脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的免疫组织化学研究
作者：王耀明 莫雪安 童萼塘 方瑗
单位：王耀明 莫雪安(广西医科大学第一附属医院神经内科，广西 南宁 530021)；童萼塘 方瑗(同济医科大学附属协和医院神经内科， 湖北 武汉 430030)
关键词：血脑屏障；脑缺血；再灌注；免疫组织化学
中国病理生理杂志000824
[摘 要] 目的：研究脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障(BBB)通透性改变。方法：采用线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型，缺血1 h后再灌注，分别于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、及24 h，采用免疫组织化学SABC法，观察内源性免疫球蛋白G(IgG)在脑组织中的表达。结果：再灌注0 h、3 h时，脑组织中未见IgG的表达。再灌注5 h时，缺血侧大脑半球纹状体有局灶性的IgG表达。再灌注12 h 时，缺血侧纹状体及新皮层可见有广泛的IgG的表达。再灌注24 h时，表达更加明显。结论：缺血1 h再灌注3～5 h时，BBB开始受损开放，通透性增加。纹状体的BBB较新皮层更易受损。再灌注12 h、24 h，外渗的血清蛋白累积增加。
, 百拇医药
[中图分类号] R392.32 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0755-02
[MeSH] Blood-brain barrier; Cerebral ischemia; Reperfusion; Immunohistochemistry
脑水肿是脑缺血后主要的病理变化之一。脑缺血再灌注过程中亦可发生严重的脑水肿。缺血引起的脑水肿包括细胞毒性水肿和血管源性水肿，后者是由于BBB受损，通透性增加，血清蛋白外渗所致。可见，研究BBB通透性对血管源性脑水肿的防治具有重要意义。目前，对脑缺血超早期再灌注后BBB通透性的研究，国内外的报道甚少。我们采用免疫组织化学的方法对大鼠局灶性脑缺血1h再灌注后不同时期的BBB通透性进行研究。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、实验动物分组
健康雄性Wistar 大鼠42只，体重为250～350 g,由同济医科大学实验动物中心提供。随机分为脑缺血1 h再灌注0 h组、3 h组、5 h组、12 h组、24 h组及假手术组，每组7只大鼠。
二、脑缺血再灌注动物模型的复制：参照Nagasawa等[1]的方法并进行改动。大鼠用10%水合氯醛麻醉(35 mg/100 g体重ip)，颈正中切开，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉，结扎ECA近端，结扎CCA，在近CCA与ECA交叉处剪一小口，插入栓线(栓线是4-0尼龙线，其头端5 mm涂有固体石蜡，直径为0.26 mm)，缓慢向ICA插入，插入深度为17～21 mm，在ICA根部结扎。从ICA抽出栓线即可造成再灌注。假手术组只结扎左侧的ICA、ECA，不插栓线。
三、 组织切片的制备
, 百拇医药
分别于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、24 h，再次麻醉大鼠，经升主动脉灌注4%多聚甲醛(用磷酸缓冲液，pH7.4配制)，取脑，于上述固定液内后固定24 h 。常规酒精系列脱水、二甲苯透明、浸蜡和石蜡包埋。切成4 μm厚的石蜡切片。
四、 免疫组织化学染色
以免疫组织化学SABC法对切片标本进行染色。生物素化羊抗大鼠IgG及SABC Kit 均购自武汉Boster生物工程有限公司。生物素化羊抗大鼠IgG使用效价为1∶100，染色步骤按说明书进行，设立替代对照试验。
五、 免疫组织化学染色分级标准
参照Akiguchi等[2]的方法进行分级。0级：未见染色；1 级：神经纤维网可见染色；2级：神经纤维网及1～20个神经细胞或神经胶质细胞胞体有染色(×200)；3级：神经纤维网及多于20个神经细胞或胶质细胞胞体有染色(×200)。对每组大鼠脑片的缺血侧均匀地观察7个视野进行分级评分，取其平均值。
, 百拇医药
六、 数据分析方法
数据以
±s表示，组间均数差异显著性采用t检验判定。
结 果
一、 免疫组织化学染色
假手术组、再灌注0 h组及再灌注3 h组脑组织中未见有IgG的表达。再灌注5 h组缺血侧纹状体可见有局灶性的IgG表达，神经纤维网呈棕褐色染色，神经细胞的胞浆内未见染色。再灌注12 h组和24 h组在缺血侧纹状体及新皮层有广泛的IgG表达，神经纤维网有更加明显的染色，众多的神经细胞和胶质细胞的胞浆内可见颗粒状棕褐色染色。再灌注24 h组比12 h组更加明显。
二、 IgG染色分级评分结果分析
, 百拇医药
再灌注5 h组IgG染色分级评分与再灌注0 h、3 h及假手术组相比具有显著差异(P<0.05)。再灌注12 h组、24 h组与再灌注0 h、3 h及假手术组相比有非常显著差异(P<0.01)。再灌注12 h组、24 h组与再灌注5 h组相比具有非常显著差异(P<0.01)。
表1 IgG染色分级评分
Tab 1 Grading score for IgG (±s, n=42) Group
After the reperfusion
0h
3h
5h
, 百拇医药
12h
24h
Reperfusion
0
0
0.43±0.12△
2.15±1.06△△* *
2.62±1.13△△* *
Sham-operated
0
△ P<0.05，△△ P<0.01，vs 0 h group，3 h group and sham-operated group； * * P<0.01，vs 5 h group讨 论
, 百拇医药
脑缺血再灌注损伤是目前国内外研究的重点课题之一。为此，建立了各种脑缺血再灌注模型。我们曾采用MRI及TTC染色的方法对改进的脑缺血再灌注模型进行了研究，证明了模型复制的可靠性[3]。
脑缺血再灌注后BBB会受到损伤，导致通透性增加。血清蛋白不能通透完整的BBB，如果脑组织中有外渗的血清蛋白，即说明BBB受到破坏，通透性增加。IgG是一种内源性的血清蛋白，通过IgG在脑组织中的免疫组织化学染色可反映BBB的通透性。目前常用来研究BBB通透性的方法有同位素标记的方法、影像学方法(如增强MRI)、酶组织化学的方法等。同位素标记的方法可精确定量的反映BBB的通透性，但存在放射性及价格较贵。影像学方法可在活体进行动态观察BBB的通透性，但较难发现轻微的BBB通透性改变。酶组织化学的方法反映BBB通透性的同时，还能进行组织细胞的形态学观察，但灵敏度不及免疫组织化学的方法。用免疫组织化学的方法评价BBB通透性，不仅可以了解血清蛋白从微血管内外渗的情况，而且能进行形态学观察。可以很好地反映直到动物被处死之前外渗的血清蛋白的累积情况。
, 百拇医药
本结果发现，假手术组、再灌注0 h组及3 h组均未见有IgG表达。而再灌注5 h组，在缺血侧纹状体可见有染色。说明在缺血1 h再灌注3～5 h时，BBB受到破坏，通透性增加，血清蛋白开始从微血管渗出。同时也说明纹状体是再灌注期间BBB首先遭受破坏的区域。Ohtomo等[4]的研究表明，丘脑的外侧是缺血再灌注后BBB最先受到破坏的区域。Albayrak等[5]采用同位素标记的方法对局灶性脑缺血后BBB通透性进行了研究，其结果表明纹状体区的BBB最先受到破坏。这与我们的研究结果是一致的。BBB在这个区域更容易受到破坏的原因还不太清楚。可能是由于纹状体侧支循环比较少，因此抵抗缺血性损伤的能力就比较弱。
我们研究还发现，在再灌注12 h时，整个缺血侧大脑半球可见IgG表达，再灌注24 h时，表达更加明显。这说明外渗的血清蛋白存在着累积增多。同时还发现大量的神经细胞及胶质细胞的胞浆中可见颗粒状的棕褐色染色，这说明缺血性损伤比较严重。
, http://www.100md.com
我们虽然只对IgG的漏出进行了研究，但在缺血性脑水肿时，IgG漏出的分布与其它血清蛋白是一致的[6]。故通过IgG外渗的情况可以反映整个血清蛋白外渗的情况。
可见，通过IgG在微血管外的表达，可以反映BBB的通透性。我们的研究结果表明，在脑缺血1 h再灌注后3～5 h，BBB通透性开始增加。纹状体区的BBB较易受到破坏。
[参 考 文 献]
[1] Nagasawa H,Kogura K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989,20:1037～1043.
[2] Akiguchi I,Tomimoto H,Suenaga T,et al.Blood-brain barrier dysfunction in Binswanger's disease;an immunohistochemical study[J]. Acta Neuropathol,1998,95:78～84.
, 百拇医药
[3] 王耀明，童萼塘，肖学宏.MRI评价改进的大鼠可逆性局灶性脑缺血模型[J]. 卒中与神经疾病，1999,6:171～173.
[4] Ohtomo H,Hatakeyama T,Matsumoto M,et al.Postischemic damage in the gerbil brain after brief carotid occlusion:Correlation of cerebral blood flow and immunohistochemical findings[J].J Cereb Blood Flow Metab,1987,7:S110～S116.
[5] Albayrak S,Zhao Q,Siesjo BK.Effect of transient focal ischemia blood-brain barrier permeability in the rat:correlation to cell injury[J].Acta Neuropathol,1997,94:158～163.
[6] Scmidt K,Szymas J, Hossman K.Immunohistochemical study of glial reaction and serum protein extravasation in relation to neuronal damage in rat hippocampus after ischemia[J]. Neuroscience, 1990, 38: 527～540.
[收稿日期] 1999-11-22 [修回日期] 2000-04-03, 百拇医药
单位：王耀明 莫雪安(广西医科大学第一附属医院神经内科，广西 南宁 530021)；童萼塘 方瑗(同济医科大学附属协和医院神经内科， 湖北 武汉 430030)
关键词：血脑屏障；脑缺血；再灌注；免疫组织化学
中国病理生理杂志000824
[摘 要] 目的：研究脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障(BBB)通透性改变。方法：采用线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型，缺血1 h后再灌注，分别于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、及24 h，采用免疫组织化学SABC法，观察内源性免疫球蛋白G(IgG)在脑组织中的表达。结果：再灌注0 h、3 h时，脑组织中未见IgG的表达。再灌注5 h时，缺血侧大脑半球纹状体有局灶性的IgG表达。再灌注12 h 时，缺血侧纹状体及新皮层可见有广泛的IgG的表达。再灌注24 h时，表达更加明显。结论：缺血1 h再灌注3～5 h时，BBB开始受损开放，通透性增加。纹状体的BBB较新皮层更易受损。再灌注12 h、24 h，外渗的血清蛋白累积增加。
, 百拇医药
[中图分类号] R392.32 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)08-0755-02
[MeSH] Blood-brain barrier; Cerebral ischemia; Reperfusion; Immunohistochemistry
脑水肿是脑缺血后主要的病理变化之一。脑缺血再灌注过程中亦可发生严重的脑水肿。缺血引起的脑水肿包括细胞毒性水肿和血管源性水肿，后者是由于BBB受损，通透性增加，血清蛋白外渗所致。可见，研究BBB通透性对血管源性脑水肿的防治具有重要意义。目前，对脑缺血超早期再灌注后BBB通透性的研究，国内外的报道甚少。我们采用免疫组织化学的方法对大鼠局灶性脑缺血1h再灌注后不同时期的BBB通透性进行研究。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、实验动物分组
健康雄性Wistar 大鼠42只，体重为250～350 g,由同济医科大学实验动物中心提供。随机分为脑缺血1 h再灌注0 h组、3 h组、5 h组、12 h组、24 h组及假手术组，每组7只大鼠。
二、脑缺血再灌注动物模型的复制：参照Nagasawa等[1]的方法并进行改动。大鼠用10%水合氯醛麻醉(35 mg/100 g体重ip)，颈正中切开，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉，结扎ECA近端，结扎CCA，在近CCA与ECA交叉处剪一小口，插入栓线(栓线是4-0尼龙线，其头端5 mm涂有固体石蜡，直径为0.26 mm)，缓慢向ICA插入，插入深度为17～21 mm，在ICA根部结扎。从ICA抽出栓线即可造成再灌注。假手术组只结扎左侧的ICA、ECA，不插栓线。
三、 组织切片的制备
, 百拇医药
分别于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、24 h，再次麻醉大鼠，经升主动脉灌注4%多聚甲醛(用磷酸缓冲液，pH7.4配制)，取脑，于上述固定液内后固定24 h 。常规酒精系列脱水、二甲苯透明、浸蜡和石蜡包埋。切成4 μm厚的石蜡切片。
四、 免疫组织化学染色
以免疫组织化学SABC法对切片标本进行染色。生物素化羊抗大鼠IgG及SABC Kit 均购自武汉Boster生物工程有限公司。生物素化羊抗大鼠IgG使用效价为1∶100，染色步骤按说明书进行，设立替代对照试验。
五、 免疫组织化学染色分级标准
参照Akiguchi等[2]的方法进行分级。0级：未见染色；1 级：神经纤维网可见染色；2级：神经纤维网及1～20个神经细胞或神经胶质细胞胞体有染色(×200)；3级：神经纤维网及多于20个神经细胞或胶质细胞胞体有染色(×200)。对每组大鼠脑片的缺血侧均匀地观察7个视野进行分级评分，取其平均值。
, 百拇医药
六、 数据分析方法
数据以
±s表示，组间均数差异显著性采用t检验判定。结 果
一、 免疫组织化学染色
假手术组、再灌注0 h组及再灌注3 h组脑组织中未见有IgG的表达。再灌注5 h组缺血侧纹状体可见有局灶性的IgG表达，神经纤维网呈棕褐色染色，神经细胞的胞浆内未见染色。再灌注12 h组和24 h组在缺血侧纹状体及新皮层有广泛的IgG表达，神经纤维网有更加明显的染色，众多的神经细胞和胶质细胞的胞浆内可见颗粒状棕褐色染色。再灌注24 h组比12 h组更加明显。
二、 IgG染色分级评分结果分析
, 百拇医药
再灌注5 h组IgG染色分级评分与再灌注0 h、3 h及假手术组相比具有显著差异(P<0.05)。再灌注12 h组、24 h组与再灌注0 h、3 h及假手术组相比有非常显著差异(P<0.01)。再灌注12 h组、24 h组与再灌注5 h组相比具有非常显著差异(P<0.01)。
表1 IgG染色分级评分
Tab 1 Grading score for IgG (
±s, n=42) GroupAfter the reperfusion
0h
3h
5h
, 百拇医药
12h
24h
Reperfusion
0
0
0.43±0.12△
2.15±1.06△△* *
2.62±1.13△△* *
Sham-operated
0
△ P<0.05，△△ P<0.01，vs 0 h group，3 h group and sham-operated group； * * P<0.01，vs 5 h group讨 论
, 百拇医药
脑缺血再灌注损伤是目前国内外研究的重点课题之一。为此，建立了各种脑缺血再灌注模型。我们曾采用MRI及TTC染色的方法对改进的脑缺血再灌注模型进行了研究，证明了模型复制的可靠性[3]。
脑缺血再灌注后BBB会受到损伤，导致通透性增加。血清蛋白不能通透完整的BBB，如果脑组织中有外渗的血清蛋白，即说明BBB受到破坏，通透性增加。IgG是一种内源性的血清蛋白，通过IgG在脑组织中的免疫组织化学染色可反映BBB的通透性。目前常用来研究BBB通透性的方法有同位素标记的方法、影像学方法(如增强MRI)、酶组织化学的方法等。同位素标记的方法可精确定量的反映BBB的通透性，但存在放射性及价格较贵。影像学方法可在活体进行动态观察BBB的通透性，但较难发现轻微的BBB通透性改变。酶组织化学的方法反映BBB通透性的同时，还能进行组织细胞的形态学观察，但灵敏度不及免疫组织化学的方法。用免疫组织化学的方法评价BBB通透性，不仅可以了解血清蛋白从微血管内外渗的情况，而且能进行形态学观察。可以很好地反映直到动物被处死之前外渗的血清蛋白的累积情况。
, 百拇医药
本结果发现，假手术组、再灌注0 h组及3 h组均未见有IgG表达。而再灌注5 h组，在缺血侧纹状体可见有染色。说明在缺血1 h再灌注3～5 h时，BBB受到破坏，通透性增加，血清蛋白开始从微血管渗出。同时也说明纹状体是再灌注期间BBB首先遭受破坏的区域。Ohtomo等[4]的研究表明，丘脑的外侧是缺血再灌注后BBB最先受到破坏的区域。Albayrak等[5]采用同位素标记的方法对局灶性脑缺血后BBB通透性进行了研究，其结果表明纹状体区的BBB最先受到破坏。这与我们的研究结果是一致的。BBB在这个区域更容易受到破坏的原因还不太清楚。可能是由于纹状体侧支循环比较少，因此抵抗缺血性损伤的能力就比较弱。
我们研究还发现，在再灌注12 h时，整个缺血侧大脑半球可见IgG表达，再灌注24 h时，表达更加明显。这说明外渗的血清蛋白存在着累积增多。同时还发现大量的神经细胞及胶质细胞的胞浆中可见颗粒状的棕褐色染色，这说明缺血性损伤比较严重。
, http://www.100md.com
我们虽然只对IgG的漏出进行了研究，但在缺血性脑水肿时，IgG漏出的分布与其它血清蛋白是一致的[6]。故通过IgG外渗的情况可以反映整个血清蛋白外渗的情况。
可见，通过IgG在微血管外的表达，可以反映BBB的通透性。我们的研究结果表明，在脑缺血1 h再灌注后3～5 h，BBB通透性开始增加。纹状体区的BBB较易受到破坏。
[参 考 文 献]
[1] Nagasawa H,Kogura K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989,20:1037～1043.
[2] Akiguchi I,Tomimoto H,Suenaga T,et al.Blood-brain barrier dysfunction in Binswanger's disease;an immunohistochemical study[J]. Acta Neuropathol,1998,95:78～84.
, 百拇医药
[3] 王耀明，童萼塘，肖学宏.MRI评价改进的大鼠可逆性局灶性脑缺血模型[J]. 卒中与神经疾病，1999,6:171～173.
[4] Ohtomo H,Hatakeyama T,Matsumoto M,et al.Postischemic damage in the gerbil brain after brief carotid occlusion:Correlation of cerebral blood flow and immunohistochemical findings[J].J Cereb Blood Flow Metab,1987,7:S110～S116.
[5] Albayrak S,Zhao Q,Siesjo BK.Effect of transient focal ischemia blood-brain barrier permeability in the rat:correlation to cell injury[J].Acta Neuropathol,1997,94:158～163.
[6] Scmidt K,Szymas J, Hossman K.Immunohistochemical study of glial reaction and serum protein extravasation in relation to neuronal damage in rat hippocampus after ischemia[J]. Neuroscience, 1990, 38: 527～540.
[收稿日期] 1999-11-22 [修回日期] 2000-04-03, 百拇医药