P16对正常及骨关节炎软骨细胞的调控作用研究
作者：吴立成 田得祥 于长隆
单位：北京医科大学运动医学研究所(100083) 吴立成 田得祥 于长隆
关键词：P16；骨关节炎；软骨细胞
P16对正常及骨关节炎软骨细胞的调控作用研究 提要 P16是一种CDK4及CDK6激酶的抑制蛋白，可以抑制细胞的增殖，促进细胞的分化。为了研究P16在正常及骨关节炎软骨组织中对软骨细胞的调控作用，本文用免疫组化的方法，观察了P16在正常及骨关节炎软骨组织中的表达及分布状况。结果显示：P16在正常软骨组织的移行层及柱状层上层表达，而在骨关节炎组织中，P16表达紊乱。结论：P16与软骨细胞的生长调控有关。骨关节炎软骨组织中P16的表达紊乱说明了软骨细胞增殖与分化的紊乱，造成了软骨组织中各结构成份的分布不一致，导致软骨组织的破坏。
The Expression of P16 in Healthy and Osteoarthritic Cartilage
, 百拇医药
Wu Licheng, Tian Dexiang, Yu Changlong
Institute of Sports Medicine,Beijing Medical University
As a inhibitor of CDK4 and CDK6,P16 can inhibit cellular proliferation, therefore it is benefitial for cell growth and differentiation. In order to study the regulational role of P16 in normal and osteoarthritic articular cartilage, we investigated the expression of P16 in normal and osteoarthritic articular cartilage immunohistochemically. We found that P16 protein was present in polygonal chondrocytes in intermediate zone of cartilage, while in osteoarthritis, P16 was irregularly presented in all zones of articular cartilage with intense expression in the superficial layer. Our results indicated that P16 is related to the chondrocyte growth. The irregular location of P16 protein suggested the disruption of proliferation and differentiation, which will result in the damage of cartilage.
, 百拇医药
Key word: P16, osteoarthritis, chondrocyte
Xiong, Y等在1993年发现在被SV40病毒传染的细胞中，有一种分子量为16KD的蛋白，可与D类循环素竞争结合CDK4[2]。后经Serrano等克隆出P16的cDNA[3]。P16作为一种抑癌基因，其蛋白产物能特异地与CDK4或CDK6结合，从而抑制CDK4或CDK6的激酶活性，使细胞停止在G1期。
目前，关于P16的研究主要集中在P16的肿瘤抑制作用及其对细胞增殖及分化的影响，P16在软骨细胞中的调控作用还未见报导。本文用免疫组化的方法研究了P16在正常及骨关节炎软骨组织中的表达情况。
1 材料与方法
1.1 标本来源：
, 百拇医药
正常关节软骨：分别取自肱骨髁外骨折、髌骨粉碎性骨折及外伤截肢病人，共3例，均为男性，年龄21-33岁。
骨关节炎标本：取自股骨头骨折伴骨关节炎病人男女各1例，年龄分别为68、72岁；严重骨关节炎行人工关节置换手术切除标本8例，取自胫骨平台，由北京医科大学第三临床医学院骨科及人民医院骨科提供，其中，男性2例，女性6例，年龄58-81岁。
1.2 标本处置：将所需部位的标本修成0.5cm厚，置4%的多聚甲醛中固定4-5天，然后置20%的EDTA(购自sigma公司)脱钙4周，充分冲洗后，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋。常规HE染色及0.1%甲苯胺蓝染色，光镜观察。
1.3 免疫组化[4]：常规入水，0.06%过氧化氢甲醇封闭30分钟，PBS(0.1M，PH＝7.4)洗3次，10%羊血清封闭30分钟，加1∶50稀释的多克隆抗体P16(购自Santa-Cruz公司)，4℃过夜，PBS洗3次，滴加1∶200稀释的生物素标记的羊抗兔抗体(购自Santa-Cruz公司)室温30分钟PBS洗3次，滴加1∶400稀释的过氧化物酶标记的链卵白素(购自Santa-Cuz公司)室温50分钟，PBS洗3次，用DAB(购自sigma公司)镜下显色，常规脱水封片，镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HE染色观察：
正常关节软骨组织可见水平层、移行层、柱状层、潮线、钙化软骨层，骨层清晰。
骨关节炎软骨层变薄，软骨细胞减少，排列紊乱，局灶增殖。重者软骨细胞出现核缩，核溶坏死，软骨险窝出现空泡。软骨基质出现变性，红染，并出现裂隙，表面出现纤维样变。部分标本出现纤维软骨，并与骨髓内的纤维组织相连。潮线可见涨潮、断裂、消失等。软骨下骨可见骨小梁增厚，髓腔狭窄，骨小梁内出现软骨岛，骨髓纤维化并长入软骨层，部分标本出现髓腔开放，有血管等骨髓内容物突入软骨组织。
2.2 甲苯胺蓝染色观察：
正常关节软骨可见移行层及柱状层软骨组织着色，而水平层未见着色。
骨关节炎软骨层着色层次不清，有的全层着色，有的在移行层及柱状层上层也未见着色。
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2.3 免疫组化观察P16蛋白的表达：
正常关节软骨的水平层可见点状的阳性信号，在移行层及柱状层上层的阳性信号呈片状分布，柱状层下层未着色。
骨关节炎出现P16表达的紊乱：大多数病例(9/10)P16在软骨表面缺损处的阳性信号增强，特别是一些体积较小的簇聚的软骨细胞(cluster)处表达增强。在移行层及柱状层上层，大多数病例(8/10)阳性信号减弱，呈点状分布或无阳性信号，在柱状层下层出现点状的阳性信号，部分病例(4/10)出现局灶的片状的阳性信号。P16在类纤维软骨组织中表达较少，仅在类纤维软骨组织的上下两侧出现点状的阳性信号。
3 讨论
P16蛋白含有4个前后并排出现的钩状区，每个钩状区含有32个氨基酸，共有148个氨基酸组成[3]。这种钩状结构对蛋白与蛋白的结合非常有利。在多种细胞中，P16的表达可以阻止细胞进入复制期，而止于生长期[5]。作用机理是通过P16与D类循环素竞争地结合CDK4或CDK6，形成没有活性的P16-CDK激酶复合物，或通过直接抑制有活性的循环素D-CDK复合物而起作用。本实验发现，在正常关节软骨，P16在移行层的小多角形细胞内表达，而这层细胞的代谢很旺盛[1]，在骨关节炎病例中，P16可在体积较小的簇聚的软骨细胞内表达(可能是新生的软骨细胞)，所以，P16可能与软骨细胞的生长有关。
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正常的关节软骨细胞在潮线以上可分为明显的3层，表层的细胞呈纺锥形，它的长轴与关节面平行，故又称为平行层。平行层下面的细胞呈小多角形，呈放射状排列，称为移行层。移行层细胞具有增殖潜能，细胞的代谢也很旺盛。深层的软骨细胞体积较大，呈圆形，排列成柱状，与表面垂直，称为压力层或柱状层[1]。本实验发现，正常的关节软骨结构清楚，层次分明。在移行层及柱状层上层的软骨细胞处于生长阶段，而要抑制细胞的增殖，所以P16呈片状表达。这与这层细胞处于代谢活跃的结果相吻合[1]。在深层的软骨细胞体积较大，核浆比例缩小，深层的软骨细胞营养供应差，软骨细胞可能被诱导凋亡，P16又不表达。
在骨关节炎中，P16在移行层及柱状层上层的表达减少，而在软骨组织的表层及柱状层的深层出现局灶性的表达，特别是在软骨表面组织缺损周围的软骨细胞内表达增强说明在骨关节炎中，软骨细胞的增殖及分化出现紊乱。同样，甲苯胺蓝在软骨组织的染色深浅及层次的不均也同样说明了软骨细胞分化的紊乱。目前认为软骨组织的破坏主要是由于软骨组织的降解所致，软骨细胞在致病因子的作用下可被激活表达癌基因及组织蛋白酶，引起软骨组织的降解，尽管软骨细胞可表达蛋白酶抑制剂TIMP及增强软骨基质的表达，但由于组织降解的速率大于组织修复的速率，出现软骨基质的破坏[6]。但这种观点只说明了软骨组织损伤的一个方面，本文结果显示了在骨关节炎中软骨细胞出现了增殖与分化的紊乱，也就是说在软骨组织的局部区域以软骨基质的降解为主，而在有的区域以软骨基质的增生为主，故在常规染色下可见局部软骨基质的红染，出现裂隙，而在其他部位相对正常。软骨基质的过度增生同样也不是生理的，过度增生的软骨基质可能会引起软骨细胞的营养障碍，或因为细胞外基质成份的比例不一致，导致软骨基质的强度及硬度下降，最终会导致软骨基质的破坏。
, 百拇医药
4 小结
P16与软骨细胞的生长有关，在正常及骨关节炎的软骨组织中表达，但分布区域不同。P16在骨关节炎中的软骨组织的表达紊乱，可能因为炎症因子干扰了软骨细胞正常的生长及分化，导致软骨基质的降解及增生失平衡，最终引起软骨组织的破坏。
5 参考文献
1.Siberberg R. Diseases of joints. In: Kissane J M,ed: Anderson's Pathology. C.V.Mosby, 1990：2065-2073
2.Xiong Y. Subunit rearrangement of the cyclin-dependent kinases is associated with cellular transformation. Genes & Dev. 1993；7：1572-1583
, http://www.100md.com
3.Serrano M, Hannon G J, Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/cdk4. Nature 1993；366：704-707
4.Ausubel F M, Kingston R E, Moore D D. Short protocals in molecular biology. Greene and John Wiley Sons:1992：1424-1429
5.Serrano M, Gomez-Lahoz E, Depinho R A, et al. Inhibition of ras-induced proliferation and cellular transformation by P16Ink4. Science 1995；267：249-252
6.Bonassar L J, et al. Changes in cartilage composition and physical properties due to stomelysin degradation. Arthritis Rheum 1995；38：173-183
(1998.03.11收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学运动医学研究所(100083) 吴立成 田得祥 于长隆
关键词：P16；骨关节炎；软骨细胞
P16对正常及骨关节炎软骨细胞的调控作用研究 提要 P16是一种CDK4及CDK6激酶的抑制蛋白，可以抑制细胞的增殖，促进细胞的分化。为了研究P16在正常及骨关节炎软骨组织中对软骨细胞的调控作用，本文用免疫组化的方法，观察了P16在正常及骨关节炎软骨组织中的表达及分布状况。结果显示：P16在正常软骨组织的移行层及柱状层上层表达，而在骨关节炎组织中，P16表达紊乱。结论：P16与软骨细胞的生长调控有关。骨关节炎软骨组织中P16的表达紊乱说明了软骨细胞增殖与分化的紊乱，造成了软骨组织中各结构成份的分布不一致，导致软骨组织的破坏。
The Expression of P16 in Healthy and Osteoarthritic Cartilage
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Wu Licheng, Tian Dexiang, Yu Changlong
Institute of Sports Medicine,Beijing Medical University
As a inhibitor of CDK4 and CDK6,P16 can inhibit cellular proliferation, therefore it is benefitial for cell growth and differentiation. In order to study the regulational role of P16 in normal and osteoarthritic articular cartilage, we investigated the expression of P16 in normal and osteoarthritic articular cartilage immunohistochemically. We found that P16 protein was present in polygonal chondrocytes in intermediate zone of cartilage, while in osteoarthritis, P16 was irregularly presented in all zones of articular cartilage with intense expression in the superficial layer. Our results indicated that P16 is related to the chondrocyte growth. The irregular location of P16 protein suggested the disruption of proliferation and differentiation, which will result in the damage of cartilage.
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Key word: P16, osteoarthritis, chondrocyte
Xiong, Y等在1993年发现在被SV40病毒传染的细胞中，有一种分子量为16KD的蛋白，可与D类循环素竞争结合CDK4[2]。后经Serrano等克隆出P16的cDNA[3]。P16作为一种抑癌基因，其蛋白产物能特异地与CDK4或CDK6结合，从而抑制CDK4或CDK6的激酶活性，使细胞停止在G1期。
目前，关于P16的研究主要集中在P16的肿瘤抑制作用及其对细胞增殖及分化的影响，P16在软骨细胞中的调控作用还未见报导。本文用免疫组化的方法研究了P16在正常及骨关节炎软骨组织中的表达情况。
1 材料与方法
1.1 标本来源：
, 百拇医药
正常关节软骨：分别取自肱骨髁外骨折、髌骨粉碎性骨折及外伤截肢病人，共3例，均为男性，年龄21-33岁。
骨关节炎标本：取自股骨头骨折伴骨关节炎病人男女各1例，年龄分别为68、72岁；严重骨关节炎行人工关节置换手术切除标本8例，取自胫骨平台，由北京医科大学第三临床医学院骨科及人民医院骨科提供，其中，男性2例，女性6例，年龄58-81岁。
1.2 标本处置：将所需部位的标本修成0.5cm厚，置4%的多聚甲醛中固定4-5天，然后置20%的EDTA(购自sigma公司)脱钙4周，充分冲洗后，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋。常规HE染色及0.1%甲苯胺蓝染色，光镜观察。
1.3 免疫组化[4]：常规入水，0.06%过氧化氢甲醇封闭30分钟，PBS(0.1M，PH＝7.4)洗3次，10%羊血清封闭30分钟，加1∶50稀释的多克隆抗体P16(购自Santa-Cruz公司)，4℃过夜，PBS洗3次，滴加1∶200稀释的生物素标记的羊抗兔抗体(购自Santa-Cruz公司)室温30分钟PBS洗3次，滴加1∶400稀释的过氧化物酶标记的链卵白素(购自Santa-Cuz公司)室温50分钟，PBS洗3次，用DAB(购自sigma公司)镜下显色，常规脱水封片，镜下观察。
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2 结果
2.1 HE染色观察：
正常关节软骨组织可见水平层、移行层、柱状层、潮线、钙化软骨层，骨层清晰。
骨关节炎软骨层变薄，软骨细胞减少，排列紊乱，局灶增殖。重者软骨细胞出现核缩，核溶坏死，软骨险窝出现空泡。软骨基质出现变性，红染，并出现裂隙，表面出现纤维样变。部分标本出现纤维软骨，并与骨髓内的纤维组织相连。潮线可见涨潮、断裂、消失等。软骨下骨可见骨小梁增厚，髓腔狭窄，骨小梁内出现软骨岛，骨髓纤维化并长入软骨层，部分标本出现髓腔开放，有血管等骨髓内容物突入软骨组织。
2.2 甲苯胺蓝染色观察：
正常关节软骨可见移行层及柱状层软骨组织着色，而水平层未见着色。
骨关节炎软骨层着色层次不清，有的全层着色，有的在移行层及柱状层上层也未见着色。
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2.3 免疫组化观察P16蛋白的表达：
正常关节软骨的水平层可见点状的阳性信号，在移行层及柱状层上层的阳性信号呈片状分布，柱状层下层未着色。
骨关节炎出现P16表达的紊乱：大多数病例(9/10)P16在软骨表面缺损处的阳性信号增强，特别是一些体积较小的簇聚的软骨细胞(cluster)处表达增强。在移行层及柱状层上层，大多数病例(8/10)阳性信号减弱，呈点状分布或无阳性信号，在柱状层下层出现点状的阳性信号，部分病例(4/10)出现局灶的片状的阳性信号。P16在类纤维软骨组织中表达较少，仅在类纤维软骨组织的上下两侧出现点状的阳性信号。
3 讨论
P16蛋白含有4个前后并排出现的钩状区，每个钩状区含有32个氨基酸，共有148个氨基酸组成[3]。这种钩状结构对蛋白与蛋白的结合非常有利。在多种细胞中，P16的表达可以阻止细胞进入复制期，而止于生长期[5]。作用机理是通过P16与D类循环素竞争地结合CDK4或CDK6，形成没有活性的P16-CDK激酶复合物，或通过直接抑制有活性的循环素D-CDK复合物而起作用。本实验发现，在正常关节软骨，P16在移行层的小多角形细胞内表达，而这层细胞的代谢很旺盛[1]，在骨关节炎病例中，P16可在体积较小的簇聚的软骨细胞内表达(可能是新生的软骨细胞)，所以，P16可能与软骨细胞的生长有关。
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正常的关节软骨细胞在潮线以上可分为明显的3层，表层的细胞呈纺锥形，它的长轴与关节面平行，故又称为平行层。平行层下面的细胞呈小多角形，呈放射状排列，称为移行层。移行层细胞具有增殖潜能，细胞的代谢也很旺盛。深层的软骨细胞体积较大，呈圆形，排列成柱状，与表面垂直，称为压力层或柱状层[1]。本实验发现，正常的关节软骨结构清楚，层次分明。在移行层及柱状层上层的软骨细胞处于生长阶段，而要抑制细胞的增殖，所以P16呈片状表达。这与这层细胞处于代谢活跃的结果相吻合[1]。在深层的软骨细胞体积较大，核浆比例缩小，深层的软骨细胞营养供应差，软骨细胞可能被诱导凋亡，P16又不表达。
在骨关节炎中，P16在移行层及柱状层上层的表达减少，而在软骨组织的表层及柱状层的深层出现局灶性的表达，特别是在软骨表面组织缺损周围的软骨细胞内表达增强说明在骨关节炎中，软骨细胞的增殖及分化出现紊乱。同样，甲苯胺蓝在软骨组织的染色深浅及层次的不均也同样说明了软骨细胞分化的紊乱。目前认为软骨组织的破坏主要是由于软骨组织的降解所致，软骨细胞在致病因子的作用下可被激活表达癌基因及组织蛋白酶，引起软骨组织的降解，尽管软骨细胞可表达蛋白酶抑制剂TIMP及增强软骨基质的表达，但由于组织降解的速率大于组织修复的速率，出现软骨基质的破坏[6]。但这种观点只说明了软骨组织损伤的一个方面，本文结果显示了在骨关节炎中软骨细胞出现了增殖与分化的紊乱，也就是说在软骨组织的局部区域以软骨基质的降解为主，而在有的区域以软骨基质的增生为主，故在常规染色下可见局部软骨基质的红染，出现裂隙，而在其他部位相对正常。软骨基质的过度增生同样也不是生理的，过度增生的软骨基质可能会引起软骨细胞的营养障碍，或因为细胞外基质成份的比例不一致，导致软骨基质的强度及硬度下降，最终会导致软骨基质的破坏。
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4 小结
P16与软骨细胞的生长有关，在正常及骨关节炎的软骨组织中表达，但分布区域不同。P16在骨关节炎中的软骨组织的表达紊乱，可能因为炎症因子干扰了软骨细胞正常的生长及分化，导致软骨基质的降解及增生失平衡，最终引起软骨组织的破坏。
5 参考文献
1.Siberberg R. Diseases of joints. In: Kissane J M,ed: Anderson's Pathology. C.V.Mosby, 1990：2065-2073
2.Xiong Y. Subunit rearrangement of the cyclin-dependent kinases is associated with cellular transformation. Genes & Dev. 1993；7：1572-1583
, http://www.100md.com
3.Serrano M, Hannon G J, Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/cdk4. Nature 1993；366：704-707
4.Ausubel F M, Kingston R E, Moore D D. Short protocals in molecular biology. Greene and John Wiley Sons:1992：1424-1429
5.Serrano M, Gomez-Lahoz E, Depinho R A, et al. Inhibition of ras-induced proliferation and cellular transformation by P16Ink4. Science 1995；267：249-252
6.Bonassar L J, et al. Changes in cartilage composition and physical properties due to stomelysin degradation. Arthritis Rheum 1995；38：173-183
(1998.03.11收稿), 百拇医药