骨关节病软骨DNA损伤研究之一——关节软骨细胞程序化死亡
作者：岳 珍 王嘉芙
单位：湖南医科大学附属湘雅医院运动医学科(长沙410008) 岳 珍 王嘉芙
关键词：骨关节病；关节软骨；DNA损伤；细胞程序化死亡
骨关节病软骨DNA损伤研究之一 提要 为了探索骨关节病的分子发病机理，利用手术切除的骨关节病人变性的关节软骨，抽提其中的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳，发现小分子DNA片断(234bp以下)增加，占63%，出现典型的类似限制性酶切多态性表现，这种改变符合细胞程序化死亡(PCD)的特殊改变，说明不可修复的致死性的软骨细胞改变是骨关节病重要的发病因素。
Cartilage DNA Damage in Osteoarthritis
Yue Zhen and Wang Jiafu
, http://www.100md.com
Department of Sports Medicine, Hunan Medical University, Changsha, 410008
In order to study the cartilage DNA damage in patients with osteoarthritis(OA), we used Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from cartilage removed from patients with OA. The result showed that 63% of fragmentation ladders lower than 234bp DNA were found indicating the programed cell death(PCD) in OA, and the damage was not able to be repaired. The finding could be an important biomolecular mechanism of OA.
, http://www.100md.com
Key words: apoptosis, DNA, osteoarthritis, cartilage
从分子水平阐明骨关节病的发病机理是当今医学领域中研究的重要课题。骨关节病的始动因素，包括遗传、年龄和损伤，均可以抑制软骨基质蛋白多糖的合成，促进蛋白多糖、透明质酸和胶原的降解。采用分子生物学的新技术，能检测各种生理的、物理的和化学的诸因素造成的DNA损伤，如单链断裂、双链断裂、糖基氧化、碱基丢失和DNA链交联等。业已证明，氧自由基能造成关节软骨DNA损伤，碱基丢失能造成DNA复制过程错译，引起基因突变，未修复或错修复的DNA双链断裂，可致细胞死亡。本文报告骨关节病的软骨DNA改变，借以讨论其发病原理。
1 材料与方法
从临床手术中取得标本，包括人工置换股骨头5例，膝关节骨关节病病灶清除的变性关节软骨3例，膝关节游离体1例及对照组1例。取得标本后立即放入-70℃冷冻备用。
, http://www.100md.com
操作步骤：以TE液冲洗标本，用无菌技术取关节软骨，剪碎研磨，各置于2ml消化液(10%mM Tris. Cl 8.0， 1mM EDTA，10mM NaCl,1%SDS，2mg/ml proteinase k)50℃1小时。
将消化液离心(12000rpm)5分钟，收集上清液，加等体积苯酚，充分混匀，再离心10分钟，收集上清液，加20μl RNase(10mg/ml)置于37℃消化2小时，苯酚抽提，取上清液于另一新的1.5ml管内，余下液加200μl TE液，再用苯酚抽提1次。上清液以苯酚/氯仿各抽提1次，取上清液，再加1/10体积3M NaAc,3倍体积低温无水酒精，在-20℃过夜沉淀。
离心(12000rpm)10分钟，弃上清液，于70℃乙醇洗1次，再离心10分钟。真空抽干后，溶于150μl TE中，取10μl DNA样本于2%琼脂糖凝胶中，100V，电泳2小时，同时以λDNA/Hind Ⅲ+ E CORI及×174RF DNA/HaeⅢ两种分子量标志，紫外线透射仪一次成像。
, http://www.100md.com
2 结果与分析
紫外线透射仪一次成像示骨关节病软骨DNA电泳出现典型的梯样改变。
以λDNA/Hind Ⅲ+ECORI分子量为标志。对照组高分子DNA相对较多，尤以关节游离体软骨，大分子DNA集中在近端呈哑铃状，提示游离体的软骨细胞为正常状态。所有OA样本DNA的高分子区界限不清楚，在1904bp后才出现梯形改变，1584bp后，则梯形改变更趋明显。
以φ×174RF DNA/HaeⅢ分子量为标志。有5个OA样本DNA的分子量在234bp以下，占63%，对照组样本则无此改变。按照文献报告，DNA分子在180-200bp的梯形改变是细胞程序化死亡的特征，说明骨关节病的软骨中存在着细胞程序化死亡的特征。
3 讨论
各种疾病的发生机理，从分子水平来看，它们之间的差异是很小的，然而，它们的临床表现却各不相同。由DNA损伤所造成的碱基丢失和错补可能发生不同疾病。骨关节病的始动因素有遗传、年龄和损伤等因素。本文报告骨关节病的软骨DNA电泳后出现的典型的类似限制性酶切多态性表现，低分子DNA(234bp以下)占63%，说明有较多的DNA链断裂，是细胞程序化死亡的特征，说明骨关节病的变性软骨存在PCD过程。
, 百拇医药
PCD是控制和维持组织自身稳定的临界生理过程，是在特定基因控制下发生的，最初的刺激或损伤是作用于细胞表面的受体，进而作用于DNA分子或其他非核靶子。在形态学改变之前，胞浆中Ca++和H+浓度增高，细胞内NAD水平下降，DNA被核酸内切酶在连接区切割为非随机的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳中出现在180-200bp的DNA梯形谱带。在真核细胞中，DNA损伤和修复主要通过碱基切除和核苷酸切除，进行修复。其中氧化所致的DNA损伤和不同DNA酶的活性，在DNA—糖苷酶，AP—核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶等参与下共同完成的复杂的酶学反应，影响DNA的修复过程，产生突变的积累。本文结果提示，骨关节病的软骨DNA损伤主要由于氧自由基激活所有与DNA有关的酶，引起DNA链断裂，出现类似限制性酶切多态性表现，低分子DNA片断增加，阻断DNA的合成和修复，引起细胞致死性的DNA碱基损伤，出现典型的细胞程序化死亡的梯形改变。临床观察证实，关节软骨的变性、碎裂和脱落均不能自行修复，由此推想在多因素作用下，加之关节软骨无神经血管，细胞数相对较少，且相当固定，使软骨细胞程序化死亡后得不到修复和代偿，从而导致骨关节病的发生。
, http://www.100md.com
(本文的DNA抽提由湖南医科大学分子生物学研究室唐迎胜、周刚同志协助，特此致谢)
*国家自然科学基金资助
4 参考文献
1.Hanawalt PC. DNA repair comes of age. Mutation Research 1995，336：101-113
2.Williams CJ, Jimenez. Heredity, genes, and osteoarthritis. 1993，19：523-543
3.Salomon RN, Diaz-Cano S. Introduction to apoptosis. Diagnostic Molecular Pathology. 1995，4：235-238
, http://www.100md.com
4.Walker PR, Kokileva L, Leblanc J, et al. Detection of the initial stages of DNA fragmentation in apoptosis. Biotechniques, 1993 15：1032-1035
5.Hu JJ, Dubin N, Kurland D, et al. The effects of hydrogen peroxide on DNA repair activities. Mutation Research 1995，336：193-201
6.Czene S, Harms-Ringdahl M. Detection of single-strand breaks and formamidopyrimidine DNA glycosylase sensitive sites in DNA of cultured human fibroblasts. Mutation Research 1995，336：235-243
(1997.01.29收稿), 百拇医药
单位：湖南医科大学附属湘雅医院运动医学科(长沙410008) 岳 珍 王嘉芙
关键词：骨关节病；关节软骨；DNA损伤；细胞程序化死亡
骨关节病软骨DNA损伤研究之一 提要 为了探索骨关节病的分子发病机理，利用手术切除的骨关节病人变性的关节软骨，抽提其中的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳，发现小分子DNA片断(234bp以下)增加，占63%，出现典型的类似限制性酶切多态性表现，这种改变符合细胞程序化死亡(PCD)的特殊改变，说明不可修复的致死性的软骨细胞改变是骨关节病重要的发病因素。
Cartilage DNA Damage in Osteoarthritis
Yue Zhen and Wang Jiafu
, http://www.100md.com
Department of Sports Medicine, Hunan Medical University, Changsha, 410008
In order to study the cartilage DNA damage in patients with osteoarthritis(OA), we used Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from cartilage removed from patients with OA. The result showed that 63% of fragmentation ladders lower than 234bp DNA were found indicating the programed cell death(PCD) in OA, and the damage was not able to be repaired. The finding could be an important biomolecular mechanism of OA.
, http://www.100md.com
Key words: apoptosis, DNA, osteoarthritis, cartilage
从分子水平阐明骨关节病的发病机理是当今医学领域中研究的重要课题。骨关节病的始动因素，包括遗传、年龄和损伤，均可以抑制软骨基质蛋白多糖的合成，促进蛋白多糖、透明质酸和胶原的降解。采用分子生物学的新技术，能检测各种生理的、物理的和化学的诸因素造成的DNA损伤，如单链断裂、双链断裂、糖基氧化、碱基丢失和DNA链交联等。业已证明，氧自由基能造成关节软骨DNA损伤，碱基丢失能造成DNA复制过程错译，引起基因突变，未修复或错修复的DNA双链断裂，可致细胞死亡。本文报告骨关节病的软骨DNA改变，借以讨论其发病原理。
1 材料与方法
从临床手术中取得标本，包括人工置换股骨头5例，膝关节骨关节病病灶清除的变性关节软骨3例，膝关节游离体1例及对照组1例。取得标本后立即放入-70℃冷冻备用。
, http://www.100md.com
操作步骤：以TE液冲洗标本，用无菌技术取关节软骨，剪碎研磨，各置于2ml消化液(10%mM Tris. Cl 8.0， 1mM EDTA，10mM NaCl,1%SDS，2mg/ml proteinase k)50℃1小时。
将消化液离心(12000rpm)5分钟，收集上清液，加等体积苯酚，充分混匀，再离心10分钟，收集上清液，加20μl RNase(10mg/ml)置于37℃消化2小时，苯酚抽提，取上清液于另一新的1.5ml管内，余下液加200μl TE液，再用苯酚抽提1次。上清液以苯酚/氯仿各抽提1次，取上清液，再加1/10体积3M NaAc,3倍体积低温无水酒精，在-20℃过夜沉淀。
离心(12000rpm)10分钟，弃上清液，于70℃乙醇洗1次，再离心10分钟。真空抽干后，溶于150μl TE中，取10μl DNA样本于2%琼脂糖凝胶中，100V，电泳2小时，同时以λDNA/Hind Ⅲ+ E CORI及×174RF DNA/HaeⅢ两种分子量标志，紫外线透射仪一次成像。
, http://www.100md.com
2 结果与分析
紫外线透射仪一次成像示骨关节病软骨DNA电泳出现典型的梯样改变。
以λDNA/Hind Ⅲ+ECORI分子量为标志。对照组高分子DNA相对较多，尤以关节游离体软骨，大分子DNA集中在近端呈哑铃状，提示游离体的软骨细胞为正常状态。所有OA样本DNA的高分子区界限不清楚，在1904bp后才出现梯形改变，1584bp后，则梯形改变更趋明显。
以φ×174RF DNA/HaeⅢ分子量为标志。有5个OA样本DNA的分子量在234bp以下，占63%，对照组样本则无此改变。按照文献报告，DNA分子在180-200bp的梯形改变是细胞程序化死亡的特征，说明骨关节病的软骨中存在着细胞程序化死亡的特征。
3 讨论
各种疾病的发生机理，从分子水平来看，它们之间的差异是很小的，然而，它们的临床表现却各不相同。由DNA损伤所造成的碱基丢失和错补可能发生不同疾病。骨关节病的始动因素有遗传、年龄和损伤等因素。本文报告骨关节病的软骨DNA电泳后出现的典型的类似限制性酶切多态性表现，低分子DNA(234bp以下)占63%，说明有较多的DNA链断裂，是细胞程序化死亡的特征，说明骨关节病的变性软骨存在PCD过程。
, 百拇医药
PCD是控制和维持组织自身稳定的临界生理过程，是在特定基因控制下发生的，最初的刺激或损伤是作用于细胞表面的受体，进而作用于DNA分子或其他非核靶子。在形态学改变之前，胞浆中Ca++和H+浓度增高，细胞内NAD水平下降，DNA被核酸内切酶在连接区切割为非随机的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳中出现在180-200bp的DNA梯形谱带。在真核细胞中，DNA损伤和修复主要通过碱基切除和核苷酸切除，进行修复。其中氧化所致的DNA损伤和不同DNA酶的活性，在DNA—糖苷酶，AP—核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶等参与下共同完成的复杂的酶学反应，影响DNA的修复过程，产生突变的积累。本文结果提示，骨关节病的软骨DNA损伤主要由于氧自由基激活所有与DNA有关的酶，引起DNA链断裂，出现类似限制性酶切多态性表现，低分子DNA片断增加，阻断DNA的合成和修复，引起细胞致死性的DNA碱基损伤，出现典型的细胞程序化死亡的梯形改变。临床观察证实，关节软骨的变性、碎裂和脱落均不能自行修复，由此推想在多因素作用下，加之关节软骨无神经血管，细胞数相对较少，且相当固定，使软骨细胞程序化死亡后得不到修复和代偿，从而导致骨关节病的发生。
, http://www.100md.com
(本文的DNA抽提由湖南医科大学分子生物学研究室唐迎胜、周刚同志协助，特此致谢)
*国家自然科学基金资助
4 参考文献
1.Hanawalt PC. DNA repair comes of age. Mutation Research 1995，336：101-113
2.Williams CJ, Jimenez. Heredity, genes, and osteoarthritis. 1993，19：523-543
3.Salomon RN, Diaz-Cano S. Introduction to apoptosis. Diagnostic Molecular Pathology. 1995，4：235-238
, http://www.100md.com
4.Walker PR, Kokileva L, Leblanc J, et al. Detection of the initial stages of DNA fragmentation in apoptosis. Biotechniques, 1993 15：1032-1035
5.Hu JJ, Dubin N, Kurland D, et al. The effects of hydrogen peroxide on DNA repair activities. Mutation Research 1995，336：193-201
6.Czene S, Harms-Ringdahl M. Detection of single-strand breaks and formamidopyrimidine DNA glycosylase sensitive sites in DNA of cultured human fibroblasts. Mutation Research 1995，336：235-243
(1997.01.29收稿), 百拇医药