糖基化终产物对巨噬细胞产生一氧化氮及其合酶活性的影响
作者：严金川 黄晓明 刘乃丰
单位：严金川(镇江市第四人民医院心内科，江苏 镇江 212001 现在第二军医大学附属长征医院心内科，上海 200003)；黄晓明 刘乃丰(南京铁道医学院，江苏 南京 210009)
关键词：糖基化终产物，高级；巨噬细胞；一氧化氮；白细胞介素-1
中国病理生理杂志000918
[摘 要] 目的：探讨糖基化终产物(AGEs)对巨噬细胞一氧化氮通路的影响及其机制。方法：应用一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)试剂盒测定巨噬细胞产生NO和NOS活性。结果：巨噬细胞产生NO含量及NOS活性随AGEs作用时间延长明显减少，并且随AGEs的浓度、糖化程度加重、葡萄糖修饰浓度增加，巨噬细胞产生NO含量及NOS活性呈减弱趋势，VitE 明显增加巨噬细胞产生NO含量以及NOS活性。结论：AGEs 通过抑制巨噬细胞NOS活性而抑制其产生NO，VitE对巨噬细胞具有保护作用，能减轻AGEs的损害作用，这对糖尿病慢性并发症的防治提供了重要的理论依据。
[中图分类号] Q257 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0839-03
Effect of advanced glycosylation end products on level of nitric oxide
and activity of nitric oxide synthase in cultured macrophages
YAN Jin-chuan
(Department of Cardiology, The Fourth Peoples Hospital of Zhen Jiang， Zhenjiang 212001, China)
HUANG Xiao-min, LIU Nai-feng
(Nanjing Raiway Medical College, Nanjing 210009, China)
[Abstract] AIM:To study the mechanism and effect of advanced glycosylation end products (AGEs) on NO pathway in cultured macrophages.METHODS:The level of NO and NOS activity were measured by NO and NOS kits in cultured macrophages. RESULTS:The results showed that AGEs induced decreases in NO level and NOS activity in a time and dose-related manner in interleukin-1 (IL-1)-stimulated macrophages. VitE can significantly inhibited effects of AGEs on IL-1-stimulated macrophages. CONCLUSION:AGEs can decrease NO production via inhibiting NOS activity in IL-1-stimulated macrophages. VitE can protect the cells from AGEs injury. It is an important theoretical basis for preventing chronic complication in diabetes mellitus.
[MeSH] Advanced glycosylation end products； Macrophages； Nitric oxide； Interleukin-1
糖尿病是临床常见病和多发病，现已发现随着机体衰老糖基化终产物(advanced glycosylation end products, AGEs)在体内不断积聚[1]。糖尿病病人体内这一过程明显加快[2]，体内明显增多的AGEs与糖尿病血管病变的发生和发展密切相关。新近研究发现，AGEs不仅能导致血管功能障碍,如通透性增加,而且能抑制内皮细胞产生一氧化氮(nitric oxide, NO)[3], 一氧化氮依赖性血管扩张反应减弱。本研究中我们探讨AGEs对IL-1诱导巨噬细胞产生NO及其合酶的影响，并观察抗氧化剂Vitamin E的保护作用。
材 料 和 方 法
一、材料
SD大鼠为南京铁道医学院动物房提供，胎牛血清为杭州四季青生物工程公司,RPMI1640,VitE系美国Sigma公司产品,NO和NOS试剂盒由军事医学科学院提供。721分光光度计为上海第三仪器厂产品。
二、 方法
(一) SD大鼠无菌条件下腹腔注射3%可溶性淀粉20 mL，2 d后用含肝素的PBS灌洗腹腔，收集巨噬细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640在37℃、5%CO2培养箱中培养2 h，使之贴壁，然后弃去培养液，用温PBS清洗2～3次，加入RPMI1640在37℃、5%CO2培养箱中培养，调节细胞数为2×105/mL即可用于实验。实验中经台盼蓝染色AGEs对巨噬细胞的活性无明显影响。
(二)糖基化终产物的制备 将葡萄糖用pH7.4 PBS配制成0.5 mol/L溶液，无菌过滤4℃保存。取牛血清白蛋白(BSA)5.0 g/L加入葡萄糖使终浓度为50 mmol/L，在37℃无菌孵育8周，上述孵育液中一同加入终浓度为0.5 mmol/L的EDTA，以减少氧化反应的产生，实验前用pH 7.4 PBS 透析去除未结合的葡萄糖及EDTA。对照组BSA中不含葡萄糖及EDTA，余条件一致。
(三)实验分组 1. 同一浓度AGEs(200 mg/L)作用巨噬细胞不同时间(0 h、 6 h、 12 h、24 h)后,用IL-1刺激24 h。2.不同浓度的AGEs(50、 100、 200 mg/L)作用巨噬细胞12 h后，用IL-1刺激24 h。3. 不同糖化程度AGEs(50 mmol/L的葡萄糖与BSA 分别孵育4、8、12周代表BSA 糖化修饰的轻、中、重)作用巨噬细胞12 h后，用IL-1刺激24 h。4. 不同葡萄糖浓度修饰形成的AGEs(取20、50、80 mmol/L葡萄糖与BSA 糖化8周)作用巨噬细胞12 h后，用IL-1刺激24 h。5. 在2组干预前6h 加入终浓度为100 mmol/L的VitE共同孵育，余条件同2。
(四)NO和NOS的测定 分别测培养液一氧化氮代谢产物亚硝酸盐浓度和巨噬细胞NOS的活性。测定方法按照NO及NOS试剂盒说明书操作。NOS活性测定原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反应形成NO,NO与亲合性物质生成有色化合物，在530 nm 波长下测定吸光度，代表细胞NOS活性。 计算：酶活性定义为每毫克组织蛋白酶中生成1nmol NO为一个活性单位。
(五)统计处理 数据均以
±s表示，采用小样本t检验。结 果
一、 AGEs对IL-1诱导巨噬细胞产生
NO及NOS活性影响的时间效应(如表1)，随AGEs作用时间延长，IL-1诱导巨噬细胞产生NO含量减少，其NOS活性也随之减弱，具有显著差异。
表1 AGEs对IL-1诱导巨噬细胞产生NO-2/NO-3
及NOS活性影响的时间效应
Tab 1 The time effect of AGEs on NO-2/NO-3 level and NOS
activity in IL-1-stimulated macrophage(
±s. n=5)AGEs
0 h
6 h
12 h
24 h
NO-2/NO-3(nmol/L)
24.8±4.6
18.6±3.1*
13.4±3.0*
7.1±2.4* *
NOS(U/mg protein)
45.7±8.7
40.2±6.3*
31.8±6.2*
24.8±4.7* *
* P<0.05, * * P<0.01 vs 0 h.
二、不同浓度AGEs、不同糖化程度和不同葡萄糖修饰的BSA对IL-1诱导巨噬细胞产生NO及NOS活性的影响(如表2)。随浓度增加，糖化程度加重以及葡萄糖浓度的升高，其NO含量减少，NOS活性降低，与对照组相比有显著差异。表2 不同浓度AGEs、不同糖化程度和不同葡萄糖修饰的
BSA对IL-1诱导巨噬细胞产生NO及NOS活性的影响
Tab 2 The effect of different concentrations of AGEs、different
degree glycosylation and different concentrations of glucose
modification on NO-2/NO-3 level and NOS activity in
IL-1-stimulated macrophage (
±s. n=5)NO-2/NO-3(nmol/L)
NOS(U/mg protein)
0(control)
24.8±4.6
45.7±8.7
50
17.9±4.1*
34.6±5.9*
AGEs concentrations
100
11.3±3.0*
21.8±4.7*
(mg/L)
200 6.1±2.1* *
10.4±3.5* *
0(control)
24.8±4.6
45.7±8.7
Glycosylation degree
4
18.2±3.7*
40.1±7.2*
(weeks)
8 12.3±3.9*
28.6±5.8*
12
7.3±2.4* *
13.5±4.3* *
0(control)
24.8±4.6
45.7±8.7
Glucose concentrations
20
16.7±3.5*
38.5±5.6*
(mmol/L)
50 10.4±3.1*
23.6±6.1*
80
3.7±1.2* *
10.8±2.9* *
* P<0.05, * * P<0.01 vs 0 (control).
三、 VitE对AGEs抑制IL-1诱导巨噬细胞产生NO及NOS活性影响
如图所示，预先加入VitE 后，巨噬细胞产生NO含量明显增多(图1)，而NOS活性增强(图2)。
Fig 1 The effect of VitE on NO-2/NO-3 level in macrophages.
* P<0.05 vs AGEs.
±s. n=5.图1 VitE对巨噬细胞产生NO含量的影响
Fig 2 The effect of VitE on NOS activity in macrophages.
±s. n=5.* P<0.05 vs AGEs.
图2 VitE对巨噬细胞产生NOS活性的影响
讨 论
现已发现, 经AGEs修饰的大分子与这类特异性受体作用后, 能改变细胞功能, 如影响内皮细胞通透性及抗血凝特性, 并趋化单核细胞迁移至内皮细胞下层转化为巨噬细胞，分泌细胞因子及粘附分子，如PDGF、TNF、VCAM-1等[4]。AGEs的病理意义极为广泛，不仅与衰老、透析相关病和Alzheimer′s病密切相关。而且，胞浆及核蛋白的糖基化，能促发类似于蛋白质磷酸化的重要调控方式的发生[5]。近年来，有关细胞一氧化氮通路与细胞功能的研究越来越引起人们的关注，内皮细胞衍生的舒张因子NO已作为细胞间信息传递和细胞功能调节的新型信号载体。巨噬细胞受到细胞因子或LPS等刺激后，通过诱导巨噬细胞NOS的基因表达, 催化L-精氨酸产生重要的生物活性物质NO。巨噬细胞释放NO对心血管扩张有着重要的病理生理意义[6]。本研究中我们应用AGEs干预IL-1诱导巨噬细胞产生NO水平的影响，结果发现：AGEs 可明显抑制巨噬细胞产生NO，并呈时间、浓度依赖关系，同时随糖化程度加重、葡萄糖修饰浓度的增加，AGEs的抑制作用更趋明显，进一步研究发现，巨噬细胞NOS活性受到上述条件同样的抑制作用，活性明显降低。因此，AGEs对巨噬细胞产生NO的抑制作用是通过降低其NOS活性而起作用，这与我们以前发现的AGEs对内皮细胞产生NO抑制作用不同，并不通过加速NO的降解途径[7]。
VitE是体内重要的抗氧化剂，大量的证据进一步证实了抗氧化剂具有保护内皮细胞及血管壁功能完整性的作用，并且能抑制单核巨噬细胞表达粘附分子[8]。我们应用VitE预先处理巨噬细胞后，AGEs对巨噬细胞产生NO抑制作用减轻，并且NOS活性明显升高，这就更加证实我们的推断：AGEs通过抑制巨噬细胞NOS活性而起作用。抗氧化剂VitE的保护作用可能是通过抑制氧化产物对NOS活性的影响而起作用，其确切机制有待进一步探讨。
诱导型NO的合成在维持血管壁舒张平衡，防止动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发生方面起重要作用[9]。已有研究发现AS患者心脑血管壁NO的基础和刺激释放量下降。AS斑块中NOS活性及其基因表达量下降[10]，说明NO释放量的下降与AS的发生密切相关。因此，AGEs抑制诱导型NO的合成可能是糖尿病病人易患AS的一个重要原因。
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-06-10 [修回日期]1999-10-18