利钾尿肽与心钠素摩尔比在老年原发性高血压中的作用
作者：曾强 陈练 苑杰 鲁菁 范英鲜 余霞君
单位：曾强(解放军总医院 南楼二科， 北京 100853)；陈练 苑杰 鲁菁(解放军总医院 心内科， 北京 100853)；范英鲜 余霞君(解放军总医院 南楼二科， 北京 100853)
关键词：高血压；心钠素；心肌；老年人
中国病理生理杂志000902
[摘 要] 目的：探讨利钾尿肽(KP)与心钠素摩尔比变化在老年原发性高血压发病中的意义。方法：用放射免疫分析方法测定老年高血压患者血浆、老年自发性高血压大鼠(SHR)血浆及心房和心室组织的KP和心钠素(ANP)含量。结果：高血压患者血浆KP、ANP水平与对照组比较无显著差异。但是，KP与ANP的摩尔比显著低于对照组(P<0.05)，SHR血浆KP、ANP水平显著高于对照组(WKY)(P<0.01和P<0.05)，KP/ANP摩尔比则显著低于WKY(P<0.01)。SHR心房KP含量高于心室(P<0.05)，但与对照组WKY比较无显著差异。结论：KP含量及KP与ANP的比例关系的改变，在老年原发性高血压发病中起着一定的作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R541.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0775-04
Role of the molar ratio of kaliuretic peptide/atrial natriuretic peptide
in elderly essential hypertension
ZENG Qiang,FAN Ying-xian, YU Xia-jun
(Department of Cardio-renal, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
CHENG Lian, YUAN Jie, LU Qiang
, 百拇医药
(Department of Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
[Abstract] AIM: To investigate the role of the molar ratio of kaliuretic peptide/atrial natriuretic peptide in elderly essential hypertension(EH). METHODS: The levels of plasma kaliuretic peptide (KP) and atrial natriuretic peptide (ANP) in 46 elderly patients with essential hypertension (EH) and 11 spontaneuos hypertension rats (SHR) were determined by radioimmunoassay. Meanwhile, the concentation of KP and ANP in myocardium of rats were observed as well. RESULTS: Compared with control group, the plasma levels of KP and ANP in EH group were no significantly different, but the molar ratio of KP/ANP were lowered significantly (P<0.05). The levels of plasma KP and ANP in SHR were significantly higher than those in Wistar-Kyoto rats (WKY)(P<0.01 and P<0.05 respectively). However, the molar ratio of KP/ANP were markedly lower(P<0.01). The concentration of KP in atrium was significantly higher than that in ventricle in SHR(P<0.01). Moreover, there are no significantly different between SHR and SKY in atrium concentration of KP. CONCLUSION: KP and the molar ratio of KP/ANP maybe play an important role in pathogenesis of elderly essential hypertension.
, http://www.100md.com
[MeSH] Hypertension; Atrial natriuretic factor; Myocardium; Aged
利钾尿肽(kaliuretic peptide,KP)是近年发现的心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)源于同一前体的具有20个氨基酸的生物活性多肽[1]。它不仅具有和心钠素一样的利尿、舒张血管、抑制肾素-血管紧张素系统的作用，还具有抑制心肌Na+-K+-ATP酶的作用[2]，最新研究表明，来源于同一前体的不同分子间存在相互调节的作用。本研究的目的在于探讨KP及心钠素前体分子间相互作用在老年原发性高血压发病中的意义。
材 料 和 方 法
一、实验动物分组及取材
(一)分组 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)11只，雄性，200～250 g，18月龄；对照组Wistar-kyoto 大鼠(WKY)，8只，雄性，200～250 g，18月龄；均由北京阜外医院动物中心提供。
, 百拇医药
(二)取材 大鼠用20%鸟拉坦(5 mL/kg， ip)麻醉，10 min用RM-6200型四导生理仪(日本光电)后置于实验台上，分离右侧颈动脉，结扎，行颈动脉插管，稳定约20 min，测得稳定的动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MABP)后立即放血至每mL全血含200 IU抑肽酶和15 μL 10% EDTA抗凝管中，4 ℃， 1 000 g离心10 min，分离血浆，-70℃保存待测KP和ANP。动物放血处死后，迅速沿胸骨正中线剪开胸腔，分离心脏，置于生理盐水中洗净积血，以滤纸吸干水份，称取心重，同时分离左心室称重，计算心重/体重、左室/体重比值。取心房、心室各约100 mg，放入1 mL 1N醋酸中，100℃煮沸10 min，用电动匀浆器3 000 r/min匀浆2 min，1 600 g×20 min离心，取上清，-70℃保存，待测ANP，KP。
二、临床资料
(一)原发性高血压组 46例原发性高血压患者，按1978年世界卫生组织统一规定进行诊断和分期，其中Ⅰ期26例，Ⅱ期20例，男性26例，女性20例，年龄：60～68岁，平均年龄(62.8±2.3)岁。所有病例均详细询问病史并作全面体检，所有病例均行血清K、Na、Cl、Ca、P、Mg、肌酐检查，并留24 h尿检查上述电解质，大部分病人作胸透和心电图检查，部分病人行超声心动图检查。为排除药物影响，所有患者均系从未服过降压药或测定KP、ANP前1周停服各种降压药和利尿剂。
, 百拇医药
(二)对照组 22例，男7例，女15例，年龄60-69岁，平均(61.4±3.1)岁，均系无心血管和肾脏疾病的健康志愿者。
(三)KP、ANP的放免测定 两组成员均于清晨空腹取血，以EDTA和抑肽酶作特殊抗凝，血样处理和KP、ANP测定具体步骤同前大鼠血样测定。
三、实验方法
(一)[125I]-KP的制备 5 μg KP(美国Phoenix Pharm INC)，加入含10 μg iodogen(Sigma)的试管中，再加入37 GBq的Na[125I]，反应4 min，取出反应物即中止反应，将其直接移至反向C18高压液相层析柱上(0.39 cm×30 cm)，用20%-60%乙腈(含0.1%三氟乙酸)梯液洗脱，速率为0.4 mL/min，得到放射比活为64.75 PBq/mol的KP标记物，使用时，用0.1 mol/L，pH 7.4的PBS(内含1g/L BSA， 1 g/L NaN3，1 g/L NaCl，0.1%TritoX-100)(放免缓冲液)稀释成工作浓液。
, 百拇医药
(二)KP的放免分析 取上述留取的大鼠和人的血浆100 mL，加入免抗人KP抗血清100 mL(Phoenix Pharm, INC)，在4℃下孵育过液，再加入100 mL [125I]-KP(15 000 cpm/管)。再于4℃下孵育24 h，加入500 μL PR分离剂(东亚免疫技术研究所)，混匀室温放置15 min，4℃，3 000 r/min离心20 min，取沉淀作γ计数，再根据同时用KP标准品(Phoenix Pharm, INC)配制的标准曲线计算出样品的KP含量，此标准曲线测定范围是36.6-2 345.4 pmol/L，非特异结合<6%，批间、批内变异系数分别是(10.4±2.7)%(n=5)和(6.8±2.0)%(n=10)。KP抗血清具有很强的特异性，与ANP、内皮素、降钙素基因相关肽及 AⅡ均无交叉反应。
(三)ANP的放免分析 血浆样品的ANP含量采用东亚免疫技术研究所提供的心钠素放免药盒，依说明书测定完成。
, 百拇医药
(四)心肌组织的KP、ANP测定 将匀浆上清液复溶后，用pH 7.4，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液5倍以上稀释，以调节pH值和样品浓度，而后采用同与血浆相同的方法测定KP和ANP。
四、统计学处理
结果数据均以平均数±标准差(
±s)表示。两组间比较采用Student's t检验，血压与各因素间采用直线相关分析。
结 果
一、大鼠动脉血压、心系数的比较
SHR大鼠的动脉收缩压和舒张压与WKY大鼠比较均存在显著差异[(25.09±1.90)kPa vs (17.79±3.94) kPa，P<0.01；(15.6±4.60) kPa vs (12.13±1.61) kPa，P<0.05]，同时，两组心系数和左心室重/心重亦存在显著差异(4.62±0.34 vs 3.38±0.36，P<0.01；0.74±0.03 vs 0.62±0.02，P<0.01)。
, 百拇医药
二、各组大鼠血浆KP、ANP含量及摩尔比
由表1可见SHR大鼠KP、ANP水平均显著高于WKY大鼠(分别为P<0.01和P<0.05)。与之相反，KP与ANP的摩尔比则显著低于WKY(P<0.05)。
表1 SHR和WKY大鼠血浆KP、ANP含量及摩尔比的比较
Tab 1 Comparison of plasma KP, ANP and molar ratio between
SHR and WKY (±s) Group
n
KP(pmol/L)
, 百拇医药
ANP(pmol/L)
KP/ANP
WKY
8
305.75±58.35
135.13±41.88
2.45±0.74
SHR
11
438.45±159.43* *
216.45±50.87*
, 百拇医药
1.78±0.51* *
* *P<0.01, * P<0.05 vs WKY.
三、各组大鼠心脏KP及ANP含量
由表2可见，两组大鼠的心房ANP和KP含量均非常显著高于心室含量(P<0.01)、但组间比较，SHR心房ANP含量显著低于WKY组(P<0.05)，其它无差别。表2 各组大鼠心脏KP及ANP含量
Tab 2 Concentration of KP and ANP in heart of rats (±s)
Group
, 百拇医药
n
atrium(pmol/g)
ventricle(pmol/g)
KPANP
KPANP
KPANP
KPANP
WKY
8
29.79±11.91
186.75±97.88
15.45±2.85#
, 百拇医药
1.13±1.19#
SHR
11
24.22±5.04
96.11±83.11*
16.45±3.40#
1.78±0.67#
* P<0.05 vs WKY; # P<0.01 atrium vs ventricle.
四、大鼠血压与各种指标的相关性
, 百拇医药
由表3可见，两组大鼠的收缩压与左心室重/心重均呈显著正相关(r=0.6469和0.6418，P值均<0.05)，而WKY大鼠SBP与KP含量及KP/ANP摩尔比之间呈显著正相关(r=0.8493，P<0.05)。SHR大鼠DBP与KP/ANP摩尔比显著负相关(r=-0.6202，P<0.05)。表3 各组大鼠血压与各种指标的相关性(相关系数r)
Tab 3 Correlation between blood pressure of rats and parameters (correlation coefficient r) Group
n
HW/BW
LVW/HW
KP
, http://www.100md.com ANP
KP/ANP
WKY
8
SBP
0.2903
0.6469*
-0.6604*
0.0309
0.8493*
DBP
0.5195
, http://www.100md.com
0.2401
-0.4495
0.0079
-0.2960
SHR
11
SBP
0.4578
0.6418*
-0.3963
0.2221
0.3352
, 百拇医药
DBP
0.0245
0.4022
-0.2287
0.3712
-0.6202*
*P<0.05; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; LVW/HW: left ventricle weight/heart weight; HW/BW: heart weight/body weight.
五、原发性高血压患者血浆KP、ANP水平及摩尔比
, 百拇医药
由表4可见，高血压组与对照组比较，KP、ANP水平无显著差异，但是KP/ANP摩尔比则低于对照组(P<0.05)，将高血压患者分期比较后，Ⅰ期患者血浆KP、ANP含量与对照组比较无显著差异，而Ⅱ期患者的KP、ANP含量则显著低于对照组(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ期的KP/ANP摩尔比与对照组比较均差异显著(P<0.05；P<0.01)。
表4 原发性高血压患者血浆KP、ANP水平及摩尔比
Tab 4 Plasma KP, ANP levels and molar ratio in patients
with essential hypertension (±s) Group
n
, 百拇医药
KP(pmol/L)
ANP(pmol/L)
KP/ANP
Control
21
207.05±34.59
60.55±36.64
5.72±1.30
EH
46
198.42±54.32
59.59±23.76
, 百拇医药
4.18±2.64*
Grade Ⅰ
26
192.14±34.57
65.41±25.14
4.01±1.45*
Grade Ⅱ
20
160.32±18.48*
50.21±21.57*
3.89±1.57
, 百拇医药
*P<0.05 vs control; EH: essential hypertension.讨 论
KP是同ANP来源于同一前体分子——心钠素前体(proANF)的活性多肽，KP是前体分子水解后位于79～98位氨基酸的片段，而ANP是由99至126位氨基酸所组成的肽链。KP同ANP一样主要在心房合成，合成后贮存在心肌细胞的贮藏颗粒之中，在受到释放刺激因素如血容量增加，心房扩张及钠负荷增加等刺激时，释放入血，分布至全身[4]。
本研究中，原发性高血压患者整体KP、ANP水平与正常对照组比较不存在显著性差异(P>0.05)。对46例高血压进行分期比较后发现，Ⅱ期患者的KP、ANP水平与Ⅰ期患者及正常对照组比较均存在显著差异(P<0.05)。造成这种差别的原因，我们认为，由于KP和ANP在体内的合成部位相同，释放刺激因素亦相似。同时，心钠素氨基端前体肽(其中含KP)在急性心肌梗塞、肾功能不全、肝硬化等患者血浆中的变化趋势同ANP呈现一致性[5]。所以，我们虽然尚未见到有关KP与高血压的报道，但是，以往有关ANP与高血压的研究工作结果，可用于解释高血压患者KP水平的变化，李清朗等[6]的研究表明，高血压患者ANP水平低于正常人，高血压越严重，ANP水平越低，这与本研究结果相似。此结果提示，KP和ANP的绝对或相对不足可能是原发性高血压发病的原因之一。此外，亦有报道在高血压时，ANP水平不是降低而是升高[5]，造成这种差异的原因可能在于患者的左心室是否肥厚。有研究表明无左室肥厚组与左室肥厚组血浆ANP水平存在显著差异(P<0.05)，后者明显高于前者[7]。其机制可能是高血压病伴左室肥厚或血压明显增高时，心房负荷过重，引起心房扩张，从而刺激心房细胞释放KP和ANP。本研究中，由于患者均病变较轻，没有器官损伤，这可能是本实验结果中高血压组特别是Ⅰ期患者血浆KP、ANP水平并不升高的原因。同时，动物实验中，SHR大鼠的心系数、左心室重/心重均比对照组WKY大鼠显著升高(P<0.01)心肌增厚显著，SHR大鼠血浆KP、ANP水平亦均比WKY大鼠显著升高，这一结果也支持了上述假设。
, 百拇医药
近年来有作者发现来源于同一前体分子的不同心血管活性分子间存在着互相协同或相互拮抗的作用，从而提出心血管活性肽分子内调控的概念[3]。我们自己的研究工作亦发现，作为来源于同一前体分子的两个不同片段KP和ANP，虽然均具有降低血压、利尿和排钾的功能，然而，它们对心脏和血压的调节机制不尽相同，甚至相反[2]。本研究中KP/ANP摩尔比在高血压发病中的变化，可能是这种作用的表现形式，其作用机理可能是通过对细胞Ca2+的调节而实现的。
首先，KP具有抑制Na+-K+-ATP酶的作用，使细胞内Na+升高，K+降低，Na+-Ca2+交换降低，Ca2+细胞外流减少[2,8]。细胞内Ca2+ 的升高，使心肌收缩力增强，输出量增加。而ANP则抑制Ca2+内流，研究发现，ANP能抑制去甲肾上腺素，组胺和咖啡因所致的肌浆网释放Ca2+。用平滑肌细胞培养发现，加入10-8 mol/L的血管紧张素可能使Ca2+内流增加大约1倍，而加入心钠素后，Ca2+内流又恢复到原来的水平[9]。
, 百拇医药
由以上几点可以看出，KP和心钠素前体原内不同分子间的相互作用在维持机体正常血压和老年原发性高血压发病中起了一定的作用。
[基金项目] 国家自然科学基金资助课题(批准号39970806)；全军九五医药卫生科研基金资助课题(编号98Q092)
Tel:010-66937685； E-mail:ZQ301@263.net
[参 考 文 献]
[1] David L， Vesely. Atrial natriuretic hormones originating from the N-terminus of the atrial natriuretic factor prohaormane[J]. Clin and Expen Pharm and Phy， 1995， 22:108-117.
, 百拇医药
[2] 曾 强， 王培勇，常英姿，等.心内素前体分子内调控对心肌Na+-K+-ATP酶的作用[J]. 中国应用生理学杂志,1999， 15(2)：115-118.
[3] 汤 健，唐朝枢，陈光慧，等.心血管活性多肽的分子内调控[J]. 科技导报,1996, 10：3-6.
[4] Vesely DL, Norris JS, Walters JM, et al. Atrial natriusetic prohormone peptides 1-30,31-67 and 79-98 vasodilate the aorta[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1987,148:1540-1546.
[5] 曾 强，夏 蕾. 心钠素前体肽研究进展[J].国外医学(心血管疾病分册),1997，24(6)：3-6.
, http://www.100md.com
[6] 李清朗，高秉新，楚卡琳，等.44例高血压病患者血浆心钠素水平的初步观察[J]. 中华心血管病杂志,1985， 13(3):199-202.
[7] 王兆雁，王惠思，崔吉君，等.高血压病左房向量与血浆心钠素水平[J].中华心血管病杂志,1989，17(3)：169-172.
[8] Chiou S and Vesely DL. Kaliuretic peptide:the most potent inhibitor of Na+-K+-ATPase of the atrial natriusetic peptides[J]. Endocrinalogy, 1995，136:2033-2038.
[9] 汤 健，谢翠微.心钠素的心血管作用[M].见：汤 健，谢翠微主编. 心钠素. 第1版. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社， 1989. 110-115.
[收稿日期] 2000-01-19 [修回日期] 2000-04-03, http://www.100md.com
单位：曾强(解放军总医院 南楼二科， 北京 100853)；陈练 苑杰 鲁菁(解放军总医院 心内科， 北京 100853)；范英鲜 余霞君(解放军总医院 南楼二科， 北京 100853)
关键词：高血压；心钠素；心肌；老年人
中国病理生理杂志000902
[摘 要] 目的：探讨利钾尿肽(KP)与心钠素摩尔比变化在老年原发性高血压发病中的意义。方法：用放射免疫分析方法测定老年高血压患者血浆、老年自发性高血压大鼠(SHR)血浆及心房和心室组织的KP和心钠素(ANP)含量。结果：高血压患者血浆KP、ANP水平与对照组比较无显著差异。但是，KP与ANP的摩尔比显著低于对照组(P<0.05)，SHR血浆KP、ANP水平显著高于对照组(WKY)(P<0.01和P<0.05)，KP/ANP摩尔比则显著低于WKY(P<0.01)。SHR心房KP含量高于心室(P<0.05)，但与对照组WKY比较无显著差异。结论：KP含量及KP与ANP的比例关系的改变，在老年原发性高血压发病中起着一定的作用。
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[中图分类号] R541.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0775-04
Role of the molar ratio of kaliuretic peptide/atrial natriuretic peptide
in elderly essential hypertension
ZENG Qiang,FAN Ying-xian, YU Xia-jun
(Department of Cardio-renal, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
CHENG Lian, YUAN Jie, LU Qiang
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(Department of Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
[Abstract] AIM: To investigate the role of the molar ratio of kaliuretic peptide/atrial natriuretic peptide in elderly essential hypertension(EH). METHODS: The levels of plasma kaliuretic peptide (KP) and atrial natriuretic peptide (ANP) in 46 elderly patients with essential hypertension (EH) and 11 spontaneuos hypertension rats (SHR) were determined by radioimmunoassay. Meanwhile, the concentation of KP and ANP in myocardium of rats were observed as well. RESULTS: Compared with control group, the plasma levels of KP and ANP in EH group were no significantly different, but the molar ratio of KP/ANP were lowered significantly (P<0.05). The levels of plasma KP and ANP in SHR were significantly higher than those in Wistar-Kyoto rats (WKY)(P<0.01 and P<0.05 respectively). However, the molar ratio of KP/ANP were markedly lower(P<0.01). The concentration of KP in atrium was significantly higher than that in ventricle in SHR(P<0.01). Moreover, there are no significantly different between SHR and SKY in atrium concentration of KP. CONCLUSION: KP and the molar ratio of KP/ANP maybe play an important role in pathogenesis of elderly essential hypertension.
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[MeSH] Hypertension; Atrial natriuretic factor; Myocardium; Aged
利钾尿肽(kaliuretic peptide,KP)是近年发现的心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)源于同一前体的具有20个氨基酸的生物活性多肽[1]。它不仅具有和心钠素一样的利尿、舒张血管、抑制肾素-血管紧张素系统的作用，还具有抑制心肌Na+-K+-ATP酶的作用[2]，最新研究表明，来源于同一前体的不同分子间存在相互调节的作用。本研究的目的在于探讨KP及心钠素前体分子间相互作用在老年原发性高血压发病中的意义。
材 料 和 方 法
一、实验动物分组及取材
(一)分组 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)11只，雄性，200～250 g，18月龄；对照组Wistar-kyoto 大鼠(WKY)，8只，雄性，200～250 g，18月龄；均由北京阜外医院动物中心提供。
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(二)取材 大鼠用20%鸟拉坦(5 mL/kg， ip)麻醉，10 min用RM-6200型四导生理仪(日本光电)后置于实验台上，分离右侧颈动脉，结扎，行颈动脉插管，稳定约20 min，测得稳定的动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MABP)后立即放血至每mL全血含200 IU抑肽酶和15 μL 10% EDTA抗凝管中，4 ℃， 1 000 g离心10 min，分离血浆，-70℃保存待测KP和ANP。动物放血处死后，迅速沿胸骨正中线剪开胸腔，分离心脏，置于生理盐水中洗净积血，以滤纸吸干水份，称取心重，同时分离左心室称重，计算心重/体重、左室/体重比值。取心房、心室各约100 mg，放入1 mL 1N醋酸中，100℃煮沸10 min，用电动匀浆器3 000 r/min匀浆2 min，1 600 g×20 min离心，取上清，-70℃保存，待测ANP，KP。
二、临床资料
(一)原发性高血压组 46例原发性高血压患者，按1978年世界卫生组织统一规定进行诊断和分期，其中Ⅰ期26例，Ⅱ期20例，男性26例，女性20例，年龄：60～68岁，平均年龄(62.8±2.3)岁。所有病例均详细询问病史并作全面体检，所有病例均行血清K、Na、Cl、Ca、P、Mg、肌酐检查，并留24 h尿检查上述电解质，大部分病人作胸透和心电图检查，部分病人行超声心动图检查。为排除药物影响，所有患者均系从未服过降压药或测定KP、ANP前1周停服各种降压药和利尿剂。
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(二)对照组 22例，男7例，女15例，年龄60-69岁，平均(61.4±3.1)岁，均系无心血管和肾脏疾病的健康志愿者。
(三)KP、ANP的放免测定 两组成员均于清晨空腹取血，以EDTA和抑肽酶作特殊抗凝，血样处理和KP、ANP测定具体步骤同前大鼠血样测定。
三、实验方法
(一)[125I]-KP的制备 5 μg KP(美国Phoenix Pharm INC)，加入含10 μg iodogen(Sigma)的试管中，再加入37 GBq的Na[125I]，反应4 min，取出反应物即中止反应，将其直接移至反向C18高压液相层析柱上(0.39 cm×30 cm)，用20%-60%乙腈(含0.1%三氟乙酸)梯液洗脱，速率为0.4 mL/min，得到放射比活为64.75 PBq/mol的KP标记物，使用时，用0.1 mol/L，pH 7.4的PBS(内含1g/L BSA， 1 g/L NaN3，1 g/L NaCl，0.1%TritoX-100)(放免缓冲液)稀释成工作浓液。
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(二)KP的放免分析 取上述留取的大鼠和人的血浆100 mL，加入免抗人KP抗血清100 mL(Phoenix Pharm, INC)，在4℃下孵育过液，再加入100 mL [125I]-KP(15 000 cpm/管)。再于4℃下孵育24 h，加入500 μL PR分离剂(东亚免疫技术研究所)，混匀室温放置15 min，4℃，3 000 r/min离心20 min，取沉淀作γ计数，再根据同时用KP标准品(Phoenix Pharm, INC)配制的标准曲线计算出样品的KP含量，此标准曲线测定范围是36.6-2 345.4 pmol/L，非特异结合<6%，批间、批内变异系数分别是(10.4±2.7)%(n=5)和(6.8±2.0)%(n=10)。KP抗血清具有很强的特异性，与ANP、内皮素、降钙素基因相关肽及 AⅡ均无交叉反应。
(三)ANP的放免分析 血浆样品的ANP含量采用东亚免疫技术研究所提供的心钠素放免药盒，依说明书测定完成。
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(四)心肌组织的KP、ANP测定 将匀浆上清液复溶后，用pH 7.4，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液5倍以上稀释，以调节pH值和样品浓度，而后采用同与血浆相同的方法测定KP和ANP。
四、统计学处理
结果数据均以平均数±标准差(
±s)表示。两组间比较采用Student's t检验，血压与各因素间采用直线相关分析。结 果
一、大鼠动脉血压、心系数的比较
SHR大鼠的动脉收缩压和舒张压与WKY大鼠比较均存在显著差异[(25.09±1.90)kPa vs (17.79±3.94) kPa，P<0.01；(15.6±4.60) kPa vs (12.13±1.61) kPa，P<0.05]，同时，两组心系数和左心室重/心重亦存在显著差异(4.62±0.34 vs 3.38±0.36，P<0.01；0.74±0.03 vs 0.62±0.02，P<0.01)。
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二、各组大鼠血浆KP、ANP含量及摩尔比
由表1可见SHR大鼠KP、ANP水平均显著高于WKY大鼠(分别为P<0.01和P<0.05)。与之相反，KP与ANP的摩尔比则显著低于WKY(P<0.05)。
表1 SHR和WKY大鼠血浆KP、ANP含量及摩尔比的比较
Tab 1 Comparison of plasma KP, ANP and molar ratio between
SHR and WKY (
±s) Groupn
KP(pmol/L)
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ANP(pmol/L)
KP/ANP
WKY
8
305.75±58.35
135.13±41.88
2.45±0.74
SHR
11
438.45±159.43* *
216.45±50.87*
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1.78±0.51* *
* *P<0.01, * P<0.05 vs WKY.
三、各组大鼠心脏KP及ANP含量
由表2可见，两组大鼠的心房ANP和KP含量均非常显著高于心室含量(P<0.01)、但组间比较，SHR心房ANP含量显著低于WKY组(P<0.05)，其它无差别。表2 各组大鼠心脏KP及ANP含量
Tab 2 Concentration of KP and ANP in heart of rats (
±s)Group
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n
atrium(pmol/g)
ventricle(pmol/g)
KPANP
KPANP
KPANP
KPANP
WKY
8
29.79±11.91
186.75±97.88
15.45±2.85#
, 百拇医药
1.13±1.19#
SHR
11
24.22±5.04
96.11±83.11*
16.45±3.40#
1.78±0.67#
* P<0.05 vs WKY; # P<0.01 atrium vs ventricle.
四、大鼠血压与各种指标的相关性
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由表3可见，两组大鼠的收缩压与左心室重/心重均呈显著正相关(r=0.6469和0.6418，P值均<0.05)，而WKY大鼠SBP与KP含量及KP/ANP摩尔比之间呈显著正相关(r=0.8493，P<0.05)。SHR大鼠DBP与KP/ANP摩尔比显著负相关(r=-0.6202，P<0.05)。表3 各组大鼠血压与各种指标的相关性(相关系数r)
Tab 3 Correlation between blood pressure of rats and parameters (correlation coefficient r) Group
n
HW/BW
LVW/HW
KP
, http://www.100md.com ANP
KP/ANP
WKY
8
SBP
0.2903
0.6469*
-0.6604*
0.0309
0.8493*
DBP
0.5195
, http://www.100md.com
0.2401
-0.4495
0.0079
-0.2960
SHR
11
SBP
0.4578
0.6418*
-0.3963
0.2221
0.3352
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DBP
0.0245
0.4022
-0.2287
0.3712
-0.6202*
*P<0.05; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; LVW/HW: left ventricle weight/heart weight; HW/BW: heart weight/body weight.
五、原发性高血压患者血浆KP、ANP水平及摩尔比
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由表4可见，高血压组与对照组比较，KP、ANP水平无显著差异，但是KP/ANP摩尔比则低于对照组(P<0.05)，将高血压患者分期比较后，Ⅰ期患者血浆KP、ANP含量与对照组比较无显著差异，而Ⅱ期患者的KP、ANP含量则显著低于对照组(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ期的KP/ANP摩尔比与对照组比较均差异显著(P<0.05；P<0.01)。
表4 原发性高血压患者血浆KP、ANP水平及摩尔比
Tab 4 Plasma KP, ANP levels and molar ratio in patients
with essential hypertension (
±s) Groupn
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KP(pmol/L)
ANP(pmol/L)
KP/ANP
Control
21
207.05±34.59
60.55±36.64
5.72±1.30
EH
46
198.42±54.32
59.59±23.76
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4.18±2.64*
Grade Ⅰ
26
192.14±34.57
65.41±25.14
4.01±1.45*
Grade Ⅱ
20
160.32±18.48*
50.21±21.57*
3.89±1.57
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*P<0.05 vs control; EH: essential hypertension.讨 论
KP是同ANP来源于同一前体分子——心钠素前体(proANF)的活性多肽，KP是前体分子水解后位于79～98位氨基酸的片段，而ANP是由99至126位氨基酸所组成的肽链。KP同ANP一样主要在心房合成，合成后贮存在心肌细胞的贮藏颗粒之中，在受到释放刺激因素如血容量增加，心房扩张及钠负荷增加等刺激时，释放入血，分布至全身[4]。
本研究中，原发性高血压患者整体KP、ANP水平与正常对照组比较不存在显著性差异(P>0.05)。对46例高血压进行分期比较后发现，Ⅱ期患者的KP、ANP水平与Ⅰ期患者及正常对照组比较均存在显著差异(P<0.05)。造成这种差别的原因，我们认为，由于KP和ANP在体内的合成部位相同，释放刺激因素亦相似。同时，心钠素氨基端前体肽(其中含KP)在急性心肌梗塞、肾功能不全、肝硬化等患者血浆中的变化趋势同ANP呈现一致性[5]。所以，我们虽然尚未见到有关KP与高血压的报道，但是，以往有关ANP与高血压的研究工作结果，可用于解释高血压患者KP水平的变化，李清朗等[6]的研究表明，高血压患者ANP水平低于正常人，高血压越严重，ANP水平越低，这与本研究结果相似。此结果提示，KP和ANP的绝对或相对不足可能是原发性高血压发病的原因之一。此外，亦有报道在高血压时，ANP水平不是降低而是升高[5]，造成这种差异的原因可能在于患者的左心室是否肥厚。有研究表明无左室肥厚组与左室肥厚组血浆ANP水平存在显著差异(P<0.05)，后者明显高于前者[7]。其机制可能是高血压病伴左室肥厚或血压明显增高时，心房负荷过重，引起心房扩张，从而刺激心房细胞释放KP和ANP。本研究中，由于患者均病变较轻，没有器官损伤，这可能是本实验结果中高血压组特别是Ⅰ期患者血浆KP、ANP水平并不升高的原因。同时，动物实验中，SHR大鼠的心系数、左心室重/心重均比对照组WKY大鼠显著升高(P<0.01)心肌增厚显著，SHR大鼠血浆KP、ANP水平亦均比WKY大鼠显著升高，这一结果也支持了上述假设。
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近年来有作者发现来源于同一前体分子的不同心血管活性分子间存在着互相协同或相互拮抗的作用，从而提出心血管活性肽分子内调控的概念[3]。我们自己的研究工作亦发现，作为来源于同一前体分子的两个不同片段KP和ANP，虽然均具有降低血压、利尿和排钾的功能，然而，它们对心脏和血压的调节机制不尽相同，甚至相反[2]。本研究中KP/ANP摩尔比在高血压发病中的变化，可能是这种作用的表现形式，其作用机理可能是通过对细胞Ca2+的调节而实现的。
首先，KP具有抑制Na+-K+-ATP酶的作用，使细胞内Na+升高，K+降低，Na+-Ca2+交换降低，Ca2+细胞外流减少[2,8]。细胞内Ca2+ 的升高，使心肌收缩力增强，输出量增加。而ANP则抑制Ca2+内流，研究发现，ANP能抑制去甲肾上腺素，组胺和咖啡因所致的肌浆网释放Ca2+。用平滑肌细胞培养发现，加入10-8 mol/L的血管紧张素可能使Ca2+内流增加大约1倍，而加入心钠素后，Ca2+内流又恢复到原来的水平[9]。
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由以上几点可以看出，KP和心钠素前体原内不同分子间的相互作用在维持机体正常血压和老年原发性高血压发病中起了一定的作用。
[基金项目] 国家自然科学基金资助课题(批准号39970806)；全军九五医药卫生科研基金资助课题(编号98Q092)
Tel:010-66937685； E-mail:ZQ301@263.net
[参 考 文 献]
[1] David L， Vesely. Atrial natriuretic hormones originating from the N-terminus of the atrial natriuretic factor prohaormane[J]. Clin and Expen Pharm and Phy， 1995， 22:108-117.
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[2] 曾 强， 王培勇，常英姿，等.心内素前体分子内调控对心肌Na+-K+-ATP酶的作用[J]. 中国应用生理学杂志,1999， 15(2)：115-118.
[3] 汤 健，唐朝枢，陈光慧，等.心血管活性多肽的分子内调控[J]. 科技导报,1996, 10：3-6.
[4] Vesely DL, Norris JS, Walters JM, et al. Atrial natriusetic prohormone peptides 1-30,31-67 and 79-98 vasodilate the aorta[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1987,148:1540-1546.
[5] 曾 强，夏 蕾. 心钠素前体肽研究进展[J].国外医学(心血管疾病分册),1997，24(6)：3-6.
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[6] 李清朗，高秉新，楚卡琳，等.44例高血压病患者血浆心钠素水平的初步观察[J]. 中华心血管病杂志,1985， 13(3):199-202.
[7] 王兆雁，王惠思，崔吉君，等.高血压病左房向量与血浆心钠素水平[J].中华心血管病杂志,1989，17(3)：169-172.
[8] Chiou S and Vesely DL. Kaliuretic peptide:the most potent inhibitor of Na+-K+-ATPase of the atrial natriusetic peptides[J]. Endocrinalogy, 1995，136:2033-2038.
[9] 汤 健，谢翠微.心钠素的心血管作用[M].见：汤 健，谢翠微主编. 心钠素. 第1版. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社， 1989. 110-115.
[收稿日期] 2000-01-19 [修回日期] 2000-04-03, http://www.100md.com