EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响*
作者：黄培春 梁洪英 邓惠华 赵明伦
单位：黄培春 梁洪英(广东医学院病理生理教研室， 广东 湛江 524023)；邓惠华 赵明伦(广东医学院病理生理教研室， 广东 湛江 524023)
关键词：爱波斯坦-巴尔病毒；鼻咽肿瘤；细胞系；细胞分裂； 细胞死亡
中国病理生理杂志000719
[摘 要] 目的：探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法：用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1；用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达；用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力；用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果：感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性，生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P<0.01)，2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生，而均仅有2%～3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论：EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长，但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。
, 百拇医药
[中图分类号] R739.63 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0647-03
Effects of EBV infection on growth and apoptosis
of nasopharyngeal carcinoma cell line
HUANG Pei-chun, LIANG Hong-ying, DENG Hui-hua, ZHAO Ming-lun
(Department of Pathophysiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM: To explore the effect of EBV infection on growth and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma(NPC) cell line.METHODS: NPC cell line CNE1 was directly infected by Epstein Barr virus (EBV). The expression of EBV-latent membrane protein 1 (EBV-LMP1) and bcl-2 were detected by immunohistochemistry method (LSAB). The growth of NPC cells was identified by MTT method. Apoptotic carcinoma cells were detected by flow cytometry analysis and the terminal deoxynucletidyl transferase-medicated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) methods. RESULTS: EBV-LMP1 was positive in CNE1 infected by EBV(E-CNE1). Compared with CEN1, the growth of E-CNE1 apparently increased (P<0.01). No apoptotic carcinoma cells were detected and bcl-2 postive cells were 2%～3% respectively in 2 kinds of NPC cells.CONCLUSION: Growth of NPC cells is enhanced by EBV infection and EBV-LMP1 expression, but no influence on expression of bcl-2 and apoptosis of NPC cells.
, http://www.100md.com
[MeSH] Epstein-Barr virus; Nasopharyngeal neoplasms; Cell line; Cell division; Cell death
大量研究业已表明，EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌的关系十分密切，但EBV在鼻咽癌发生、发展中的作用和机制仍不清楚。近年有关EBV基因转染各种上皮细胞的研究报道较多，我们曾用EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)基因表达质粒转染人鼻咽癌细胞系，发现EBV-LMP1表达对鼻咽癌细胞生长等有明显影响[1，2]。这些研究表明EBV在鼻咽癌发生、发展中可能起重要作用。但有关EBV是否能直接感染和进入人鼻咽癌上皮细胞及其作用的研究报道甚少。本研究用EBV感染人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，观察其对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响，从不同角度探讨EBV在鼻咽癌发生、发展中的作用及机制。
材 料 和 方 法
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一、EB病毒制备
从带EBV基因并产EBV的B95-8细胞系中制备EBV。参照Hedrick等[3]的方法，用含15%小牛血清的RPMI-1640培养液调B95-8细胞浓度为5×105/mL，置33℃培养11 d，取培养上清经0.3 μm滤膜过滤后，18 000 r/min，4℃离心2 h，制备成10倍浓缩的EBV悬液，分装贮存于-70℃备用。
二、细胞培养及EB病毒感染
实验所用细胞为EBV阴性的人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，用含15%小牛血清的RPMI-1640培养液作常规培养。EBV感染参照Maria等[4]的方法，取生长良好的CNE1细胞，调细胞浓度为5×105/mL，加入EBV悬液，终浓度为1∶10，37℃培养和每2 d传代1次。培养4 d后开始取细胞作各种检测。另以非感染EBV的CNE1细胞作对照实验。
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三、LMP1和bcl-2的检测
采用免疫组化法(LSAB法)。LMP1和bcl-2单克隆抗体及LSAB试剂盒均为Dake公司产品，单抗用Tris-HCl缓冲液稀释，工作浓度分别为1∶40、1∶60。分别消化、收集生长良好的感染EBV的CNE1(E-CNE1)和未感染EBV的CNE1(CNE1)细胞涂片，自然风干后用丙酮甲醇(1∶1)4℃固定10 min。于细胞片上滴加正常兔血清，37℃孵育20 min，弃去兔血清后滴加LMP1或bcl-2单抗，37℃孵育30 min，Tris-HCl缓冲液洗3次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，Tris-HCl缓冲液洗3次，滴加过氧化酶标记的streptavidin, 37℃孵育30 min，Tris-HCl缓冲液洗3次，DAB染色10 min。最后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。以镜下所见明显的棕黄色颗粒为阳性。每种检测均用Tris-HCl缓冲液代替一抗作阴性对照。
四、细胞生长能力的检测
, 百拇医药
用MTT法。分别将细胞浓度为5×104/mL的E-CNE1和CNE1细胞悬液加入96孔培养板，每孔100 μL，每种细胞分2组，每组设12个平行孔，其中一组于37℃、5% CO2培养4 h后加入MTT，另一组于37℃、5%CO2培养48 h后加入MTT，每孔10 μL MTT(5 mg/mL)。加MTT后继续培养4 h，加DMSO，每孔100 μL，静置16 h后用全自动酶标仪测定570 nm、630 nm波长的OD值，并按以下公式[2]：
计算出OD值。公式中OD570-OD630能更准确地反映细胞增殖活性，48 h OD/4 h OD可消除由于组间细胞数计算差异所引起的OD值误差。每种细胞均同时测定含15%血清和无血清培养液培养的生长能力。
, 百拇医药
五、细胞凋亡的检测
采用以下2种方法分别检测E-CNE1和CNE1细胞在15%血清及无血清培养下的细胞凋亡。
(一)流式细胞仪检测法 参照文献[5]方法略加修改。贴壁细胞经胰酶消化、收获，用PBS洗2次，调细胞浓度为2×106/mL，分装每管0.3 mL，每管加入碘化丙啶(PI)染液(其中含PI 100 mg/L,RNase 100 mg/L，0.1% Triton X-100，0.1% 醋酸钠)0.7 mL 作用30 min，用流式细胞仪(美国Coulter公司生产的EPLCSXL型)检测。
(二)末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志法(TUNEL) 检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品，碱性磷酸酶底物坚固红及缓冲液为博士德公司出品。收获细胞涂片，晾干后用4%多聚甲醛(PBS配)固定20 min，PBS洗1次，再用0.1% Triton X-100柠檬酸缓冲液冰浴处理2 min。用PBS洗后滴加TUNEL反应液，37℃孵1 h。用PBS洗去反应液后滴加碱性磷酸酶联接的抗荧光素抗体(converter-AP)，37℃孵30 min，PBS洗后滴加碱性磷酸酶底物坚固红溶液，室温反应10～30 min，水洗后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。
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六、统计处理
实验数据用均数±标准差(
±s)表示，用t检验判断均数差异显著性。
结 果
一、LMP1表达的检测结果
免疫组化检测结果显示，用EBV感染的CNE1细胞(E-CNE1)的LMP1呈强阳性反应，未感染的CNE1细胞(CNE1)则为阴性，而两种细胞检测中用TBS代替一抗的阴性对照组全为阴性(见图1、2)。
二、EBV感染对鼻咽癌细胞生长的影响
MTT检测结果显示，在15%血清和无血清培养条件下，E-CNE-1的OD值均非常明显高于CNE1细胞系(P<0.01)，表明E-CNE1细胞系的生长能力明显增强(见表1)。
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表1 EB病毒感染对鼻咽癌细胞系生长的影响
Tab 1 The effect of EBV infection on growth of
nasopharyngeal carcinoma cell lines(±s,n=12) Cell lines
OD value
15% serum culture
Serum-free culture
E-CNE1
2.28±0.25*
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2.00±0.18*
CNE1
1.96±0.17
1.76±0.11
*P<0.01,vs CNE1 group
三、bcl-2表达和细胞凋亡的检测结果
免疫组化检测发现E-CNE1和CNE1细胞均有少数细胞的bcl-2呈强阳性反应，阳性率为2%～3%，2种细胞系的阳性率无显著差异(P>0.05)。用流式细胞仪测定细胞DNA含量，E-CNE1和CNE1细胞均未发现亚G1期细胞峰即凋亡峰；用敏感的末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志法检测凋亡细胞，2种细胞也未见染成红色的凋亡细胞。2种方法检测结果显示，E-CNE1和CNE1细胞系在15%血清和无血清培养条件下，其细胞凋亡均处于抑制状态。
, 百拇医药
Fig1 EBV-LMP1 in positiveon E-CNE1 cells(40×10)
图1 E-CNE1细胞的胞浆和胞膜LMP1阳性
Fig2 EBV-LMP1 is negative on E-CNE1 cells(41×10)
图2 CNE1细胞的LMP1的阴性
讨 论
EBV能否直接感染和进入鼻咽上皮细胞是人们在鼻咽癌病因发病学研究中长期探索但仍未能阐明的重要课题。我们原先的研究[6]已证实鼻咽癌上皮细胞存在EBV受体，这为EBV直接感染鼻咽上皮细胞提供了理论依据，但EBV能否通过相关受体感染鼻咽上皮细胞尚未得到进一步证实。最近，李岩松等[7]报道，用EBV感染人鼻咽癌细胞系，可从感染后的鼻咽癌细胞中检测到EBV的基因，并发现EBV感染可使该细胞的形态和DNA含量发生明显变化。这一研究初步表明EBV可感染和进入鼻咽癌上皮细胞并能引起细胞的某些生物学特性改变。本实验用EBV直接感染EBV阴性的人鼻咽癌上皮细胞系CNE1，发现EBV感染后，CNE1细胞的EBV-LMP1呈强阳性表达和细胞的增殖能力无论在15%血清或无血清培养条件下均显著增强。进一步表明，EBV可直接感染和进入人鼻咽癌上皮细胞并有促进细胞的生长作用。
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EBV-LMP1是目前唯一被证实在上皮细胞中表达的具有癌基因编码蛋白特性的EBV基因产物。基因转染研究表明，EBV-LMP1在鼻咽癌上皮细胞中表达可促进细胞生长和抑制细胞分化[1，2]。但是，EBV感染鼻咽癌细胞是否有EBV-LMP1表达，目前还不清楚。本实验结果显示，EBV感染CNE1细胞后可明显表达EBV-LMP1，因此可以推测，EBV感染促进鼻咽癌细胞的生长可能也是通过EBV-LMP1表达所致。
EBV感染人B淋巴细胞可通过上调癌基因bcl-2的作用而抑制细胞凋亡已被较多的研究所证实[8，9]。但最近刘克拉等[10]的研究发现，人鼻咽癌组织中的LMP1与bcl-2的表达无相关性，bcl-2的表达也不能抑制鼻咽癌细胞凋亡。我们用EBV-LMP1基因表达质粒转染人鼻咽癌细胞系的研究也证实了这一点[2]。为了解EBV感染和LMP1表达对CNE1细胞的bcl-2表达和细胞凋亡是否有影响，本文用不同方法检测了bcl-2表达和细胞凋亡。结果发现，感染EBV的CNE1细胞系与非感染EBV的CNE1细胞系一样，仅有极少数表达bcl-2，但细胞凋亡均已被明显地抑制，在15%血清和无血清培养条件下均无明显细胞凋亡发生。提示EBV感染和LMP1表达不能上调鼻咽癌细胞的bcl-2表达，鼻咽癌细胞凋亡的抑制不是bcl-2过度表达所致，而可能是癌变过程中的其他因素作用的结果。本研究结果表明，EBV感染和LMP1表达可增强鼻咽癌细胞的生长能力，但对细胞凋亡无明显影响。研究结果为EBV在鼻咽癌发生、发展中的作用提供了重要实验依据。
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[基金项目] 广东省高教厅重点科研基金资助(高9502)
[参 考 文 献]
[1] 段朝军，陈主初，赵明伦. EB病毒LMP与EGF自分泌在鼻咽癌细胞生长中的作用及其关系[J]. 湖南医科大学学报，1997， 22(6)：483～486.
[2] 黄培春，梁洪英，邓惠华，等. EB病毒LMP1促鼻咽癌细胞生长与CD23、bcl-2表达和凋亡的关系[J].癌症，2000，19(2)：124～127.
[3] Hedrick JA, Watry D, Speiser, et al. Interaction between Epstein-Barr virus and a T cell line (HSB-2) via a receptor phenotypcally distinct from complement receptor type2[J]. Eur J Immunol, 1992, 22(5): 1123～1131.
, http://www.100md.com
[4] Maria TB, Maria GM, George K, et al. T-cell-mediated inhibition of Epstein Barr virus-induced B-cell transformation:recognition of virus particles[J]. Int J Cancer, 1988, 42(3): 359～364.
[5] Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry [J]. J Immunol Methods, 1991, 139(2): 271～279.
[6] 吴 锋， 赵明伦，黄培春，等. EB病毒受体的放射配基结合分析[J]. 同济医科大学学报，1996， 25(5)：333～337.
, http://www.100md.com
[7] 李岩松，陈小毅，沈淑静，等. EBV感染对鼻咽癌细胞株形态参数和DNA含量的影响[J].广东医学院学报，1999，17(4)： 313～316.
[8] Henderson S, Rowe M, Gregory C, et al. Induction of bcl-2 expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 protects infected B cells from programmed cell death[J]. Cell, 1991, 65(7): 1107～1115.
[9] Gregory C, Dive C, Henderson S, et al. Activition of Epstein-Barr virus latent genes protects human B cells from death by apoptosis [J].Nature, 1991, 349(6310): 612～614.
[10] 刘克拉，宗永生，张昌卿，等. 鼻咽癌组织中EB病毒LMP1的表达与癌细胞增殖和凋亡的关系[J]. 癌症，1999， 18(1)：23～26.
[收稿日期]2000-04-18
[修回日期]2000-06-03, http://www.100md.com
单位：黄培春 梁洪英(广东医学院病理生理教研室， 广东 湛江 524023)；邓惠华 赵明伦(广东医学院病理生理教研室， 广东 湛江 524023)
关键词：爱波斯坦-巴尔病毒；鼻咽肿瘤；细胞系；细胞分裂； 细胞死亡
中国病理生理杂志000719
[摘 要] 目的：探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法：用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1；用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达；用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力；用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果：感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性，生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P<0.01)，2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生，而均仅有2%～3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论：EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长，但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。
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[中图分类号] R739.63 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0647-03
Effects of EBV infection on growth and apoptosis
of nasopharyngeal carcinoma cell line
HUANG Pei-chun, LIANG Hong-ying, DENG Hui-hua, ZHAO Ming-lun
(Department of Pathophysiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM: To explore the effect of EBV infection on growth and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma(NPC) cell line.METHODS: NPC cell line CNE1 was directly infected by Epstein Barr virus (EBV). The expression of EBV-latent membrane protein 1 (EBV-LMP1) and bcl-2 were detected by immunohistochemistry method (LSAB). The growth of NPC cells was identified by MTT method. Apoptotic carcinoma cells were detected by flow cytometry analysis and the terminal deoxynucletidyl transferase-medicated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) methods. RESULTS: EBV-LMP1 was positive in CNE1 infected by EBV(E-CNE1). Compared with CEN1, the growth of E-CNE1 apparently increased (P<0.01). No apoptotic carcinoma cells were detected and bcl-2 postive cells were 2%～3% respectively in 2 kinds of NPC cells.CONCLUSION: Growth of NPC cells is enhanced by EBV infection and EBV-LMP1 expression, but no influence on expression of bcl-2 and apoptosis of NPC cells.
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[MeSH] Epstein-Barr virus; Nasopharyngeal neoplasms; Cell line; Cell division; Cell death
大量研究业已表明，EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌的关系十分密切，但EBV在鼻咽癌发生、发展中的作用和机制仍不清楚。近年有关EBV基因转染各种上皮细胞的研究报道较多，我们曾用EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)基因表达质粒转染人鼻咽癌细胞系，发现EBV-LMP1表达对鼻咽癌细胞生长等有明显影响[1，2]。这些研究表明EBV在鼻咽癌发生、发展中可能起重要作用。但有关EBV是否能直接感染和进入人鼻咽癌上皮细胞及其作用的研究报道甚少。本研究用EBV感染人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，观察其对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响，从不同角度探讨EBV在鼻咽癌发生、发展中的作用及机制。
材 料 和 方 法
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一、EB病毒制备
从带EBV基因并产EBV的B95-8细胞系中制备EBV。参照Hedrick等[3]的方法，用含15%小牛血清的RPMI-1640培养液调B95-8细胞浓度为5×105/mL，置33℃培养11 d，取培养上清经0.3 μm滤膜过滤后，18 000 r/min，4℃离心2 h，制备成10倍浓缩的EBV悬液，分装贮存于-70℃备用。
二、细胞培养及EB病毒感染
实验所用细胞为EBV阴性的人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，用含15%小牛血清的RPMI-1640培养液作常规培养。EBV感染参照Maria等[4]的方法，取生长良好的CNE1细胞，调细胞浓度为5×105/mL，加入EBV悬液，终浓度为1∶10，37℃培养和每2 d传代1次。培养4 d后开始取细胞作各种检测。另以非感染EBV的CNE1细胞作对照实验。
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三、LMP1和bcl-2的检测
采用免疫组化法(LSAB法)。LMP1和bcl-2单克隆抗体及LSAB试剂盒均为Dake公司产品，单抗用Tris-HCl缓冲液稀释，工作浓度分别为1∶40、1∶60。分别消化、收集生长良好的感染EBV的CNE1(E-CNE1)和未感染EBV的CNE1(CNE1)细胞涂片，自然风干后用丙酮甲醇(1∶1)4℃固定10 min。于细胞片上滴加正常兔血清，37℃孵育20 min，弃去兔血清后滴加LMP1或bcl-2单抗，37℃孵育30 min，Tris-HCl缓冲液洗3次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，Tris-HCl缓冲液洗3次，滴加过氧化酶标记的streptavidin, 37℃孵育30 min，Tris-HCl缓冲液洗3次，DAB染色10 min。最后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。以镜下所见明显的棕黄色颗粒为阳性。每种检测均用Tris-HCl缓冲液代替一抗作阴性对照。
四、细胞生长能力的检测
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用MTT法。分别将细胞浓度为5×104/mL的E-CNE1和CNE1细胞悬液加入96孔培养板，每孔100 μL，每种细胞分2组，每组设12个平行孔，其中一组于37℃、5% CO2培养4 h后加入MTT，另一组于37℃、5%CO2培养48 h后加入MTT，每孔10 μL MTT(5 mg/mL)。加MTT后继续培养4 h，加DMSO，每孔100 μL，静置16 h后用全自动酶标仪测定570 nm、630 nm波长的OD值，并按以下公式[2]：
计算出OD值。公式中OD570-OD630能更准确地反映细胞增殖活性，48 h OD/4 h OD可消除由于组间细胞数计算差异所引起的OD值误差。每种细胞均同时测定含15%血清和无血清培养液培养的生长能力。
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五、细胞凋亡的检测
采用以下2种方法分别检测E-CNE1和CNE1细胞在15%血清及无血清培养下的细胞凋亡。
(一)流式细胞仪检测法 参照文献[5]方法略加修改。贴壁细胞经胰酶消化、收获，用PBS洗2次，调细胞浓度为2×106/mL，分装每管0.3 mL，每管加入碘化丙啶(PI)染液(其中含PI 100 mg/L,RNase 100 mg/L，0.1% Triton X-100，0.1% 醋酸钠)0.7 mL 作用30 min，用流式细胞仪(美国Coulter公司生产的EPLCSXL型)检测。
(二)末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志法(TUNEL) 检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品，碱性磷酸酶底物坚固红及缓冲液为博士德公司出品。收获细胞涂片，晾干后用4%多聚甲醛(PBS配)固定20 min，PBS洗1次，再用0.1% Triton X-100柠檬酸缓冲液冰浴处理2 min。用PBS洗后滴加TUNEL反应液，37℃孵1 h。用PBS洗去反应液后滴加碱性磷酸酶联接的抗荧光素抗体(converter-AP)，37℃孵30 min，PBS洗后滴加碱性磷酸酶底物坚固红溶液，室温反应10～30 min，水洗后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。
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六、统计处理
实验数据用均数±标准差(
±s)表示，用t检验判断均数差异显著性。结 果
一、LMP1表达的检测结果
免疫组化检测结果显示，用EBV感染的CNE1细胞(E-CNE1)的LMP1呈强阳性反应，未感染的CNE1细胞(CNE1)则为阴性，而两种细胞检测中用TBS代替一抗的阴性对照组全为阴性(见图1、2)。
二、EBV感染对鼻咽癌细胞生长的影响
MTT检测结果显示，在15%血清和无血清培养条件下，E-CNE-1的OD值均非常明显高于CNE1细胞系(P<0.01)，表明E-CNE1细胞系的生长能力明显增强(见表1)。
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表1 EB病毒感染对鼻咽癌细胞系生长的影响
Tab 1 The effect of EBV infection on growth of
nasopharyngeal carcinoma cell lines(
±s,n=12) Cell linesOD value
15% serum culture
Serum-free culture
E-CNE1
2.28±0.25*
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2.00±0.18*
CNE1
1.96±0.17
1.76±0.11
*P<0.01,vs CNE1 group
三、bcl-2表达和细胞凋亡的检测结果
免疫组化检测发现E-CNE1和CNE1细胞均有少数细胞的bcl-2呈强阳性反应，阳性率为2%～3%，2种细胞系的阳性率无显著差异(P>0.05)。用流式细胞仪测定细胞DNA含量，E-CNE1和CNE1细胞均未发现亚G1期细胞峰即凋亡峰；用敏感的末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志法检测凋亡细胞，2种细胞也未见染成红色的凋亡细胞。2种方法检测结果显示，E-CNE1和CNE1细胞系在15%血清和无血清培养条件下，其细胞凋亡均处于抑制状态。
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Fig1 EBV-LMP1 in positiveon E-CNE1 cells(40×10)
图1 E-CNE1细胞的胞浆和胞膜LMP1阳性
Fig2 EBV-LMP1 is negative on E-CNE1 cells(41×10)
图2 CNE1细胞的LMP1的阴性
讨 论
EBV能否直接感染和进入鼻咽上皮细胞是人们在鼻咽癌病因发病学研究中长期探索但仍未能阐明的重要课题。我们原先的研究[6]已证实鼻咽癌上皮细胞存在EBV受体，这为EBV直接感染鼻咽上皮细胞提供了理论依据，但EBV能否通过相关受体感染鼻咽上皮细胞尚未得到进一步证实。最近，李岩松等[7]报道，用EBV感染人鼻咽癌细胞系，可从感染后的鼻咽癌细胞中检测到EBV的基因，并发现EBV感染可使该细胞的形态和DNA含量发生明显变化。这一研究初步表明EBV可感染和进入鼻咽癌上皮细胞并能引起细胞的某些生物学特性改变。本实验用EBV直接感染EBV阴性的人鼻咽癌上皮细胞系CNE1，发现EBV感染后，CNE1细胞的EBV-LMP1呈强阳性表达和细胞的增殖能力无论在15%血清或无血清培养条件下均显著增强。进一步表明，EBV可直接感染和进入人鼻咽癌上皮细胞并有促进细胞的生长作用。
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EBV-LMP1是目前唯一被证实在上皮细胞中表达的具有癌基因编码蛋白特性的EBV基因产物。基因转染研究表明，EBV-LMP1在鼻咽癌上皮细胞中表达可促进细胞生长和抑制细胞分化[1，2]。但是，EBV感染鼻咽癌细胞是否有EBV-LMP1表达，目前还不清楚。本实验结果显示，EBV感染CNE1细胞后可明显表达EBV-LMP1，因此可以推测，EBV感染促进鼻咽癌细胞的生长可能也是通过EBV-LMP1表达所致。
EBV感染人B淋巴细胞可通过上调癌基因bcl-2的作用而抑制细胞凋亡已被较多的研究所证实[8，9]。但最近刘克拉等[10]的研究发现，人鼻咽癌组织中的LMP1与bcl-2的表达无相关性，bcl-2的表达也不能抑制鼻咽癌细胞凋亡。我们用EBV-LMP1基因表达质粒转染人鼻咽癌细胞系的研究也证实了这一点[2]。为了解EBV感染和LMP1表达对CNE1细胞的bcl-2表达和细胞凋亡是否有影响，本文用不同方法检测了bcl-2表达和细胞凋亡。结果发现，感染EBV的CNE1细胞系与非感染EBV的CNE1细胞系一样，仅有极少数表达bcl-2，但细胞凋亡均已被明显地抑制，在15%血清和无血清培养条件下均无明显细胞凋亡发生。提示EBV感染和LMP1表达不能上调鼻咽癌细胞的bcl-2表达，鼻咽癌细胞凋亡的抑制不是bcl-2过度表达所致，而可能是癌变过程中的其他因素作用的结果。本研究结果表明，EBV感染和LMP1表达可增强鼻咽癌细胞的生长能力，但对细胞凋亡无明显影响。研究结果为EBV在鼻咽癌发生、发展中的作用提供了重要实验依据。
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[基金项目] 广东省高教厅重点科研基金资助(高9502)
[参 考 文 献]
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[收稿日期]2000-04-18
[修回日期]2000-06-03, http://www.100md.com