血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖的影响
作者：张玉珍 高平进 朱鼎良 王兴宇 张宗梁
单位：张玉珍 高平进 朱鼎良(上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)；王兴宇 张宗梁(中国科学院上海细胞研究所)
关键词：
中国病理生理杂志0010137
目的：血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖，血管壁细胞外间质组成改变导致的血管重构，在高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等许多心血管疾病的发病中起重要作用，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统的主要因子，显著增加VSMC的增殖和肥大，但确切分子机制尚未完全明确，有报导提示与丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)有关，本研究对此作进一步研究。方法：用贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMC，实验选用第4～10代。[3H]-胸腺嘧啶掺入法测定VSMC DNA合成，逆转录-PCR法测定c-fos表达，p42和p44磷酸化抗体蛋白免疫印迹法测定MAPK，细胞免疫组织化学法观察MAPK活化和转位入细胞核变化。结果：1. AngⅡ(10-6～10-8 mol/L)剂量依赖增加VSMC[3H]-胸腺嘧啶掺入，即增加VSMC DNA合成，导致细胞增殖，MAPK激酶的特异抑制剂PD98059显著抑制VSMC[3H]-胸腺嘧啶掺入，且在1～50 μmol/L范围内呈明显的剂量依赖性，而溶解PD98059的二甲亚砜无明显作用(见表1)。2. p42和p44磷酸化MAPK抗体蛋白免疫印迹结果显示10-6 AngⅡ显著激活MAPK，峰值在5 min，30 min至1 h恢复至低值(n=3)。PD98059 1～50 μmol/L剂量依赖抑制AngⅡ活化MAPK(n=2)。3.细胞免疫组织化学结果显示10-6AngⅡ刺激静止48 h VSMC后MAPK 5 min就出现在细胞浆中，30 min进入细胞核，1 h细胞核MAPK染色进一步加强，3 h恢复(n=3)，PD98059 50 μmol/L显著抑制AngⅡ激活MAPK及其转位入核。4. 10-6 AngⅡ明显增加VSMC c-fos表达，逆转录PCR β-actin电泳条带对照组和AngⅡ刺激组无明显差别，c-fos电泳条带AngⅡ刺激组明显高于对照组，c-fos与β-actin电泳条带单位面积密度比值AngⅡ刺激组和对照组分别是0.65±0.06和0.28±0.08， P<0.01(n=3)，预先用PD98059 50 μmol/L明显抑制c-fos mRNA表达，c-fos与β-actin电泳条带单位面积密度比值AngⅡ组和对照组分别是0.32和0.30(n=1)。结论：本实验证实AngⅡ可能通过活化VSMC MAPK，转位入细胞核，增加c-fos表达而导致VSMC的增殖，这可能是AngⅡ导致高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄血管损伤的一个重要原因。
表1 AngⅡ刺激VSMC [3H]-TdR掺入和PD98059的抑制作用(n=4) 组别
对照
10%血清
10-6AngⅡ
AngⅡ+PD98059
二甲亚砜
1 μmol/L
10 μmol/L
50 μmol/L
CPM数
905±195
8 048±1 008△△
2 047±414△△
1 866±357
1427±290*
1 011±118**
2 082±426
△△ P<0.01， 与对照组比;*P<0.05, * *P<0.01, 与 AngⅡ组比, 百拇医药
单位：张玉珍 高平进 朱鼎良(上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)；王兴宇 张宗梁(中国科学院上海细胞研究所)
关键词：
中国病理生理杂志0010137
目的：血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖，血管壁细胞外间质组成改变导致的血管重构，在高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等许多心血管疾病的发病中起重要作用，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统的主要因子，显著增加VSMC的增殖和肥大，但确切分子机制尚未完全明确，有报导提示与丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)有关，本研究对此作进一步研究。方法：用贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMC，实验选用第4～10代。[3H]-胸腺嘧啶掺入法测定VSMC DNA合成，逆转录-PCR法测定c-fos表达，p42和p44磷酸化抗体蛋白免疫印迹法测定MAPK，细胞免疫组织化学法观察MAPK活化和转位入细胞核变化。结果：1. AngⅡ(10-6～10-8 mol/L)剂量依赖增加VSMC[3H]-胸腺嘧啶掺入，即增加VSMC DNA合成，导致细胞增殖，MAPK激酶的特异抑制剂PD98059显著抑制VSMC[3H]-胸腺嘧啶掺入，且在1～50 μmol/L范围内呈明显的剂量依赖性，而溶解PD98059的二甲亚砜无明显作用(见表1)。2. p42和p44磷酸化MAPK抗体蛋白免疫印迹结果显示10-6 AngⅡ显著激活MAPK，峰值在5 min，30 min至1 h恢复至低值(n=3)。PD98059 1～50 μmol/L剂量依赖抑制AngⅡ活化MAPK(n=2)。3.细胞免疫组织化学结果显示10-6AngⅡ刺激静止48 h VSMC后MAPK 5 min就出现在细胞浆中，30 min进入细胞核，1 h细胞核MAPK染色进一步加强，3 h恢复(n=3)，PD98059 50 μmol/L显著抑制AngⅡ激活MAPK及其转位入核。4. 10-6 AngⅡ明显增加VSMC c-fos表达，逆转录PCR β-actin电泳条带对照组和AngⅡ刺激组无明显差别，c-fos电泳条带AngⅡ刺激组明显高于对照组，c-fos与β-actin电泳条带单位面积密度比值AngⅡ刺激组和对照组分别是0.65±0.06和0.28±0.08， P<0.01(n=3)，预先用PD98059 50 μmol/L明显抑制c-fos mRNA表达，c-fos与β-actin电泳条带单位面积密度比值AngⅡ组和对照组分别是0.32和0.30(n=1)。结论：本实验证实AngⅡ可能通过活化VSMC MAPK，转位入细胞核，增加c-fos表达而导致VSMC的增殖，这可能是AngⅡ导致高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄血管损伤的一个重要原因。
表1 AngⅡ刺激VSMC [3H]-TdR掺入和PD98059的抑制作用(n=4) 组别
对照
10%血清
10-6AngⅡ
AngⅡ+PD98059
二甲亚砜
1 μmol/L
10 μmol/L
50 μmol/L
CPM数
905±195
8 048±1 008△△
2 047±414△△
1 866±357
1427±290*
1 011±118**
2 082±426
△△ P<0.01， 与对照组比;*P<0.05, * *P<0.01, 与 AngⅡ组比, 百拇医药