人类运动能力的遗传学研究新方法——单根毛发中线粒体DNA RFLP分析
作者：陈 青 马力宏 张纯斌
单位：陈 青 马力宏 (天津体育学院运动医学研究所 天津 300381)；张纯斌 (公安部法医物证鉴定中心)
关键词：线粒体DNA；遗传标记；运动能力；RFLP；PCR
人类运动能力的遗传学研究新方法 提要 以痕量标本提取、PCR技术以及RFLP分析相结合的检测方式，从单根毛发中提取线粒体DNA(mtDNA)，获得其调节区(D_loop)的多态片段，为从分子水平探讨人类运动能力的遗传基础以及筛选有价值的遗传标记，建立了一种无创伤性、灵敏、稳定且简便可行的检测方法，使大样本的筛检成为可能，进而为运动选材和准确评估个体运动潜力开辟了一条新的途径。
A Method for Genetic Study of Human Exercise Capacity——
, 百拇医药
The RFLP Analysis of Mitochondrial DNA from A Single Hair
Chen Qing,Ma Lihong,Zhang Chunbin
Tianjin Research Institute of Sports Medicine,Tianjin 300381,China
The restriction fragment length polymorphism(RFLP) of the control region of mitochondrial DNA(mtDNA) was detected in a single hair by combination of tracingsample extraction and PCR amplification.The study showed that the genetic polymorphism of the noncoding region of mtDNA may be used as a genetic maker for predicting human exercise capacity and identifying the varing trainability of individuals.
, 百拇医药
Key words:Mitochondrial DNA,Genetic marker,Exercise capacity,PCR,RFLP
近年来，随着人类运动潜能在激烈的竞争中被最大限度地挖掘，对运动能力的遗传学研究已成为体育科学中的热点。
遗传因素对人体运动能力的影响至少有两个方面：一是与环境因素和生活方式无关的基因对人群的平均影响，如所谓的特定表型的遗传度(运动天赋)；二是基因与环境的相互作用，具体到运动能力，即表现为个体对运动训练的敏感程度，其取决于某些基因型的限制程度[1]。近年来，国内外学者在与运动能力相关的特定性状的遗传度和个体对运动训练敏感度的差异方面作了大量研究工作，结果表明人体的有氧运动能力及对耐力训练的敏感性在较大程度上受控于基因，且越是接近可训性的极限，肌组织酶的适应性变化就越依赖于基因型[2]。
在研究过程中，不少学者的目光都集中在寻找可区别不同反应群体的遗传标志(genetic marker)上。但这些研究均提示，基因产物——蛋白质的遗传多态现象不能解释人体有氧耐力较大的个体差异，而在DNA非编码区的遗传学变异很可能对基因的表达与调控产生更大的影响[3]。由限制性内切酶切割DNA所得到不同长度的DNA片段的类型在群体中呈多态频率分布现象，称为限制性片段长度多态(RFLP)，其在性状标记方法上实现了从生化分子标记(蛋白质)到分子遗传标记(DNA)的转变。若多态序列与人类优异的运动能力性状位点连锁时，RFLP可作为有关运动能力遗传性状的分子遗传标记，使运动选材更为精确。但迄今国外在这一领域围绕其进行的研究仍处于探索阶段，而国内尚未开展此方面的研究，且由于此类研究的方法学复杂[4]，限制了样本的含量及来源，使得这一新的遗传标记无法在适当群体中得到进一步的证实，因而大大降低了其实际应用价值。
, 百拇医药
针对以上问题，本研究旨在建立简便可行的实验方法，进一步探讨DNA在人类运动能力遗传中的确切作用，以期将“遗传标记”从实验室科研引向运动选材的实际应用。
1 材料
1.1 主要试剂
CHELEX—100，丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(美国Bio_Rad公司)，DNA聚合酶(美国PE_Cetus公司)，dNTP(美国U.S.B.公司)，引物(美国Cybersyn公司)，PCR扩增片段纯化试剂(美国Promega公司)，限制性内切酶(华美生物制品公司)。
1.2 主要仪器
PCR扩增仪(美国PE_Cetus公司)，垂直板电泳仪(美国Bio_Rad公司)，电泳稳压电源(瑞典Pharmacia公司)，台式高速离心机(德国Heraeus公司)。
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1.3 实验对象
实验对象分为2组：A组为10名无训练经历的普通无关个体。B组为10名经系统训练的运动员(包括游泳、长跑及皮划艇)。
2.1 单根毛发的模板DNA制备
取新鲜毛发1根，将其剪成约6—8mm长，放入离心管中，加入5%Chelex_100 200μl,0.4M DTT溶液4μl,2mg/ml蛋白酶K溶液10μl，混匀后56℃水浴保温6hr,99℃ 8min，振荡，12000rpm离心2min，4℃备用。
2.2 引物的选择与合成
根据Anderson等报道的DNA碱基序列[5]，选择L链15926及H链00580扩增全部mtDNAD_loop区域。两引物相对5'端之间碱基数为1333bp。引物序列如下(图1)[6]：
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引物L15926：5’—ACTAATACACCAGTCTTGTAAACC
引物H00580：5’—TTGAGGAGGTAAGCTACATA
根据上述序列由美国Cybersyn公司进行引物的合成。合成引物常规处理保存。
图1 线粒体DNA调节区(箭头所指为PCR所用引物)
Fig.1 Diagram of mtDNA control region.
Primers used in the amplification are shown as arrows
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图2 线粒体DNA调节区RFLP
Fig. 2 Diagram of mtDNA D_Loop RFLP.
2.3 mtDNA D_loop的扩增与纯化
扩增反应体系为50ul:模板DNA 3ul,10x缓冲液(500mM KCL,100mMTris_HCL pH8.3,1% Triton X_100)5ul,1.5uM MgC12,2uM dNTP 4ul,mtDNA 引物L15926及H00580各1uM,Taq酶2u,补灭菌去离子水至50ul,混匀后加50ul石蜡油。反应条件为：94℃ 120s，然后94℃ 45s,55℃ 60s,72℃ 300s循环35次，最后72℃ 420s[7]。
扩增产物以5%聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳25min，电压200V。银染法检测扩增结果。
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扩增产物经PCR产物纯化柱纯化，获得特异的mtDNA D_loop区段。
2.4 mtDNA D_loop的RFLP
酶切体系：取纯化产物5ul,10x缓冲液2ul,Msp Ⅰ，KpnⅠ，HinfⅠ HaeⅢ 各2u,37℃ 1hr.
酶切产物以8%聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳45min,电压200V。银染法检测结果。
3 结果
本方法的测定结果显示mtDNA D_loop存在着较强的多态性(图2)。其中一些变异型在运动员组频繁出现。同时，以相同方法对同一个体的不同组织(毛发及血液)以及不同批次的重复实验表明其mtDNA的RFLP是一致的。
4 讨论
, 百拇医药
人类运动能力的发展在很大程度上依赖于能量代谢的条件，而线粒体在能量代谢中占据着枢纽地位，骨骼肌内线粒体产生ATP的能力同氧运输系统一样，是限制有氧耐力的主要因素。mtDNA为母系遗传，编码部分与呼吸链OXPHOS有关的酶类，且基因组的变异远远高于核DNA，尤其是在非编码区(D_loop)，这种变异更为常见。mtDNA也是人类细胞中唯一存在于核DNA外的遗传物质，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一些最基本的性质，具有基因型单一，高拷贝数，高进化速率等特点，而且可以从角质化生物检材中分离出来，因而使得本方法具有以下特点：
4.1 灵敏性：
由于单一的人类细胞中含有成百上千的mtDNA拷贝，相对于核DNA，其具有更高的检出率。此外，本方法结合了PCR技术，使这一方法的灵敏性大大提高，从而解决了其它DNA检验技术无法解决的极微量检材的测定。以单根毛发即可达到检测的目的，使本方法以无创伤性突破了以往此类研究用于人体实验的限制。
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4.2 准确性：
mtDNA的多拷贝之间为匀质性，同一个体不同组织的mtDNA分子均为均一的。其基因型单一，避免了核DNA 2条姊妹染色体为杂合子时的相互干扰。mtDNA D_loop RFLP图谱的检测结果重复性强，较为稳定。
4.3 多态性：
mtDNA调节区(D_loop)在物种之间相对保守，在同一物种之内又存在很大差异，其构成了鉴别研究的基础。本实验的结果显示D_loop具有较强的多态性，其为研究人类运动能力的差异提供了一个很好的分子遗传标记，进而为科学选材和准确评估个体运动状态及运动潜力开辟了新的途径。
4.4 简便可行：
本实验操作过程简便，节省花费，取样简单，不受场地及时间限制且易被运动员接受，使得大样本的筛检成为可能。
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综上所述，本实验首次采用极微量样品检测方法，从分子水平探讨人类运动能力的遗传基础，以期通过这一方法将人类运动能力的遗传学研究从实验室科研引向运动选材的实际应用。
*国家教育部留学回国人员启动资金资助
5 参考文献
[1]Bouchard C.genetic basis of racial differences.Can.J.Sports.Sci.1988,13(2):104_108.
[2]Bouchard C.Muscle genetic variants and relationship with performance and trainability.Med.Sci.Sports.Exerc.1989,21:71_77.
[3]马力宏.人类有氧耐力的遗传学研究进展.天津体育学院学报.1993，1：74_77.
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[4]France T.,Dionne FT.et al. Mitochondrial DNA sequence polymorphism,VO2max and response to endurance training.Med & Sci Sport.1991,23:177_185.
[5]Anderson S.,Bankier A.T.,barrell B.G. et al,Sequence and organization of the human mitochondrial genome.Nature 1981,290(9):457_465.
[6]Revnolds R,Sensabaugh G,Blake E.Analysis of genetic markers in forensic DNA samples using the polymerase chain reaction.Anal.Chem.1991,63:2_15.
[7]Sullivan KM.Identificationof human remains by amplification and automated sequencing of mitochondrial DNA.Int.J.Leg.Med. 1992,105:83_86.
(第1作者：陈青，女，25岁，运动生理学硕士研究生，实习研究员)
(1998.07.29收稿), 百拇医药
单位：陈 青 马力宏 (天津体育学院运动医学研究所 天津 300381)；张纯斌 (公安部法医物证鉴定中心)
关键词：线粒体DNA；遗传标记；运动能力；RFLP；PCR
人类运动能力的遗传学研究新方法 提要 以痕量标本提取、PCR技术以及RFLP分析相结合的检测方式，从单根毛发中提取线粒体DNA(mtDNA)，获得其调节区(D_loop)的多态片段，为从分子水平探讨人类运动能力的遗传基础以及筛选有价值的遗传标记，建立了一种无创伤性、灵敏、稳定且简便可行的检测方法，使大样本的筛检成为可能，进而为运动选材和准确评估个体运动潜力开辟了一条新的途径。
A Method for Genetic Study of Human Exercise Capacity——
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The RFLP Analysis of Mitochondrial DNA from A Single Hair
Chen Qing,Ma Lihong,Zhang Chunbin
Tianjin Research Institute of Sports Medicine,Tianjin 300381,China
The restriction fragment length polymorphism(RFLP) of the control region of mitochondrial DNA(mtDNA) was detected in a single hair by combination of tracingsample extraction and PCR amplification.The study showed that the genetic polymorphism of the noncoding region of mtDNA may be used as a genetic maker for predicting human exercise capacity and identifying the varing trainability of individuals.
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Key words:Mitochondrial DNA,Genetic marker,Exercise capacity,PCR,RFLP
近年来，随着人类运动潜能在激烈的竞争中被最大限度地挖掘，对运动能力的遗传学研究已成为体育科学中的热点。
遗传因素对人体运动能力的影响至少有两个方面：一是与环境因素和生活方式无关的基因对人群的平均影响，如所谓的特定表型的遗传度(运动天赋)；二是基因与环境的相互作用，具体到运动能力，即表现为个体对运动训练的敏感程度，其取决于某些基因型的限制程度[1]。近年来，国内外学者在与运动能力相关的特定性状的遗传度和个体对运动训练敏感度的差异方面作了大量研究工作，结果表明人体的有氧运动能力及对耐力训练的敏感性在较大程度上受控于基因，且越是接近可训性的极限，肌组织酶的适应性变化就越依赖于基因型[2]。
在研究过程中，不少学者的目光都集中在寻找可区别不同反应群体的遗传标志(genetic marker)上。但这些研究均提示，基因产物——蛋白质的遗传多态现象不能解释人体有氧耐力较大的个体差异，而在DNA非编码区的遗传学变异很可能对基因的表达与调控产生更大的影响[3]。由限制性内切酶切割DNA所得到不同长度的DNA片段的类型在群体中呈多态频率分布现象，称为限制性片段长度多态(RFLP)，其在性状标记方法上实现了从生化分子标记(蛋白质)到分子遗传标记(DNA)的转变。若多态序列与人类优异的运动能力性状位点连锁时，RFLP可作为有关运动能力遗传性状的分子遗传标记，使运动选材更为精确。但迄今国外在这一领域围绕其进行的研究仍处于探索阶段，而国内尚未开展此方面的研究，且由于此类研究的方法学复杂[4]，限制了样本的含量及来源，使得这一新的遗传标记无法在适当群体中得到进一步的证实，因而大大降低了其实际应用价值。
, 百拇医药
针对以上问题，本研究旨在建立简便可行的实验方法，进一步探讨DNA在人类运动能力遗传中的确切作用，以期将“遗传标记”从实验室科研引向运动选材的实际应用。
1 材料
1.1 主要试剂
CHELEX—100，丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(美国Bio_Rad公司)，DNA聚合酶(美国PE_Cetus公司)，dNTP(美国U.S.B.公司)，引物(美国Cybersyn公司)，PCR扩增片段纯化试剂(美国Promega公司)，限制性内切酶(华美生物制品公司)。
1.2 主要仪器
PCR扩增仪(美国PE_Cetus公司)，垂直板电泳仪(美国Bio_Rad公司)，电泳稳压电源(瑞典Pharmacia公司)，台式高速离心机(德国Heraeus公司)。
, 百拇医药
1.3 实验对象
实验对象分为2组：A组为10名无训练经历的普通无关个体。B组为10名经系统训练的运动员(包括游泳、长跑及皮划艇)。
2.1 单根毛发的模板DNA制备
取新鲜毛发1根，将其剪成约6—8mm长，放入离心管中，加入5%Chelex_100 200μl,0.4M DTT溶液4μl,2mg/ml蛋白酶K溶液10μl，混匀后56℃水浴保温6hr,99℃ 8min，振荡，12000rpm离心2min，4℃备用。
2.2 引物的选择与合成
根据Anderson等报道的DNA碱基序列[5]，选择L链15926及H链00580扩增全部mtDNAD_loop区域。两引物相对5'端之间碱基数为1333bp。引物序列如下(图1)[6]：
, http://www.100md.com
引物L15926：5’—ACTAATACACCAGTCTTGTAAACC
引物H00580：5’—TTGAGGAGGTAAGCTACATA
根据上述序列由美国Cybersyn公司进行引物的合成。合成引物常规处理保存。
图1 线粒体DNA调节区(箭头所指为PCR所用引物)
Fig.1 Diagram of mtDNA control region.
Primers used in the amplification are shown as arrows
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图2 线粒体DNA调节区RFLP
Fig. 2 Diagram of mtDNA D_Loop RFLP.
2.3 mtDNA D_loop的扩增与纯化
扩增反应体系为50ul:模板DNA 3ul,10x缓冲液(500mM KCL,100mMTris_HCL pH8.3,1% Triton X_100)5ul,1.5uM MgC12,2uM dNTP 4ul,mtDNA 引物L15926及H00580各1uM,Taq酶2u,补灭菌去离子水至50ul,混匀后加50ul石蜡油。反应条件为：94℃ 120s，然后94℃ 45s,55℃ 60s,72℃ 300s循环35次，最后72℃ 420s[7]。
扩增产物以5%聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳25min，电压200V。银染法检测扩增结果。
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扩增产物经PCR产物纯化柱纯化，获得特异的mtDNA D_loop区段。
2.4 mtDNA D_loop的RFLP
酶切体系：取纯化产物5ul,10x缓冲液2ul,Msp Ⅰ，KpnⅠ，HinfⅠ HaeⅢ 各2u,37℃ 1hr.
酶切产物以8%聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳45min,电压200V。银染法检测结果。
3 结果
本方法的测定结果显示mtDNA D_loop存在着较强的多态性(图2)。其中一些变异型在运动员组频繁出现。同时，以相同方法对同一个体的不同组织(毛发及血液)以及不同批次的重复实验表明其mtDNA的RFLP是一致的。
4 讨论
, 百拇医药
人类运动能力的发展在很大程度上依赖于能量代谢的条件，而线粒体在能量代谢中占据着枢纽地位，骨骼肌内线粒体产生ATP的能力同氧运输系统一样，是限制有氧耐力的主要因素。mtDNA为母系遗传，编码部分与呼吸链OXPHOS有关的酶类，且基因组的变异远远高于核DNA，尤其是在非编码区(D_loop)，这种变异更为常见。mtDNA也是人类细胞中唯一存在于核DNA外的遗传物质，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一些最基本的性质，具有基因型单一，高拷贝数，高进化速率等特点，而且可以从角质化生物检材中分离出来，因而使得本方法具有以下特点：
4.1 灵敏性：
由于单一的人类细胞中含有成百上千的mtDNA拷贝，相对于核DNA，其具有更高的检出率。此外，本方法结合了PCR技术，使这一方法的灵敏性大大提高，从而解决了其它DNA检验技术无法解决的极微量检材的测定。以单根毛发即可达到检测的目的，使本方法以无创伤性突破了以往此类研究用于人体实验的限制。
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4.2 准确性：
mtDNA的多拷贝之间为匀质性，同一个体不同组织的mtDNA分子均为均一的。其基因型单一，避免了核DNA 2条姊妹染色体为杂合子时的相互干扰。mtDNA D_loop RFLP图谱的检测结果重复性强，较为稳定。
4.3 多态性：
mtDNA调节区(D_loop)在物种之间相对保守，在同一物种之内又存在很大差异，其构成了鉴别研究的基础。本实验的结果显示D_loop具有较强的多态性，其为研究人类运动能力的差异提供了一个很好的分子遗传标记，进而为科学选材和准确评估个体运动状态及运动潜力开辟了新的途径。
4.4 简便可行：
本实验操作过程简便，节省花费，取样简单，不受场地及时间限制且易被运动员接受，使得大样本的筛检成为可能。
, http://www.100md.com
综上所述，本实验首次采用极微量样品检测方法，从分子水平探讨人类运动能力的遗传基础，以期通过这一方法将人类运动能力的遗传学研究从实验室科研引向运动选材的实际应用。
*国家教育部留学回国人员启动资金资助
5 参考文献
[1]Bouchard C.genetic basis of racial differences.Can.J.Sports.Sci.1988,13(2):104_108.
[2]Bouchard C.Muscle genetic variants and relationship with performance and trainability.Med.Sci.Sports.Exerc.1989,21:71_77.
[3]马力宏.人类有氧耐力的遗传学研究进展.天津体育学院学报.1993，1：74_77.
, http://www.100md.com
[4]France T.,Dionne FT.et al. Mitochondrial DNA sequence polymorphism,VO2max and response to endurance training.Med & Sci Sport.1991,23:177_185.
[5]Anderson S.,Bankier A.T.,barrell B.G. et al,Sequence and organization of the human mitochondrial genome.Nature 1981,290(9):457_465.
[6]Revnolds R,Sensabaugh G,Blake E.Analysis of genetic markers in forensic DNA samples using the polymerase chain reaction.Anal.Chem.1991,63:2_15.
[7]Sullivan KM.Identificationof human remains by amplification and automated sequencing of mitochondrial DNA.Int.J.Leg.Med. 1992,105:83_86.
(第1作者：陈青，女，25岁，运动生理学硕士研究生，实习研究员)
(1998.07.29收稿), 百拇医药