多功能分子图谱处理系统的研制
作者：李联胜 何水淋 施文祥
单位：李联胜(桂林医学院 (广西，桂林，541001))；何水淋(桂林医学院 (广西，桂林，541001))；施文祥(桂林医学院 (广西，桂林，541001)
关键词：比尔定律；光密度；电泳图谱
中国医疗器械杂志000205 提 要：介绍多功能分子图谱处理系统原理，结构，性能。
分类号：Q337 文献标识码：A
文章编号：1000-6974(2000)02-0082-04
The Development of a Multifunctional Molecular Electrophoretograms Processing System
, 百拇医药
LI Lian-sheng He Shui-lin Shi Wen-xiang
(Guilin Hospital)
Abstract：This paper presents to you the principles,composition and features of the multifunctional molecular electrophoretograms processing system.
Keywords：Bill daw;Eptical Density;Electrophoretograms▲
由于分子生物学技术迅猛发展，科技工作者迫切需要性能优良、操作简便的专用仪器。本课题是利用现代电子和计算机技术实现大分子电泳图谱取样、测试和微机分析。克服传统生物大分子电泳区带定量程序不能保存原有的电泳图谱、操作繁琐不仅增加工作量，而且检测周期长，效率低、检出误差大、使用胶片拍照操作繁复和难于控制感光条件等缺点。
, 百拇医药
1 原理
1.1 原理：根据比尔定律：在一定条件下标本的光密度值与其中物质的含量成正比，即标本上每一点光密度值A正比于该点物质密度，因此标本上的每个区带光密度值的积分值即正比于该区带中的物质含量，即：
∫A=K×M
其中：∫A为光密度值的积分，M为物质含量，K为比例常数，由制备和染色等条件决定。将电泳图谱区带通过透光扫描仪或图谱摄录仪摄入计算机形成可供分析的图像。自编“PROIMAGE图谱分析软件”测量各整个电泳区带密度/亮度值的体积积分值。根据区带密度/亮度与其含量成正比的定量关系，通过建立标准系列，可推算出待测区带中待测物的含量。
1.2 与光密度扫描仪测量方式的区别：
光密度扫描仪对条带状的电泳样品测量时是让光束在标本上移动扫描标本各区带某一截面密度积分值。形成以区带物质含量为横坐标，某一截面密度积分值为纵坐标的光密度曲线。
, 百拇医药
本分析系统对条带状的电泳样品测量时是让光束通过标本各区带。形成以区带物质含量为横坐标，整个区带密度体积积分值为纵坐标的光密度曲线。
由于扫描区带哪一截面计算密度积分值，决定操作员的经验和区带电泳的均匀程度等因而测量误差较大；本系统是测量整个区带密度体积积分值，测不受上述条件影响，因而测量误差较小。
2 系统配置和主要试剂
1 多功能分子图谱处理系统：由586计算机、高分辨率透光扫描仪、图谱摄录仪、静态图像采集卡、ESPON PHOTO—700打印机、等组成，见图1。PROIMAGE分析软件：主要采用VISUAL BASIC和VISUAL C语言。软件流程图见图2。
图1
, http://www.100md.com
图2
2 主要试剂：牛血清白蛋白(Server)、考马斯亮兰(Frank进口分装)、淋球菌PCR试剂盒阳性对照液(上海华美公司)、溴乙啶(上海华美公司)。
3 方法：
3.1 蛋白电泳分离蛋白区带：将醋酸纤维薄膜浸于巴比妥缓冲液中，待完全浸透后，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端1.5厘米处，取牛血清白蛋白标准品应用液分别点样(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/区带和5、10、15、20、25、30、35、40μg/区带)，待牛血清蛋白渗入膜内后，将薄膜贴在电泳支架的滤纸上，点样端近负极。电压100V，电流0.4—0.6毫安/厘米，通电40分钟，关闭电源。通电毕，将薄膜直接浸于染色液中5分钟后取出，用漂洗液浸洗数次，脱色至背景无色为止。将电泳薄膜置于扫描仪采集图谱，经微机摄取获得的电泳图谱。
, 百拇医药
3.2 核酸电泳区带图谱制备：淋球菌DNA标准系列如下：DNA含量(相对值)5、10、15、20、25.2%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，通电30分钟，溴乙啶染色。将电泳凝胶置于图谱摄录仪采集图谱，经微机摄取获得的电泳图谱。
3.3 蛋白和核酸电泳区带密度/亮度测定：采用自编“PROIMAGE图谱分析软件”扣除背景值后，测定各电泳区带密度/亮度体积积分值。
4 结果
4.1 蛋白标准系列线性范围：0.1～40μg/区带范围成线性关系。
4.1.1 0.1～0.5μg/区带范围的线性范围检测：
电泳、染色和脱色完毕，将薄膜置于透光扫描仪，经微机摄取获得的电泳图谱。使用本定量系统检测各电泳区带的密度值，测试结果见表1。
, 百拇医药
表1 牛血清白蛋白测定结果 序号
血清白蛋白μg
密度测定值
1
0.1
47246
2
0.2
101977
3
0.3
147510
4
, 百拇医药
0.4
208279
5
0.5
263820
经直线相关回归分析得：
Y=-8068.6+539449.9X
r=0.9991
DF=3
P<0.01
4.1.2 5～40μg/区带范围的线性范围
使用本定量系统检测各电泳斑点的密度值，微机测试结果见表2。表2 血清白蛋白测定结果 序号
, 百拇医药
血清白蛋白μg
密度测定值
1
5
26947
2
10
53146
3
15
66737
4
20
, http://www.100md.com
74109
5
25
91127
6
30
95810
7
35
121138
8
40
141705
, http://www.100md.com
经直线相关回归统计分析得：
Y=17009.35+2970.25X
r=0.98
DF=6
P<0.01
结果表明血清蛋白的含量在0.1～0.5μg/区带和5～40μg/区带的范围内与其图谱上密度值成正比关系。本系统硬件及定量软件的测试完全可作为蛋白电泳定量分析用。
4.1.3 核酸电泳图谱斑点剂量与亮度反应关系(相对定量)
经图谱摄录仪摄取图谱，检测各电泳区带的亮度值，微机测试结果见表3。表3 核酸测定结果 编号
核酸相对量
, 百拇医药
亮度测定值
1
5
16015
2
10
19384
3
15
25956
4
20
33890
, http://www.100md.com 5
25
48208
经直线相关回归分析得：
Y=5023+1577.84X
r=0.9691
DF=3
P<0.01
结果表明核酸含量与其图谱上亮度值成正比关系。本系统硬件及定量软件的测试完全可作为核酸电泳定量分析用。
4.2 重现性
4.2.1 软件测度重现法：对已经采集图谱上的同一斑点重复测定20次。得斑点密度值经统计分析得：5266±0，CV=0%,N=20。
, http://www.100md.com
4.2.2 系统测试重现性：重复20次，每次间隔5分钟，采集同一图谱并分别以不同图像文件保存。统计分析得：34354.6±253.54，CV=0.74%,N=20。
4.2.3 整体测试重现性：配制1%白蛋白溶液，取0.2μl体积分别点在10个不同起点位置，电泳，染色、脱色后采集图谱。经统计分析得：714081.71±5153，CV=5.53%?N=10。
4.3 与国外同类产品比较；该分析系统与国外有代表性的美国Jandel Scientific公司产品“SigmaGel分析系统”作比较分析，对图谱上的几个斑点(#1,#2,#3,#4)进行测试，比较两种产品的密度和亮度测定结果，结果如下：
4.3.1 密度测定比较分析(图3与表4)
, http://www.100md.com
图3
表4 密度测定值比较分析表 编号
本系统
测试数
SigmaGel
测试数
统计结果
1号斑点
159450±0
N=20
159450±0
N=20
*
, http://www.100md.com
2号斑点
229500±0
N=20
229500±0
N=20
*
3号斑点
76800±0
N=20
76800±0
N=20
*
4号斑点
, 百拇医药
12800±0
N=20
12800±0
N=20
*
*本系统与SigmaGel分析系统比较，两者测定结果完全一致。
4.3.2 亮度测定比较分析(图4与表5：)
图4
表5 亮度测定值与比较分析表 编号
本系统
, http://www.100md.com
测试数
SigmaGel
测试数
统计结果
1号斑点
159450±0
N=20
159450±0
N=20
*
2号斑点
229500±0
N=20
, 百拇医药
229500±0
N=20
*
3号斑点
76800±0
N=20
76800±0
N=20
*
4号斑点
12800±0
N=20
12800±0
, http://www.100md.com
N=20
*
*本系统与SigmaGel分析系统比较，两者测定结果完全一致。
4.4 对电泳图谱可进行无损伤及反复多次测试，电泳图谱可长期保存于计算机存储介质。
5 小结
以计算机技术直接测定电泳图谱上分子区带密度或亮度不仅是今后检测技术的发展方向，也是现代化高科技检测手段的标志。本系统具有良好的剂量—密度/亮度线性关系、灵敏度高、重现性好、操作简捷、测定无损、取样量少、测定结果与国内外同类产品一致和电泳图谱可长久保存等优点。朱上峰[2]等研制的医用电泳和凝胶图像分析系统测定蛋白和核酸凝胶电泳标本均采用CCD摄像头-图像采集卡。本系统获取蛋白质电泳区带图谱采用进口高分辨率数字透光扫描仪；而获取核酸电泳图则用CCD摄像头-图像采集卡。在测量区带密度/亮度时，应计算整个区带体积积分值，而不应只测区带某一截面密度积分值，因为该截面密度积分值只与其相应截面含量成正比，与整个区带物质含量是否成正比将取决于操作员的经验和区带电泳的均匀程度等因素；本系统是测量整个区带密度体积积分值，它与整个区带物质含量成正比，不受上述因素影响，因而测量误差较小。
, 百拇医药
该系统研制成功为我国分子生物学研究和实际应用提供可靠的数据图像处理工具，不仅表明我国在分子生物学研究领域拥有达到国际先进水平的电泳图谱数据自动处理技术，打破少数几个国家在这一技术领域的垄断地位，而且为国家节省大量用于购买外国设备所花费的外汇。
任何与分子生物学有关的实验如核酸和蛋白质凝胶电泳、纤维素薄膜电泳、放射自显影胶片以及各种层析图像等均可使用本系统进行数据储存和分析处理。本系统可广泛用于：从事生物科学基础理论与技术研究和教学的各类科研院所、高等院校；县级及其以上的医院和卫生防疫站医学检验部门；县级及其以上农业科学推广和技术研究部门；从事刑事侦察的公检法部门。■
基金项目：桂林市科学技术委员会“九五”重大攻关项目和广西教育厅“应用与试验发展”科研项目。
参考文献：
[1]王广志等.激光光密度扫描仪的研制.中国医疗器械杂志，1986：3：149-151
[2]朱上峰等.医用电泳和凝胶图像分析系统的研制.中国医疗器械杂志，1998：4：204-206
收稿日期：1999-7-2, http://www.100md.com
单位：李联胜(桂林医学院 (广西，桂林，541001))；何水淋(桂林医学院 (广西，桂林，541001))；施文祥(桂林医学院 (广西，桂林，541001)
关键词：比尔定律；光密度；电泳图谱
中国医疗器械杂志000205 提 要：介绍多功能分子图谱处理系统原理，结构，性能。
分类号：Q337 文献标识码：A
文章编号：1000-6974(2000)02-0082-04
The Development of a Multifunctional Molecular Electrophoretograms Processing System
, 百拇医药
LI Lian-sheng He Shui-lin Shi Wen-xiang
(Guilin Hospital)
Abstract：This paper presents to you the principles,composition and features of the multifunctional molecular electrophoretograms processing system.
Keywords：Bill daw;Eptical Density;Electrophoretograms▲
由于分子生物学技术迅猛发展，科技工作者迫切需要性能优良、操作简便的专用仪器。本课题是利用现代电子和计算机技术实现大分子电泳图谱取样、测试和微机分析。克服传统生物大分子电泳区带定量程序不能保存原有的电泳图谱、操作繁琐不仅增加工作量，而且检测周期长，效率低、检出误差大、使用胶片拍照操作繁复和难于控制感光条件等缺点。
, 百拇医药
1 原理
1.1 原理：根据比尔定律：在一定条件下标本的光密度值与其中物质的含量成正比，即标本上每一点光密度值A正比于该点物质密度，因此标本上的每个区带光密度值的积分值即正比于该区带中的物质含量，即：
∫A=K×M
其中：∫A为光密度值的积分，M为物质含量，K为比例常数，由制备和染色等条件决定。将电泳图谱区带通过透光扫描仪或图谱摄录仪摄入计算机形成可供分析的图像。自编“PROIMAGE图谱分析软件”测量各整个电泳区带密度/亮度值的体积积分值。根据区带密度/亮度与其含量成正比的定量关系，通过建立标准系列，可推算出待测区带中待测物的含量。
1.2 与光密度扫描仪测量方式的区别：
光密度扫描仪对条带状的电泳样品测量时是让光束在标本上移动扫描标本各区带某一截面密度积分值。形成以区带物质含量为横坐标，某一截面密度积分值为纵坐标的光密度曲线。
, 百拇医药
本分析系统对条带状的电泳样品测量时是让光束通过标本各区带。形成以区带物质含量为横坐标，整个区带密度体积积分值为纵坐标的光密度曲线。
由于扫描区带哪一截面计算密度积分值，决定操作员的经验和区带电泳的均匀程度等因而测量误差较大；本系统是测量整个区带密度体积积分值，测不受上述条件影响，因而测量误差较小。
2 系统配置和主要试剂
1 多功能分子图谱处理系统：由586计算机、高分辨率透光扫描仪、图谱摄录仪、静态图像采集卡、ESPON PHOTO—700打印机、等组成，见图1。PROIMAGE分析软件：主要采用VISUAL BASIC和VISUAL C语言。软件流程图见图2。
图1
, http://www.100md.com
图2
2 主要试剂：牛血清白蛋白(Server)、考马斯亮兰(Frank进口分装)、淋球菌PCR试剂盒阳性对照液(上海华美公司)、溴乙啶(上海华美公司)。
3 方法：
3.1 蛋白电泳分离蛋白区带：将醋酸纤维薄膜浸于巴比妥缓冲液中，待完全浸透后，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端1.5厘米处，取牛血清白蛋白标准品应用液分别点样(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/区带和5、10、15、20、25、30、35、40μg/区带)，待牛血清蛋白渗入膜内后，将薄膜贴在电泳支架的滤纸上，点样端近负极。电压100V，电流0.4—0.6毫安/厘米，通电40分钟，关闭电源。通电毕，将薄膜直接浸于染色液中5分钟后取出，用漂洗液浸洗数次，脱色至背景无色为止。将电泳薄膜置于扫描仪采集图谱，经微机摄取获得的电泳图谱。
, 百拇医药
3.2 核酸电泳区带图谱制备：淋球菌DNA标准系列如下：DNA含量(相对值)5、10、15、20、25.2%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，通电30分钟，溴乙啶染色。将电泳凝胶置于图谱摄录仪采集图谱，经微机摄取获得的电泳图谱。
3.3 蛋白和核酸电泳区带密度/亮度测定：采用自编“PROIMAGE图谱分析软件”扣除背景值后，测定各电泳区带密度/亮度体积积分值。
4 结果
4.1 蛋白标准系列线性范围：0.1～40μg/区带范围成线性关系。
4.1.1 0.1～0.5μg/区带范围的线性范围检测：
电泳、染色和脱色完毕，将薄膜置于透光扫描仪，经微机摄取获得的电泳图谱。使用本定量系统检测各电泳区带的密度值，测试结果见表1。
, 百拇医药
表1 牛血清白蛋白测定结果 序号
血清白蛋白μg
密度测定值
1
0.1
47246
2
0.2
101977
3
0.3
147510
4
, 百拇医药
0.4
208279
5
0.5
263820
经直线相关回归分析得：
Y=-8068.6+539449.9X
r=0.9991
DF=3
P<0.01
4.1.2 5～40μg/区带范围的线性范围
使用本定量系统检测各电泳斑点的密度值，微机测试结果见表2。表2 血清白蛋白测定结果 序号
, 百拇医药
血清白蛋白μg
密度测定值
1
5
26947
2
10
53146
3
15
66737
4
20
, http://www.100md.com
74109
5
25
91127
6
30
95810
7
35
121138
8
40
141705
, http://www.100md.com
经直线相关回归统计分析得：
Y=17009.35+2970.25X
r=0.98
DF=6
P<0.01
结果表明血清蛋白的含量在0.1～0.5μg/区带和5～40μg/区带的范围内与其图谱上密度值成正比关系。本系统硬件及定量软件的测试完全可作为蛋白电泳定量分析用。
4.1.3 核酸电泳图谱斑点剂量与亮度反应关系(相对定量)
经图谱摄录仪摄取图谱，检测各电泳区带的亮度值，微机测试结果见表3。表3 核酸测定结果 编号
核酸相对量
, 百拇医药
亮度测定值
1
5
16015
2
10
19384
3
15
25956
4
20
33890
, http://www.100md.com 5
25
48208
经直线相关回归分析得：
Y=5023+1577.84X
r=0.9691
DF=3
P<0.01
结果表明核酸含量与其图谱上亮度值成正比关系。本系统硬件及定量软件的测试完全可作为核酸电泳定量分析用。
4.2 重现性
4.2.1 软件测度重现法：对已经采集图谱上的同一斑点重复测定20次。得斑点密度值经统计分析得：5266±0，CV=0%,N=20。
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4.2.2 系统测试重现性：重复20次，每次间隔5分钟，采集同一图谱并分别以不同图像文件保存。统计分析得：34354.6±253.54，CV=0.74%,N=20。
4.2.3 整体测试重现性：配制1%白蛋白溶液，取0.2μl体积分别点在10个不同起点位置，电泳，染色、脱色后采集图谱。经统计分析得：714081.71±5153，CV=5.53%?N=10。
4.3 与国外同类产品比较；该分析系统与国外有代表性的美国Jandel Scientific公司产品“SigmaGel分析系统”作比较分析，对图谱上的几个斑点(#1,#2,#3,#4)进行测试，比较两种产品的密度和亮度测定结果，结果如下：
4.3.1 密度测定比较分析(图3与表4)
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图3
表4 密度测定值比较分析表 编号
本系统
测试数
SigmaGel
测试数
统计结果
1号斑点
159450±0
N=20
159450±0
N=20
*
, http://www.100md.com
2号斑点
229500±0
N=20
229500±0
N=20
*
3号斑点
76800±0
N=20
76800±0
N=20
*
4号斑点
, 百拇医药
12800±0
N=20
12800±0
N=20
*
*本系统与SigmaGel分析系统比较，两者测定结果完全一致。
4.3.2 亮度测定比较分析(图4与表5：)
图4
表5 亮度测定值与比较分析表 编号
本系统
, http://www.100md.com
测试数
SigmaGel
测试数
统计结果
1号斑点
159450±0
N=20
159450±0
N=20
*
2号斑点
229500±0
N=20
, 百拇医药
229500±0
N=20
*
3号斑点
76800±0
N=20
76800±0
N=20
*
4号斑点
12800±0
N=20
12800±0
, http://www.100md.com
N=20
*
*本系统与SigmaGel分析系统比较，两者测定结果完全一致。
4.4 对电泳图谱可进行无损伤及反复多次测试，电泳图谱可长期保存于计算机存储介质。
5 小结
以计算机技术直接测定电泳图谱上分子区带密度或亮度不仅是今后检测技术的发展方向，也是现代化高科技检测手段的标志。本系统具有良好的剂量—密度/亮度线性关系、灵敏度高、重现性好、操作简捷、测定无损、取样量少、测定结果与国内外同类产品一致和电泳图谱可长久保存等优点。朱上峰[2]等研制的医用电泳和凝胶图像分析系统测定蛋白和核酸凝胶电泳标本均采用CCD摄像头-图像采集卡。本系统获取蛋白质电泳区带图谱采用进口高分辨率数字透光扫描仪；而获取核酸电泳图则用CCD摄像头-图像采集卡。在测量区带密度/亮度时，应计算整个区带体积积分值，而不应只测区带某一截面密度积分值，因为该截面密度积分值只与其相应截面含量成正比，与整个区带物质含量是否成正比将取决于操作员的经验和区带电泳的均匀程度等因素；本系统是测量整个区带密度体积积分值，它与整个区带物质含量成正比，不受上述因素影响，因而测量误差较小。
, 百拇医药
该系统研制成功为我国分子生物学研究和实际应用提供可靠的数据图像处理工具，不仅表明我国在分子生物学研究领域拥有达到国际先进水平的电泳图谱数据自动处理技术，打破少数几个国家在这一技术领域的垄断地位，而且为国家节省大量用于购买外国设备所花费的外汇。
任何与分子生物学有关的实验如核酸和蛋白质凝胶电泳、纤维素薄膜电泳、放射自显影胶片以及各种层析图像等均可使用本系统进行数据储存和分析处理。本系统可广泛用于：从事生物科学基础理论与技术研究和教学的各类科研院所、高等院校；县级及其以上的医院和卫生防疫站医学检验部门；县级及其以上农业科学推广和技术研究部门；从事刑事侦察的公检法部门。■
基金项目：桂林市科学技术委员会“九五”重大攻关项目和广西教育厅“应用与试验发展”科研项目。
参考文献：
[1]王广志等.激光光密度扫描仪的研制.中国医疗器械杂志，1986：3：149-151
[2]朱上峰等.医用电泳和凝胶图像分析系统的研制.中国医疗器械杂志，1998：4：204-206
收稿日期：1999-7-2, http://www.100md.com