胶质瘤细胞对卡氮芥、威猛联合的敏感性实验研究
作者：商战平 高玲 刘潇 祝世功 朱晓波 赵万
单位：商战平 高玲 刘潇 祝世功(白求恩医科大学病理生理学教研室， 长春 130021)；朱晓波 赵万(白求恩医科大学神经外科， 长春 130021)
关键词：药物疗法，联合；神经胶质瘤
中国病理生理杂志000924
[摘 要]目的：观察卡氮芥(BCNU)、威猛(Vm-26)及尼莫地平(NIM)联合应用对胶质瘤细胞的抑制作用，探讨联合用药剂量与胶质瘤细胞敏感性的关系，为临床提供有效的治疗依据。方法：采用MTT法进行活细胞数测定及[3H]-TdR掺入法观察药物对肿瘤细胞增殖率的影响，比较胶质瘤细胞对BCNU、Vm26及NIM单独使用、联合使用的敏感性。结果：BCNU、Vm-26和NIM联合使用对肿瘤细胞的抑制率可达97.04%，明显高于BCNU加NIM的抑制效果(P<0.01)，也明显高于Vm-26、NIM联合的抑瘤效果(P<0.01)。同时BCNU、Vm-26的浓度降低至单独使用的1/10-1/100。结论：BCNU、Vm-26及NIM联合用药对肿瘤细胞的疗效明显优于单独用药，且具有抑制率高，用药浓度低的特点。
, 百拇医药
[中图分类号] R 739.41 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0854-02
[MeSH] Drng therapy, combination; Glioma
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤之一,术后复发率极高，术后配合化疗是治疗胶质瘤的主要手段，当前临床应用治疗神经胶质瘤的新药主要有卡氮芥(carmustine ，BCNU)、威猛(teniposide，Vm-26)、顺铂(ciplatin, DDP)[1]。尽管Vm-26、BCNU、DDP单独使用对脑胶质瘤有明显临床疗效，但其用药剂量及副作用较大且易产生耐药性[2]，这些化疗药物联合使用配以增敏剂治疗脑胶质瘤，尚缺乏报道。本实验拟观察卡氮芥、威猛加尼莫地平(nimodipine,NIM)联合使用的作用，以及与胶质瘤细胞敏感性的关系，为临床有效治疗胶质瘤提供实验依据。
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材 料 和 方 法
一、胶质瘤细胞培养
采用单层细胞培养法，将大鼠C6脑胶质瘤细胞株置于含10%小牛血清的IMDM培养液中，5 %CO2孵箱37℃培养和传代。每次传代均以0.25%胰酶消化4-5 min后，经Hank's液洗涤2次，以密度为1×109/L 10%小牛血清培养液分瓶培养，传代间隔为72～96 h，倍增时间为48 h。调细胞悬液：C6细胞接种48 h后换液，用0.25%胰酶2～3 mL消化5～6 min，离心冲洗3次，然后用1640培养液调细胞浓度2×108/L。
二、药物的配制
药物工作液的配制：所用化疗药物以PBS配制成工作液，BCNU：125 mg/支(2 mL/支)，加6.3mL PBS，使浓度成为15 000 mg/L；Vm-26：50 mg/支(5 mL/支)，取0.5 mL Vm-26加99.5 mL PBS使浓度成为50 mg/L；DDP：20 mg/瓶，加13.3 mL PBS，使浓度成为1 500.5 mg/L 。 NIM：200 mg/L，取1 mL，加1 mL PBS使浓度成为100 mg/L。实验时分别稀释成以下浓度： 1∶10稀释BCNU 为300 mg/L～0.03 mg/L 5个浓度梯度；稀释Vm-26为1 mg/L～0.0001 mg/L 5个浓度梯度；稀释DDP为30.01 mg/L～0.03001 mg/L 5个浓度梯度。NIM浓度为20 mg/L, 10 mg/L, 1 mg/L, 0.1 mg/L, 0.01 mg/L。
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三、药物敏感性筛选实验
采用MTT法筛选出药物敏感浓度。取灭菌处理的96孔培养板，每孔加细胞悬液20 μL，实验组加不同药物工作液20 μL，两药联合组加各药工作液20 μL，对照组加PBS 20 μL，每个药物浓度重复6个孔， 各孔用含1640的培养液补至200 μL，置37℃，5%CO2孵箱培养72 h。甩去培养液,每孔加50 μL噻唑蓝(MTT)置37℃，5%CO2孵箱中反应4 h后，每孔加二甲亚砜100 μL，室温下振荡10 min，用酶联检测仪读出每孔的吸光度值(λ＝570nm)，反映每孔细胞的生存的程度，直接由微机算出该药对该细胞株的ID50。然后计算细胞抑制率为50%时的药物浓度(半抑制浓度inhibitory concentration 50%,IC50)。 以各药的IC50作为联合用药的基础浓度进行下一步实验。
四、药物对胶质瘤细胞3H-TdR渗入率的影响
, 百拇医药
采用3H-TdR渗入法(3H-TdR incorporation assay)观察卡氮芥、威猛对胶质瘤细胞抑制作用的影响，确定其药物的敏感性。用培养液调整细胞浓度为1×108/L，将细胞悬液种于96孔细胞培养板孔内，每孔加入细胞悬液100 μL及一定浓度的抗肿瘤药物，然后将培养板置37℃，5% CO2孵箱中培养6 h，于最后1 h加入3H-TdR(9.25×108 Bq/L)，培养结束后吸掉上清液，每孔用PBS 洗两遍，加0.25%胰蛋白酶50 μL，使细胞脱离，向培养孔内加入20% FCS的培养液150 μL，终止反应。将细胞收集于49型滤纸上，晾干，放入闪烁瓶中，加闪烁液5 mL，用液体闪烁计数器测定每分钟脉冲数(counts*min-1)，计算抑制率。
抑制率=
(对照组掺入平均脉冲值-实验组掺入平均脉冲值)/(对照组掺入平均脉冲数值)×100%
, 百拇医药
五、统计分析
数据采用
±s表示，组间比较采用t检验。
结 果
一、药物半数抑制浓度筛选
化疗药物筛选实验结果表明，各化疗药物对胶质瘤细胞抑制率达50%时的浓度(IC50)分别为：BCNU浓度为0.3 mg/L,Vm-26浓度为0.001 mg/L,DDP浓度为0.3 001 mg/L。NIM单独使用对胶质瘤细胞抑制作用较小，其最大抑制率仅为10%左右，此时NIM的浓度为10 mg/L，以此作为联合用药的使用浓度进行下一步实验研究。
二、药物对C6细胞抑制率比较
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从表1可看出，尼莫地平与各化疗药物联合(BCNU+NIM、DDP+NIM、VM-26+NIM)对胶质瘤细胞增殖的抑制作用明显高于BCNU，DDP,Vm-26单独用药组(P<0.01)，且BCNU、DDP、Vm-26使用浓度均降至1/10。而BCNU与Vm-26联合加NIM组对胶质瘤细胞抑制率可达97.04%,明显高于单独用药加NIM组(P<0.01)，其中Vm-26的浓度比单独用药组降至1/100。
表1 化疗药物对胶质瘤细胞增殖的抑制率
Tab 1 Inhibitory rate of antineoplastic to glioma
cell proliferation (±s, n=6) Group
Inhibitory rate (%)
, 百拇医药
Control
0
BCUN (0.3 mg/L)
53.45±6.32
Vm-26 (0.01 mg/L)
49.64±6.06
DDP (3.001 mg/L)
48.46±3.25
NIM (10 mg/L)
11.57±1.39
BCNU (0.03 mg/L)
, 百拇医药
+NIM70.25±3.72*
Vm-26 (0.001 mg/L)
+NIM77.65±3.11*
DDP (0.3001 mg/L)
+NIM68.16±4.10*
BCNU (0.03 mg/L)+Vm-26(0.0001 mg/L)+NIM
97.04±8.63*#
*P<0.01 vs BCNU, Vm-26, NIM and DDP respectively;
, 百拇医药
# P<0.01 vs BCNU+NIM, Vm-26+NIM and DDP+NIM respectively.讨 论
手术切除后配合化学药物疗法是目前临床治疗脑胶质瘤主要措施，但大量应用单一化疗药物的毒副作用较大，且易使肿瘤细胞产生耐药性。根据肿瘤的生长规律，代谢特点和药物作用机理，应选择作用于不同细胞增殖周期的药物，包括细胞周期非特异性药物和细胞周期特异性药物中的S期抑制剂和M期抑制剂进行联合化疗。BCNU、Vm-26和DDP是临床治疗神经胶质瘤的新型化疗药物，其中BCNU为非细胞周期依赖性药物，抑制DNA多聚酶,从而抑制DNA及RNA的合成,降低DNA核苷酸转移酶活性。Vm-26是第三代半合成鬼臼毒素, 为一种特异性细胞周期化疗药物，作用于G2和S期，其抗肿瘤作用主要是通过TopoⅡ降解DNA 和抑制胸腺嘧啶转运先于直接抑制DNA合成。DDP是非特异性周期广谱化疗药物，可抑制DNA的合成。从细胞增殖周期分析，Vm-26与BCNU联合应用对控制肿瘤细胞的增殖较为合理。 NIM为一种Ca2+拮抗剂，近年来发现Ca2+拮抗剂与肿瘤化疗药物具有协同作用，并可逆转耐药肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[3,4,5]。但是Vm-26、BCNU和NIM三者联合应用对脑胶质瘤细胞的抑制作用，尚未见研究报道。本实验结果表明：化疗药物BCNU与NIM或Vm-26与NIM联合使用对培养C6胶质瘤细胞的抑制作用均明显高于化疗药单独使用，同时用药浓度比单独用药明显减少。说明NIM具有化疗药物增敏剂作用，可增加培养C6胶质瘤细胞对BCNU及Vm-26的敏感性。而BCNU、Vm-26和NIM三者联合使用的抑瘤作用比单药及两药联合化疗更明显，其中Vm-26用药浓度进一步减小。由此可见，BCNU、Vm-26和NIM三者联合使用可大幅度降低化疗药物浓度，提高胶质瘤细胞对化疗药物敏感性，加强对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Rhee CH, Ruan S, Chen S, et al. Phase Ⅰ evaluation of preirradiation chemotherapy with carmustine and cisplation and accelerated radiation therapy in patients with high grade glioma[J]. Oncol Rep,1999， 6(2):393-401.
[2] Patterson DL, Wiemann MC, Lee TH, et al. Carmustine toxicity presenting as a lobar in filtrate[J].Chest,1993,104(1):315-317.
[3] Bowles AP, Pantazis CG, Wansley W. Use of verapamil to enhance the antiproliferative activity of BCNU in human glioma cells: an in vitro and in vivo study[J]. J Neurosurg, 1990,73(2):248-253.
, 百拇医药
[4] Cassioly J, Paul J, Soukop M, et al. Clinical trails of nimodipine as a potential neuroprotector in cancer patient treated with cisplation[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 1998,41(2):161-166.
[5] 李定国，王绣玲，葛成华,等. 抗癌药物与钙拮抗剂合用对体外人胃癌细胞的影响[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 1998,7(1)：63-66.
[收稿日期] 2000-06-11 [修回日期] 2000-08-11, 百拇医药
单位：商战平 高玲 刘潇 祝世功(白求恩医科大学病理生理学教研室， 长春 130021)；朱晓波 赵万(白求恩医科大学神经外科， 长春 130021)
关键词：药物疗法，联合；神经胶质瘤
中国病理生理杂志000924
[摘 要]目的：观察卡氮芥(BCNU)、威猛(Vm-26)及尼莫地平(NIM)联合应用对胶质瘤细胞的抑制作用，探讨联合用药剂量与胶质瘤细胞敏感性的关系，为临床提供有效的治疗依据。方法：采用MTT法进行活细胞数测定及[3H]-TdR掺入法观察药物对肿瘤细胞增殖率的影响，比较胶质瘤细胞对BCNU、Vm26及NIM单独使用、联合使用的敏感性。结果：BCNU、Vm-26和NIM联合使用对肿瘤细胞的抑制率可达97.04%，明显高于BCNU加NIM的抑制效果(P<0.01)，也明显高于Vm-26、NIM联合的抑瘤效果(P<0.01)。同时BCNU、Vm-26的浓度降低至单独使用的1/10-1/100。结论：BCNU、Vm-26及NIM联合用药对肿瘤细胞的疗效明显优于单独用药，且具有抑制率高，用药浓度低的特点。
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[中图分类号] R 739.41 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0854-02
[MeSH] Drng therapy, combination; Glioma
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤之一,术后复发率极高，术后配合化疗是治疗胶质瘤的主要手段，当前临床应用治疗神经胶质瘤的新药主要有卡氮芥(carmustine ，BCNU)、威猛(teniposide，Vm-26)、顺铂(ciplatin, DDP)[1]。尽管Vm-26、BCNU、DDP单独使用对脑胶质瘤有明显临床疗效，但其用药剂量及副作用较大且易产生耐药性[2]，这些化疗药物联合使用配以增敏剂治疗脑胶质瘤，尚缺乏报道。本实验拟观察卡氮芥、威猛加尼莫地平(nimodipine,NIM)联合使用的作用，以及与胶质瘤细胞敏感性的关系，为临床有效治疗胶质瘤提供实验依据。
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材 料 和 方 法
一、胶质瘤细胞培养
采用单层细胞培养法，将大鼠C6脑胶质瘤细胞株置于含10%小牛血清的IMDM培养液中，5 %CO2孵箱37℃培养和传代。每次传代均以0.25%胰酶消化4-5 min后，经Hank's液洗涤2次，以密度为1×109/L 10%小牛血清培养液分瓶培养，传代间隔为72～96 h，倍增时间为48 h。调细胞悬液：C6细胞接种48 h后换液，用0.25%胰酶2～3 mL消化5～6 min，离心冲洗3次，然后用1640培养液调细胞浓度2×108/L。
二、药物的配制
药物工作液的配制：所用化疗药物以PBS配制成工作液，BCNU：125 mg/支(2 mL/支)，加6.3mL PBS，使浓度成为15 000 mg/L；Vm-26：50 mg/支(5 mL/支)，取0.5 mL Vm-26加99.5 mL PBS使浓度成为50 mg/L；DDP：20 mg/瓶，加13.3 mL PBS，使浓度成为1 500.5 mg/L 。 NIM：200 mg/L，取1 mL，加1 mL PBS使浓度成为100 mg/L。实验时分别稀释成以下浓度： 1∶10稀释BCNU 为300 mg/L～0.03 mg/L 5个浓度梯度；稀释Vm-26为1 mg/L～0.0001 mg/L 5个浓度梯度；稀释DDP为30.01 mg/L～0.03001 mg/L 5个浓度梯度。NIM浓度为20 mg/L, 10 mg/L, 1 mg/L, 0.1 mg/L, 0.01 mg/L。
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三、药物敏感性筛选实验
采用MTT法筛选出药物敏感浓度。取灭菌处理的96孔培养板，每孔加细胞悬液20 μL，实验组加不同药物工作液20 μL，两药联合组加各药工作液20 μL，对照组加PBS 20 μL，每个药物浓度重复6个孔， 各孔用含1640的培养液补至200 μL，置37℃，5%CO2孵箱培养72 h。甩去培养液,每孔加50 μL噻唑蓝(MTT)置37℃，5%CO2孵箱中反应4 h后，每孔加二甲亚砜100 μL，室温下振荡10 min，用酶联检测仪读出每孔的吸光度值(λ＝570nm)，反映每孔细胞的生存的程度，直接由微机算出该药对该细胞株的ID50。然后计算细胞抑制率为50%时的药物浓度(半抑制浓度inhibitory concentration 50%,IC50)。 以各药的IC50作为联合用药的基础浓度进行下一步实验。
四、药物对胶质瘤细胞3H-TdR渗入率的影响
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采用3H-TdR渗入法(3H-TdR incorporation assay)观察卡氮芥、威猛对胶质瘤细胞抑制作用的影响，确定其药物的敏感性。用培养液调整细胞浓度为1×108/L，将细胞悬液种于96孔细胞培养板孔内，每孔加入细胞悬液100 μL及一定浓度的抗肿瘤药物，然后将培养板置37℃，5% CO2孵箱中培养6 h，于最后1 h加入3H-TdR(9.25×108 Bq/L)，培养结束后吸掉上清液，每孔用PBS 洗两遍，加0.25%胰蛋白酶50 μL，使细胞脱离，向培养孔内加入20% FCS的培养液150 μL，终止反应。将细胞收集于49型滤纸上，晾干，放入闪烁瓶中，加闪烁液5 mL，用液体闪烁计数器测定每分钟脉冲数(counts*min-1)，计算抑制率。
抑制率=
(对照组掺入平均脉冲值-实验组掺入平均脉冲值)/(对照组掺入平均脉冲数值)×100%
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五、统计分析
数据采用
±s表示，组间比较采用t检验。结 果
一、药物半数抑制浓度筛选
化疗药物筛选实验结果表明，各化疗药物对胶质瘤细胞抑制率达50%时的浓度(IC50)分别为：BCNU浓度为0.3 mg/L,Vm-26浓度为0.001 mg/L,DDP浓度为0.3 001 mg/L。NIM单独使用对胶质瘤细胞抑制作用较小，其最大抑制率仅为10%左右，此时NIM的浓度为10 mg/L，以此作为联合用药的使用浓度进行下一步实验研究。
二、药物对C6细胞抑制率比较
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从表1可看出，尼莫地平与各化疗药物联合(BCNU+NIM、DDP+NIM、VM-26+NIM)对胶质瘤细胞增殖的抑制作用明显高于BCNU，DDP,Vm-26单独用药组(P<0.01)，且BCNU、DDP、Vm-26使用浓度均降至1/10。而BCNU与Vm-26联合加NIM组对胶质瘤细胞抑制率可达97.04%,明显高于单独用药加NIM组(P<0.01)，其中Vm-26的浓度比单独用药组降至1/100。
表1 化疗药物对胶质瘤细胞增殖的抑制率
Tab 1 Inhibitory rate of antineoplastic to glioma
cell proliferation (
±s, n=6) GroupInhibitory rate (%)
, 百拇医药
Control
0
BCUN (0.3 mg/L)
53.45±6.32
Vm-26 (0.01 mg/L)
49.64±6.06
DDP (3.001 mg/L)
48.46±3.25
NIM (10 mg/L)
11.57±1.39
BCNU (0.03 mg/L)
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+NIM70.25±3.72*
Vm-26 (0.001 mg/L)
+NIM77.65±3.11*
DDP (0.3001 mg/L)
+NIM68.16±4.10*
BCNU (0.03 mg/L)+Vm-26(0.0001 mg/L)+NIM
97.04±8.63*#
*P<0.01 vs BCNU, Vm-26, NIM and DDP respectively;
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# P<0.01 vs BCNU+NIM, Vm-26+NIM and DDP+NIM respectively.讨 论
手术切除后配合化学药物疗法是目前临床治疗脑胶质瘤主要措施，但大量应用单一化疗药物的毒副作用较大，且易使肿瘤细胞产生耐药性。根据肿瘤的生长规律，代谢特点和药物作用机理，应选择作用于不同细胞增殖周期的药物，包括细胞周期非特异性药物和细胞周期特异性药物中的S期抑制剂和M期抑制剂进行联合化疗。BCNU、Vm-26和DDP是临床治疗神经胶质瘤的新型化疗药物，其中BCNU为非细胞周期依赖性药物，抑制DNA多聚酶,从而抑制DNA及RNA的合成,降低DNA核苷酸转移酶活性。Vm-26是第三代半合成鬼臼毒素, 为一种特异性细胞周期化疗药物，作用于G2和S期，其抗肿瘤作用主要是通过TopoⅡ降解DNA 和抑制胸腺嘧啶转运先于直接抑制DNA合成。DDP是非特异性周期广谱化疗药物，可抑制DNA的合成。从细胞增殖周期分析，Vm-26与BCNU联合应用对控制肿瘤细胞的增殖较为合理。 NIM为一种Ca2+拮抗剂，近年来发现Ca2+拮抗剂与肿瘤化疗药物具有协同作用，并可逆转耐药肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[3,4,5]。但是Vm-26、BCNU和NIM三者联合应用对脑胶质瘤细胞的抑制作用，尚未见研究报道。本实验结果表明：化疗药物BCNU与NIM或Vm-26与NIM联合使用对培养C6胶质瘤细胞的抑制作用均明显高于化疗药单独使用，同时用药浓度比单独用药明显减少。说明NIM具有化疗药物增敏剂作用，可增加培养C6胶质瘤细胞对BCNU及Vm-26的敏感性。而BCNU、Vm-26和NIM三者联合使用的抑瘤作用比单药及两药联合化疗更明显，其中Vm-26用药浓度进一步减小。由此可见，BCNU、Vm-26和NIM三者联合使用可大幅度降低化疗药物浓度，提高胶质瘤细胞对化疗药物敏感性，加强对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。
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[参 考 文 献]
[1] Rhee CH, Ruan S, Chen S, et al. Phase Ⅰ evaluation of preirradiation chemotherapy with carmustine and cisplation and accelerated radiation therapy in patients with high grade glioma[J]. Oncol Rep,1999， 6(2):393-401.
[2] Patterson DL, Wiemann MC, Lee TH, et al. Carmustine toxicity presenting as a lobar in filtrate[J].Chest,1993,104(1):315-317.
[3] Bowles AP, Pantazis CG, Wansley W. Use of verapamil to enhance the antiproliferative activity of BCNU in human glioma cells: an in vitro and in vivo study[J]. J Neurosurg, 1990,73(2):248-253.
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[4] Cassioly J, Paul J, Soukop M, et al. Clinical trails of nimodipine as a potential neuroprotector in cancer patient treated with cisplation[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 1998,41(2):161-166.
[5] 李定国，王绣玲，葛成华,等. 抗癌药物与钙拮抗剂合用对体外人胃癌细胞的影响[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 1998,7(1)：63-66.
[收稿日期] 2000-06-11 [修回日期] 2000-08-11, 百拇医药