备用，以下称肝胶原水解物(hepatic collagenous hydrolysates, HCH)。 多肽测定采用改良福林-酚法。
二、 HCH的抑瘤活性测定
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(一) 鼠S180纤维肉瘤细胞株(腹水型) HepA小鼠肝瘤细胞株(腹水型)，引自中山医科大学实验动物中心。昆明小鼠：雄性，购自中山医科大学实验动物中心。
(二) 肿瘤细胞小鼠腹腔接种 用含10%小牛血清的DME/F12培养液培养，收集细胞，用无菌Hanks液将细胞稀释成1～2×109个/L，进行昆明小鼠(体重26～30 g)腹腔接种，每鼠0.3 mL，7～10 d后进行试验。
(三) 制做小鼠荷瘤模型 将有腹腔接种肿瘤细胞7～10 d的小鼠断颈处死，抽取腹水制备1～2×109个/L浓度的细胞悬液，活细胞数应大于85%。取该悬液0.1 mL种植于每只小鼠(体重18～24 g)腰部正中线皮下。随机分组。
(四) 种植后第7 d开始给药 荷S180纤维肉瘤小鼠，阴性对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL.d-1，阳性对照组腹腔注射阿霉素2 mg.kg-1.d-1, 治疗组分3个剂量组分别腹腔注射HCH 25、50、100 mg.kg-1.d-1。荷HepA肝瘤小鼠，阴性对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL.d-1，阳性对照组腹腔注射阿霉素2 mg.kg-1.d-1, 治疗组分4个剂量组分别腹腔注射HCH 25、50、100、200 mg.kg-1.d-1。停药后第2 d断颈处死小鼠，解剖皮下肿瘤并称重，取瘤时注意剔除周围正常组织。
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三、 分子量范围测定
(一) SDS-PAGE电泳 具体方法与步骤参见文献[4]。
(二) 激光飞行时间质谱 激光波长355 nm，激光焦斑直径100 μm，加速电压18 kV，以胰岛素B链(Mr，3497.3)和细胞色素C(Mr,12361.0)为内标，检测样品的分子量。
四、数据以
±s表示，统计处理采用t检验或F方差检验。结 果
一、 HCH对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤生长的影响(表1)
接种S180纤维肉瘤细胞后观察至24 d，阿霉素组出现2只小鼠死亡，即结束实验，称体重及瘤重进行统计学处理，结果见表1。
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表1 HCH对S180纤维肉瘤生长的影响
Tab 1 The effect of hepatic collagenous hydrolysates on the growth of S180 murine sarcoma transplanted in mice(
±s,n=10)Wt of mice at
inoculation(g)
Wt of mice
on biopsy(g)
Wt of tumors
, http://www.100md.com (g)
Inhibitory
rate(%)
Control
20.66±2.46
31.41±4.67
1.756±1.034
—
Doxorubicin
21.60±1.34
19.80±2.09*
0.660±0.821**
, http://www.100md.com
62.41
HCH(mg/kg)
100
21.60±1.82
31.05±1.52
0.734±0.744**
58.20
50
21.33±1.03
31.48±1.62
0.412±0.454**
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76.53
25
22.20±1.92
30.59±1.33
0.810±0.595**
53.87
* P<0.01, vs the other groups; **P<0.01, vs control; Wt=Weight
二、 HCH对荷瘤小鼠HepA肝瘤生长的影响(表2)
接种HepA肝瘤细胞后共观察36 d，在观察到24 d时，除阿霉素组有一只小鼠死亡外，其它各组均无死亡。24～36 d 间对照组有3只小鼠因瘤体过重消耗或瘫痪而死亡，HCH组200 mg/kg剂量组有一只小鼠因瘫痪而死亡。中途死亡的小鼠称体重及瘤重，所得数据纳入整体数据进行统计学处理，结果见表2。
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表2 HCH对HepA肝瘤生长的作用
Tab 2 The effect of hepatic collagenous hydrolysates on the growth of HepA murine hepatoma transplanted in mice(
±s,n=8)Wt of mice at
inoculation (g)
Wt of mice
on biopsy (g)
Wt of tumors
, http://www.100md.com (g)
Death
rate (%)
Inhibitory
rate(%)
Control
22.58±1.44
32.91±5.61
8.019±5.136
37.5
—
HCH(mg/kg)
, 百拇医药
200
22.00±1.99
36.50±5.51
4.774±3.336
12.5
40.47
100
23.20±0.84
40.22±2.94**
2.028±2.184**
—
, 百拇医药 74.71
50
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40.31±6.16**
3.604±4.364*
—
55.06
25
23.40±2.30
41.25±2.75**
4.550±3.328
, 百拇医药
—
43.26
* P<0.05， ** P<0.01， vs control
阿霉素组在治疗过程中第21 d即出现小鼠死亡，当即停用阿霉素，至第35 d共死亡6只，死亡率为75%(同对照组比，P<0.05)，体重及瘤重的数据没有详细统计，因而未列入表中。
三、 分子量测定结果表明
SDS-PAGE电泳结果显示，HCH的分子量范围为3.494～8.701 kD，呈连续带分布。激光飞行时间质谱测定其分子量为2.313～8.809 kD，呈连续分布。两者的差异可能与不同的检测系统有关。
讨 论
自从O'Reilly等报道endostatin能抑制肿瘤生长和转移以来，引起医学界的广泛关注，国内外对其进行了大量的研究。目前，拥有endostatinTM专利的Entremed公司已申请并通过美国FDA的批准进入Ⅱ期临床试验(Web site: Http：//www.entremed.com)。 EndostatinTM的作用与细胞粘附分子有关，如endostatin分子表面含有E-selectin的CRD区域，以及其分子表面带有11个精氨酸，具有强大的肝素结合功能。Endostatin 位于小鼠胶原ⅩⅧC末端非胶原(NC11)区，最近发现人类胶原ⅩⅤ非胶原(NC10)区同样具有抗血管增生的活性以及endostatin裂解的3～4 kD小分子量的多肽片段同样具有抑制肿瘤血管生长的活性[5]。具有抗血管生长和抑瘤的活性物质已达35种之多，其中包括鲨鱼软骨提取物，TNP-470，反应停等。我们从乳猪肝可溶性胶原中制备的小分子多肽，分子量为2～9 kD，也显示了一定抗荷瘤小鼠肿瘤生长的作用(表1、表2)，其机制可能与endostatin 的作用机制有关，同时证实了小分子量的多肽具有抑制肿瘤生长的作用。
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HCH对上述二株瘤细胞在小鼠体内的生长均有明显的抑制作用，说明HCH对不同恶性程度和组织来源的肿瘤生长均有抑制作用。
我们曾报道,从肝提取物中纯化的肝提取肽，分子量为4.020 kD, 能抑制体外培养癌细胞的生长和荷瘤裸小鼠体内BEL-7402肝癌细胞的生长；其作用与凋亡有关[6]。是否这种凋亡小肽的作用机制与ES的作用机制相似目前还不清楚。
胶原ⅩⅧ在其胶原区由三股螺旋结构组成，其间有非螺旋结构的非胶原(NC)区。采用普通酶法消化主要是切断其非胶原(NC)区的多肽键，而胶原区除用胶原酶能解螺旋消化外，其它酶或轻微的物理化学因素对其影响不明显。因此，本研究采用酶法消化下来的多肽片段应属于NC区(包括C末端和N末端)的片段。
基因工程法生产的endostatin蛋白，每毫克需成本2～3千元，其产量少，成本高，难以满足临床需要，用量少则难以达到有效剂量(小鼠20～100 mg*kg-1*d-1为有效剂量)；因此，美国Entremed公司的Ⅱ期临床计划正因为Endostatin产量少而难以实施，目前正在寻找批量生产Endostatin的方案。利用生化提取水解法制备具有抑制肿瘤生长活性物质的方法，具有产量大，成本低，可满足临床用量的特点。同endostatin一样，它们的临床确切疗效还有待深入研究。
, 百拇医药
[基金项目] 广东省自然科学基金资助(99B04704G-47-2)
[参 考 文 献]
[1] Bouck N, Stellmach V, Hsu SC. How tumors become angiogenic[J]. Adv Cancer Res, 1996, 69:135～174.
[2] O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J]. Cell, 1997,88:277～285.
[3] 李成章，樊明文. 胚胎骨型胶原的提取与鉴定[J]. 生物化学与生物物理进展 ,1996,23(4)：373～375.
, http://www.100md.com
[4] 杨联萍，孔祥平，易学瑞. SDS-PAGE 电泳对小分子多肽的分析[J]. 生物工程进展, 1198,18(6):49～51.
[5] 李希，徐根兴，王建军.重组人Endostatin/MBP融合蛋白片段的构建及体外抑制内皮细胞增殖活性[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1999，6(3)：240～241.
[6] Kong XP, Zou QY, Li RB, et al. Apoptosis of neoplasm cell lines induced by hepatic peptides extracted from sucking porcine hepatocyte[J]. World J Gastroenterol, 1999, 5(5): 435～440.
[收稿日期] 1999-12-29 [修回日期] 2000-04-24, http://www.100md.com