钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节
作者：符民桂 陈亚红 李淑莲 庞永政 刘乃奎 唐朝枢 许松
单位：符民桂 陈亚红 李淑莲 庞永政 刘乃奎 唐朝枢(北京大学第一医院心血管病研究所，北京 100034)；许松(中心实验室)
关键词：心肌；细胞；大鼠；磷酸酶类
中国病理生理杂志000704
[摘 要] 目的：观察钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节。方法：建立AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大模型，观察CaN抑制剂对AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响，以及各种因素对心肌细胞CaN酶活性的影响。结果：10、 100、 1000 nmol.L-1的AngⅡ作用12 h分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、 57%(P<0.05)、 228%(P<0.01)。AngⅡ(10 nmol.L-1)刺激心肌细胞2 h内，CaN活性与对照组无明显差异(P<0.05);AngⅡ刺激心肌细胞12 h以上，CaN活性才明显增高(P<0.05)。Losartan(50 μmol.L-1)、H7(50 μmol.L-1)及Fura-2/AM(4 μmol.L-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol.L-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响。AngⅡ(10-7mol/L)刺激的大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入明显高于对照组(P<0.01)，而CaN特异性抑制剂-环孢素A(0.5～5 μg/mL)可以明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入。结论：依赖Ca2+/CaM活化的CaN可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用；CaN的活化可能有赖于胞内Ca2+水平的持续升高，另外，CaN的活性还可能受到蛋白激酶C等信号分子的磷酸化调节。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0588-04
Role and regulation of calcineurin in angiotensin
Ⅱ-stimulated cardiac myocyte hypertrophy of rats
FU Min-gui, CHEN Ya-hong, LI Shu-lian, XU Song,PANG Yong-zheng, LIU Nai-kui, TANG Chao-shu
(Institute of Cardiovascular Diseases, the First Hospital, Beijing University， Beijing 100034， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To study the role and regulation of calcineurin(CaN) in angiotensin II(AngⅡ)-stimulated cardiacmyocyte hypertrophy of rats. METHODS: Using AngⅡ to induce the cultured cardiac myocyte hypertrophy of rats, and investigating the effect of CaN inhibitor on [3H]-leucine incorporation of AngⅡ-stimulated cardiomyocytes and the regulation of various factors on CaN activity in cardiomyocytes.RESULTS: AngⅡ can stimulate the CaN activity in cultured neonatal rat cardiomyocytes in a dose- and time-dependent manner. In cardiac myocytes incubated with 10, 100, 1000 nmol.L-1 of AngⅡ for 12h, the CaN activities increased respectively by 13%,57%(P<0.05) and 228%(P<0.01) compared with that in non-stimulated cardiomyocytes. The CaN activities in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes were significantly inhibited by losartan(50 μmol.L-1), H7(50 μmol.L-1)and Fura-2/AM(4 μmol.L-1),while no effect was observed with PD98059(50 μmol.L-1). The [3H]-leucine incorporation in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes increased by 46%(P<0.01) compared with that in control group, which was dramatically inhibited by cyclosporin A(0.5～5 μg/mL). CONCLUSIONS: Calcineurin, a Ca2+/calmodulin-dependent protein phosphatase, may play an important role in AngⅡ-induced cardiac myocyte hypertrophy. The activation of CaN may dependent on the sustained increases of [Ca2+]i and be regulated by some protein kinases (such as PKC,etc.).
, 百拇医药
[MeSH] Myocardium； Cell; Rats; Phosphatases
钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(calmodulin,CaM)调节的蛋白磷酸酶，广泛分布于脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞等组织细胞中，参与多种细胞功能的调节[1]。新近的研究发现[2]，CaN在心肌肥大的发生发展中起重要作用，它可能是胞内Ca2+信号致肥大反应的转力点。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)具有心肌细胞生长因子样作用，是致心肌肥大的重要体液因素之一，胞内Ca2+浓度升高是AngⅡ致心肌细胞肥大的中心环节。本研究在培养的新生大鼠心肌细胞上，观察AngⅡ对培养心肌细胞CaN活性的影响，以及抑制CaN活性对AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响，以探讨CaN在AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、 动物与主要试剂
1 d龄Wistar乳鼠由本校实验动物中心提供。RPMI 1640干培养基购自Gibco公司，环孢素A(cyclosporin A,CsA)购自Sandoz公司，AngⅡ、CaN、H7、PD98059、CaM、PNPP、Fura-2/AM均为Sigma公司产品，[3H]-亮氨酸(3.7 kBq/mL) 为中国原子能研究所产品，其余试剂均为分析纯级。
二、 细胞培养
按Simpson等[3] 描述的方法培养大鼠原代心肌细胞。用0.125%胰酶分部消化分离大鼠心室肌细胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640中，于37℃、5% CO2-95%空气的条件下培养。在培养的第2 d,加入5'-嗅脱氧尿苷(0.1 mmol.L-1),以抑制非心肌细胞的生长。培养5～6 d, 心肌细胞生长状态良好,开始实验。
, 百拇医药
三、 钙调神经磷酸酶活性测定[4]
以2×105 cells/mL密度的心肌细胞接种于24孔板，培养24 h后改用低浓度血清(2%)培养液培养，12 h后更换含不同药物的培养液(观察药物对AngⅡ作用的影响时，各试剂均预先加入，30 min后再加入10-7 mo1/L的AngⅡ，Fura-2/AM加入培养液30 min后，用无血清培养液洗涤1次，再加含AngⅡ的培养液)。继续培养12～24 h后，收集细胞于Eppendorf管中，加50 μL细胞匀浆液(含50 mmol/L Tris,pH 7.5，0.5 mmol/L DTT，50 μg/mL PMSF，50 μg/mL STI，5 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin)，超声破碎细胞，取上清，应用考马斯亮兰法蛋白定量后进行CaN活性测定。测定方法：底物I液含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.5 mmol/L DDT，0.2 mg/mL BSA，10 mmol/L PNPP，2 mmol/L CaCl2，0.3 μmol/L CaM。底物Ⅱ液含3 mmol/L EGTA，不含CaCl2和CaM。测定时取待测提取液20 μL与底物液380 μL 30℃保温30 min，立即在酶标仪上410 nm读取吸光度，以空白底物液调零,每样本用底物I液测出的值为磷酸酶的总活力；底物II液测出的值是非CaN的其它磷酸酶活力，二者之差即CaN酶活力，结果以比活力(ΔA410nm/mg Pr)表示。
, 百拇医药
四、 [3H]-亮氨酸掺入
实验分4组，AngⅡ组每孔加 AngⅡ 10-7 mol/L；CsA0.5组和CsA5组除AngⅡ外，分别另加CsA0.5和5 μg/mL；对照组不加处理因素。24 h后加入[3H]-亮氨酸3.7 kBq/孔，继续培养24 h ，将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，用 10%高氯酸破碎细胞，PBS冲洗，滤膜烘干后置于5 mL闪烁液的测定瓶内，用LKB液体闪烁仪测定[3H]放射性强度。
五、 细胞活力测定
应用0.5 μg/mL和5μg/mL的 CsA与心肌细胞共孵育24 h，取培养上清作乳酸脱氢酶(LDH)测定；细胞用0.2%台盼兰染色，在显微镜下计算每100个细胞中着色细胞数。
, 百拇医药
六、 统计分析
所有数据均以均数±标准差(
±s)表示,采用多组间方差分析及q检验作统计学处理。
结 果
一、 AngⅡ对大鼠心肌细胞CaN活性的影响
10～1 000 nmol.L-1的AngⅡ可以浓度依赖的方式增加心肌细胞的CaN活性;与对照组相比,10、100、1000 nmol.L-1的AngⅡ分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、57%(P<0.05)、228%(P<0.01)，见图1所示。AngⅡ(10 nmol.L-1)刺激心肌细胞2 h内，CaN活性与对照组无明显差异(P<0.05);刺激心肌细胞12 h，CaN活性轻度高于对照组 (5.10±0.82 vs 4.51±0.43 A410/mg Pr.)；24 h心肌细胞CaN活性明显高于对照组(6.26±1.32 vs 4.51±0.43 A410/mg Pr.，P<0.05)。
, 百拇医药
Fig 1 The curve of dose-effect of AngⅡ on CaN activity in cultured rat cardiac myocytes (±s, n=6)
.P<0.05, . .P<0.01, vs control
图1 AngⅡ对培养大鼠心肌细胞CaN活性影响的量效曲线
二、各种因素对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性的影响
AT1受体阻断剂losartan(50 μmol.L-1)、PKC抑制剂H7(50 μmol.L-1)及胞内Ca2+络合剂Fura-2/AM(4 μmol.L-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol.L-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响,见图2。
, 百拇医药
Fig 2 Effect of various inhibitors on CaN activity in Ang Ⅱ-stimulated cardiac myocytes (±s, n=6)
.P<0.05, . .P<0.01, vs A； #P<0.05, vs control
A: AngⅡ; AL: AngⅡ+losartan; AH7:AngⅡ+H7; APD: AngⅡ+PD98059; AF: AngⅡ+Fura-2/AM
图2 各种因素对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性的影响
三、CsA对AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
, 百拇医药
AngⅡ(10-7 mol/L)刺激的大鼠心肌细胞蛋白质合成速率明显增加，[3H]-亮氨酸掺入高于对照组46%(P<0.01)；CsA可以浓度依赖地抑制AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入，见图3。
Fig 3 Effect of CsA on [3H]-leucine incorporation in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes of rats(±s, n=6)
.P<0.01, vs control； #P<0.01, vs AngⅡ
图3 CsA对AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
, 百拇医药
四、CsA对心肌细胞活力的影响
CsA(0.5～5μg/mL)与心肌细胞孵育24 h,培养上清中的LDH浓度与对照组无明显差异(P>0.05); 台盼兰染色每高倍视野着色细胞数亦与对照组无显著差异(P>0.05)。
讨 论
AngⅡ是调节心肌肥大的重要体液因素之一。已知胞内Ca2+浓度增高、PKC及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活化在AngⅡ刺激心肌细胞肥大的信号传递中起重要作用，但对Ca2+浓度升高引起核内肥大基因活化的下游通路及其与PKC、MAPK途径的关系一直不甚清楚。新近的研究表明，受Ca2+/CaM活化的CaN在心肌肥大的信号传递中起重要作用，活化的CaN可使存在于胞浆内的活化T细胞核因子3(NF-AT3)去磷酸化，使NF-AT3转位入核，调节肥大基因的表达[5，6]。本实验结果显示，AngⅡ(10～1 000 nmol.L-1)可以浓度依赖地刺激心肌细胞CaN活性增加；应用CaN特异性抑制剂-CsA可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加，提示CaN的活化可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用。
, 百拇医药
实验还观察到AngⅡ(10 nmol.L-1)短暂刺激(2 h以内)对心肌细胞CaN活性无明显影响，长期刺激(12 h以上)可使心肌细胞CaN活性明显增高。有报道[7]，AngⅡ短暂刺激对心肌细胞[Ca2+]i基线水平没有影响，仅引起Ca2+振荡的频率及幅度增加；而长期刺激可使[Ca2+]i基线水平明显上抬。而CaN对短暂、高幅度的Ca2+脉冲不敏感，可选择性受持续的、低幅度Ca2+升高活化。本实验结果与这一报道相符。
在体外纯化体系中，CaN可被PKA、PKC及钙调素激酶II(CaMPKⅡ)磷酸化。PKA对CaN的磷酸化可导致其磷酸酶活性增加，而CaMPKⅡ对CaN的磷酸化则可使其活性明显降低。PKC亦可使CaN磷酸化，且与CaMPKⅡ作用于同一位点[8]。在细胞水平上，CaN活性的调节目前仍不清楚。本实验在培养细胞上观察到H7(PKC抑制剂)可阻断AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性增加，而PD98059(MAPK抑制剂)对其无明显影响。是否可解释为PKC与CaMPKⅡ竞争对CaN同一位点磷酸化，PKC受抑制后，CaMPKⅡ对CaN磷酸化加强，使CaN活性减弱；而CaN的活性可能不受MAPK的调节。
, 百拇医药
应用losartan(AT1受体拮抗剂)可阻止AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性的增加，进一步证实CaN的活化是由AT1受体介导的。Fura-2/AM明显抑制心肌细胞CaN活性，也进一步证实CaN活化对胞内Ca2+的依赖性。
[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(39730220)资助
[参 考 文 献]
[1] Guerini D. Calcineurin: not just a simple protein phosphase[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 235:271～275.
[2] Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy[J]. Cell, 1998,93:215～228.
, 百拇医药
[3] Simpson P, McGrath A, Savion S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat culture and its regulation by serum and by catecholamines[J]. Circ Res, 1982,51:787～801.
[4] Pallen CJ ,Wang JH. Calmodulin-stimulated dephosphorylation of p-Nireophenyl phosphate and free phosphotyrosine by calcineurin[J]. J Biol Chem,1983,258:8550～8553.
[5] Sussman MA, Lim HW, Gude N, et al. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition[J]. Science, 1998, 281: 1690～1693.
, http://www.100md.com
[6] Meguro T, Hong C, Asai K, et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure[J]. Circ Res, 1999, 84: 735～740.
[7] Dolmetsch RE, Lewis RS, Goodnow CC, et al. Differential activation of transcription factors induced by Ca2+ response amplitude and duration[J]. Natrue, 1997,386:855～858.
[8] Hashimoto Y, Soderling TR. Regulation of calcineurin by phosphorylation[J]. J Biol Chem, 1989,264(28):16524～16529.
[收稿日期] 1999-01-01
[修回日期] 1999-02-03, 百拇医药
单位：符民桂 陈亚红 李淑莲 庞永政 刘乃奎 唐朝枢(北京大学第一医院心血管病研究所，北京 100034)；许松(中心实验室)
关键词：心肌；细胞；大鼠；磷酸酶类
中国病理生理杂志000704
[摘 要] 目的：观察钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节。方法：建立AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大模型，观察CaN抑制剂对AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响，以及各种因素对心肌细胞CaN酶活性的影响。结果：10、 100、 1000 nmol.L-1的AngⅡ作用12 h分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、 57%(P<0.05)、 228%(P<0.01)。AngⅡ(10 nmol.L-1)刺激心肌细胞2 h内，CaN活性与对照组无明显差异(P<0.05);AngⅡ刺激心肌细胞12 h以上，CaN活性才明显增高(P<0.05)。Losartan(50 μmol.L-1)、H7(50 μmol.L-1)及Fura-2/AM(4 μmol.L-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol.L-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响。AngⅡ(10-7mol/L)刺激的大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入明显高于对照组(P<0.01)，而CaN特异性抑制剂-环孢素A(0.5～5 μg/mL)可以明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入。结论：依赖Ca2+/CaM活化的CaN可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用；CaN的活化可能有赖于胞内Ca2+水平的持续升高，另外，CaN的活性还可能受到蛋白激酶C等信号分子的磷酸化调节。
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[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0588-04
Role and regulation of calcineurin in angiotensin
Ⅱ-stimulated cardiac myocyte hypertrophy of rats
FU Min-gui, CHEN Ya-hong, LI Shu-lian, XU Song,PANG Yong-zheng, LIU Nai-kui, TANG Chao-shu
(Institute of Cardiovascular Diseases, the First Hospital, Beijing University， Beijing 100034， China)
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[Abstract] AIM: To study the role and regulation of calcineurin(CaN) in angiotensin II(AngⅡ)-stimulated cardiacmyocyte hypertrophy of rats. METHODS: Using AngⅡ to induce the cultured cardiac myocyte hypertrophy of rats, and investigating the effect of CaN inhibitor on [3H]-leucine incorporation of AngⅡ-stimulated cardiomyocytes and the regulation of various factors on CaN activity in cardiomyocytes.RESULTS: AngⅡ can stimulate the CaN activity in cultured neonatal rat cardiomyocytes in a dose- and time-dependent manner. In cardiac myocytes incubated with 10, 100, 1000 nmol.L-1 of AngⅡ for 12h, the CaN activities increased respectively by 13%,57%(P<0.05) and 228%(P<0.01) compared with that in non-stimulated cardiomyocytes. The CaN activities in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes were significantly inhibited by losartan(50 μmol.L-1), H7(50 μmol.L-1)and Fura-2/AM(4 μmol.L-1),while no effect was observed with PD98059(50 μmol.L-1). The [3H]-leucine incorporation in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes increased by 46%(P<0.01) compared with that in control group, which was dramatically inhibited by cyclosporin A(0.5～5 μg/mL). CONCLUSIONS: Calcineurin, a Ca2+/calmodulin-dependent protein phosphatase, may play an important role in AngⅡ-induced cardiac myocyte hypertrophy. The activation of CaN may dependent on the sustained increases of [Ca2+]i and be regulated by some protein kinases (such as PKC,etc.).
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[MeSH] Myocardium； Cell; Rats; Phosphatases
钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(calmodulin,CaM)调节的蛋白磷酸酶，广泛分布于脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞等组织细胞中，参与多种细胞功能的调节[1]。新近的研究发现[2]，CaN在心肌肥大的发生发展中起重要作用，它可能是胞内Ca2+信号致肥大反应的转力点。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)具有心肌细胞生长因子样作用，是致心肌肥大的重要体液因素之一，胞内Ca2+浓度升高是AngⅡ致心肌细胞肥大的中心环节。本研究在培养的新生大鼠心肌细胞上，观察AngⅡ对培养心肌细胞CaN活性的影响，以及抑制CaN活性对AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响，以探讨CaN在AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节机制。
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材 料 和 方 法
一、 动物与主要试剂
1 d龄Wistar乳鼠由本校实验动物中心提供。RPMI 1640干培养基购自Gibco公司，环孢素A(cyclosporin A,CsA)购自Sandoz公司，AngⅡ、CaN、H7、PD98059、CaM、PNPP、Fura-2/AM均为Sigma公司产品，[3H]-亮氨酸(3.7 kBq/mL) 为中国原子能研究所产品，其余试剂均为分析纯级。
二、 细胞培养
按Simpson等[3] 描述的方法培养大鼠原代心肌细胞。用0.125%胰酶分部消化分离大鼠心室肌细胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640中，于37℃、5% CO2-95%空气的条件下培养。在培养的第2 d,加入5'-嗅脱氧尿苷(0.1 mmol.L-1),以抑制非心肌细胞的生长。培养5～6 d, 心肌细胞生长状态良好,开始实验。
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三、 钙调神经磷酸酶活性测定[4]
以2×105 cells/mL密度的心肌细胞接种于24孔板，培养24 h后改用低浓度血清(2%)培养液培养，12 h后更换含不同药物的培养液(观察药物对AngⅡ作用的影响时，各试剂均预先加入，30 min后再加入10-7 mo1/L的AngⅡ，Fura-2/AM加入培养液30 min后，用无血清培养液洗涤1次，再加含AngⅡ的培养液)。继续培养12～24 h后，收集细胞于Eppendorf管中，加50 μL细胞匀浆液(含50 mmol/L Tris,pH 7.5，0.5 mmol/L DTT，50 μg/mL PMSF，50 μg/mL STI，5 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin)，超声破碎细胞，取上清，应用考马斯亮兰法蛋白定量后进行CaN活性测定。测定方法：底物I液含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.5 mmol/L DDT，0.2 mg/mL BSA，10 mmol/L PNPP，2 mmol/L CaCl2，0.3 μmol/L CaM。底物Ⅱ液含3 mmol/L EGTA，不含CaCl2和CaM。测定时取待测提取液20 μL与底物液380 μL 30℃保温30 min，立即在酶标仪上410 nm读取吸光度，以空白底物液调零,每样本用底物I液测出的值为磷酸酶的总活力；底物II液测出的值是非CaN的其它磷酸酶活力，二者之差即CaN酶活力，结果以比活力(ΔA410nm/mg Pr)表示。
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四、 [3H]-亮氨酸掺入
实验分4组，AngⅡ组每孔加 AngⅡ 10-7 mol/L；CsA0.5组和CsA5组除AngⅡ外，分别另加CsA0.5和5 μg/mL；对照组不加处理因素。24 h后加入[3H]-亮氨酸3.7 kBq/孔，继续培养24 h ，将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，用 10%高氯酸破碎细胞，PBS冲洗，滤膜烘干后置于5 mL闪烁液的测定瓶内，用LKB液体闪烁仪测定[3H]放射性强度。
五、 细胞活力测定
应用0.5 μg/mL和5μg/mL的 CsA与心肌细胞共孵育24 h，取培养上清作乳酸脱氢酶(LDH)测定；细胞用0.2%台盼兰染色，在显微镜下计算每100个细胞中着色细胞数。
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六、 统计分析
所有数据均以均数±标准差(
±s)表示,采用多组间方差分析及q检验作统计学处理。结 果
一、 AngⅡ对大鼠心肌细胞CaN活性的影响
10～1 000 nmol.L-1的AngⅡ可以浓度依赖的方式增加心肌细胞的CaN活性;与对照组相比,10、100、1000 nmol.L-1的AngⅡ分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、57%(P<0.05)、228%(P<0.01)，见图1所示。AngⅡ(10 nmol.L-1)刺激心肌细胞2 h内，CaN活性与对照组无明显差异(P<0.05);刺激心肌细胞12 h，CaN活性轻度高于对照组 (5.10±0.82 vs 4.51±0.43 A410/mg Pr.)；24 h心肌细胞CaN活性明显高于对照组(6.26±1.32 vs 4.51±0.43 A410/mg Pr.，P<0.05)。
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Fig 1 The curve of dose-effect of AngⅡ on CaN activity in cultured rat cardiac myocytes (
±s, n=6).P<0.05, . .P<0.01, vs control
图1 AngⅡ对培养大鼠心肌细胞CaN活性影响的量效曲线
二、各种因素对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性的影响
AT1受体阻断剂losartan(50 μmol.L-1)、PKC抑制剂H7(50 μmol.L-1)及胞内Ca2+络合剂Fura-2/AM(4 μmol.L-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol.L-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响,见图2。
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Fig 2 Effect of various inhibitors on CaN activity in Ang Ⅱ-stimulated cardiac myocytes (
±s, n=6).P<0.05, . .P<0.01, vs A； #P<0.05, vs control
A: AngⅡ; AL: AngⅡ+losartan; AH7:AngⅡ+H7; APD: AngⅡ+PD98059; AF: AngⅡ+Fura-2/AM
图2 各种因素对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性的影响
三、CsA对AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
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AngⅡ(10-7 mol/L)刺激的大鼠心肌细胞蛋白质合成速率明显增加，[3H]-亮氨酸掺入高于对照组46%(P<0.01)；CsA可以浓度依赖地抑制AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入，见图3。
Fig 3 Effect of CsA on [3H]-leucine incorporation in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes of rats(
±s, n=6).P<0.01, vs control； #P<0.01, vs AngⅡ
图3 CsA对AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
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四、CsA对心肌细胞活力的影响
CsA(0.5～5μg/mL)与心肌细胞孵育24 h,培养上清中的LDH浓度与对照组无明显差异(P>0.05); 台盼兰染色每高倍视野着色细胞数亦与对照组无显著差异(P>0.05)。
讨 论
AngⅡ是调节心肌肥大的重要体液因素之一。已知胞内Ca2+浓度增高、PKC及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活化在AngⅡ刺激心肌细胞肥大的信号传递中起重要作用，但对Ca2+浓度升高引起核内肥大基因活化的下游通路及其与PKC、MAPK途径的关系一直不甚清楚。新近的研究表明，受Ca2+/CaM活化的CaN在心肌肥大的信号传递中起重要作用，活化的CaN可使存在于胞浆内的活化T细胞核因子3(NF-AT3)去磷酸化，使NF-AT3转位入核，调节肥大基因的表达[5，6]。本实验结果显示，AngⅡ(10～1 000 nmol.L-1)可以浓度依赖地刺激心肌细胞CaN活性增加；应用CaN特异性抑制剂-CsA可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加，提示CaN的活化可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用。
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实验还观察到AngⅡ(10 nmol.L-1)短暂刺激(2 h以内)对心肌细胞CaN活性无明显影响，长期刺激(12 h以上)可使心肌细胞CaN活性明显增高。有报道[7]，AngⅡ短暂刺激对心肌细胞[Ca2+]i基线水平没有影响，仅引起Ca2+振荡的频率及幅度增加；而长期刺激可使[Ca2+]i基线水平明显上抬。而CaN对短暂、高幅度的Ca2+脉冲不敏感，可选择性受持续的、低幅度Ca2+升高活化。本实验结果与这一报道相符。
在体外纯化体系中，CaN可被PKA、PKC及钙调素激酶II(CaMPKⅡ)磷酸化。PKA对CaN的磷酸化可导致其磷酸酶活性增加，而CaMPKⅡ对CaN的磷酸化则可使其活性明显降低。PKC亦可使CaN磷酸化，且与CaMPKⅡ作用于同一位点[8]。在细胞水平上，CaN活性的调节目前仍不清楚。本实验在培养细胞上观察到H7(PKC抑制剂)可阻断AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性增加，而PD98059(MAPK抑制剂)对其无明显影响。是否可解释为PKC与CaMPKⅡ竞争对CaN同一位点磷酸化，PKC受抑制后，CaMPKⅡ对CaN磷酸化加强，使CaN活性减弱；而CaN的活性可能不受MAPK的调节。
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应用losartan(AT1受体拮抗剂)可阻止AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性的增加，进一步证实CaN的活化是由AT1受体介导的。Fura-2/AM明显抑制心肌细胞CaN活性，也进一步证实CaN活化对胞内Ca2+的依赖性。
[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(39730220)资助
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-01-01
[修回日期] 1999-02-03, 百拇医药