甲基硝基亚硝胍激活细胞表面受体及MAPK信号转导通路
作者：孙雪敏 余应年
单位：浙江大学医学院病理生理教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010170
目的：应用本实验室建立的短寿DNA损伤剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)引起非洲绿猴肾Vero细胞基因组DNA不稳定的应激体系模型，以诱导细胞发生非定标性突变的同样条件观察细胞表面受体和细胞内丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的激活状况，以探索导致非定标性突变形成的细胞信号发源。方法：常规培养的vero细胞以0.2 μmol/L MNNG处理不同时间，以二甲基亚砜(DMSO)为MNNG的溶剂对照。采用间接免疫荧光法标记细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)以及白介素-1受体(IL-1R)，用激光共聚焦显微镜观察受体聚集(结构性激活)状况；采用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法观察MAPK通路中p38MAPK及其上游激酶MKK3/MKK6、JNK/SAPK的上游激酶SEK1/MKK4的磷酸化(激活状态)与非磷酸化激酶的比例(P/N比值)。结果：在MNNG处理15、30和60 min后，均可见到EGFR和两种FNFR (α、β)的聚集现象，其中以EGFR的聚集最为明显；p38MAPK及其上游激酶MKK3/MKK6的P/N比值在MNNG处理2.5 h结束后3 h明显增高(分别为2.056和1.699)，JNK/SAPK的上游激酶SEK1/MKK4的P/N比值有所增高(1.373)。讨论：在对突变现象的研究中，已有大量事实表明突变的形成可能存在非DNA损伤起源的诱发机制，如最近报道的以α离子定位辐射胞浆可导致DNA发生突变。以紫外线进行的实验也证实细胞在接触紫外线1～5 min即可出现位于膜受体的聚集和活化，Src家族酪氨酸酸激酶活性增高，甚至在去核细胞中仍然有JNK和转录因子NF-κB的激活。我们的研究结果表明，化学性DNA损伤剂MNNG也可在短时间内引起细胞膜受体的结构性激活。已知EGFR和TNFR激活后可通过激活下游信号分子分别激活细胞内的生长增殖信号通路和应激信号通路，其中包括MAPK中的JNK和p38MAPK通路。本实验室前已报道MNNG引起JNK/SAPK磷酸化程度和激酶活性增高，本文研究又发现同样条件下其上游激酶SEK1/MKK4磷酸化程度、p38MAPK及其上游激酶MKK3/MKK6的磷酸化程度增高，证明MNNG可导致细胞JNK/SAPK和p38MAPK通路的激活。细胞膜受体聚集与上述通路激活的关系以及与非定标性突变形成的关系正在进一步研究中。
国家自然科学基金(No. 39670641)； 浙江省自然科学基金资助, 百拇医药
单位：浙江大学医学院病理生理教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010170
目的：应用本实验室建立的短寿DNA损伤剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)引起非洲绿猴肾Vero细胞基因组DNA不稳定的应激体系模型，以诱导细胞发生非定标性突变的同样条件观察细胞表面受体和细胞内丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的激活状况，以探索导致非定标性突变形成的细胞信号发源。方法：常规培养的vero细胞以0.2 μmol/L MNNG处理不同时间，以二甲基亚砜(DMSO)为MNNG的溶剂对照。采用间接免疫荧光法标记细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)以及白介素-1受体(IL-1R)，用激光共聚焦显微镜观察受体聚集(结构性激活)状况；采用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法观察MAPK通路中p38MAPK及其上游激酶MKK3/MKK6、JNK/SAPK的上游激酶SEK1/MKK4的磷酸化(激活状态)与非磷酸化激酶的比例(P/N比值)。结果：在MNNG处理15、30和60 min后，均可见到EGFR和两种FNFR (α、β)的聚集现象，其中以EGFR的聚集最为明显；p38MAPK及其上游激酶MKK3/MKK6的P/N比值在MNNG处理2.5 h结束后3 h明显增高(分别为2.056和1.699)，JNK/SAPK的上游激酶SEK1/MKK4的P/N比值有所增高(1.373)。讨论：在对突变现象的研究中，已有大量事实表明突变的形成可能存在非DNA损伤起源的诱发机制，如最近报道的以α离子定位辐射胞浆可导致DNA发生突变。以紫外线进行的实验也证实细胞在接触紫外线1～5 min即可出现位于膜受体的聚集和活化，Src家族酪氨酸酸激酶活性增高，甚至在去核细胞中仍然有JNK和转录因子NF-κB的激活。我们的研究结果表明，化学性DNA损伤剂MNNG也可在短时间内引起细胞膜受体的结构性激活。已知EGFR和TNFR激活后可通过激活下游信号分子分别激活细胞内的生长增殖信号通路和应激信号通路，其中包括MAPK中的JNK和p38MAPK通路。本实验室前已报道MNNG引起JNK/SAPK磷酸化程度和激酶活性增高，本文研究又发现同样条件下其上游激酶SEK1/MKK4磷酸化程度、p38MAPK及其上游激酶MKK3/MKK6的磷酸化程度增高，证明MNNG可导致细胞JNK/SAPK和p38MAPK通路的激活。细胞膜受体聚集与上述通路激活的关系以及与非定标性突变形成的关系正在进一步研究中。
国家自然科学基金(No. 39670641)； 浙江省自然科学基金资助, 百拇医药