牛磺酸对大鼠急性运动后自由基代谢、膜流动性及钙转运变化的影响
作者：张宜龙 陈吉棣
单位：张宜龙 陈吉棣 (北京医科大学第三医院运动医学研究所 北京 100083)
关键词：牛磺酸；运动；自由基；生物膜；钙
中国运动医学杂志990106 提要 50只雄性Wistar大鼠(80-100g)，随机分为对照组(G1)，急性运动组(G2)，急性运动+牛磺酸组(G3)，力竭运动组(G4)，力竭运动+牛磺酸组(G5)。牛磺酸补充方式为每日灌服1次(500mg/kg)。喂养2周后，进行负重游泳，测定血液、线粒体和肌浆网各生化指标变化。结果显示“牛磺酸有增加大鼠游泳力竭时间的趋势(0.052+-ATPase活性和摄钙率明显高于G2组(P<0.05)。力竭后24小时，G5组RBC、血浆及心肌线粒体MDA含量明显低于G4组(P<0.05)。以上结果表明，牛磺酸可以通过抗自由基损伤，稳定生物膜和调节钙转运等途径对抗运动性疲劳。
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Effects of taurine on free radicals metabolism、membrane fluidity
and calcium transfer after acute exercise in rats
Zhang Yilong, Chen Jidi
Institute of Sports Medicine,3rd Hospital,Beijing Medical University
To observe the effects of taurine on free radicals metabolism、membrane fluidity
and calcium transfer after acute exercise,50 male Wistar rats were randomly divided into five groups as follows:control group(G1),acute exercise group(G2),acute exercise + taurine group(G3),exhaustive exercise group(G4),exhaustive exercise+ taurine group(G5).Taurine-treated animals (G3 and G5)received forced oral administration of 500 mg/kg taurine per day for two weeks by means of a cannulainserted into the esophagus.Other animals received the same amount of water each day as above.After exercise,the blood and heart samples were taken for measurement of biochemical indexes.The results showed that: 1.Taurine has the potential effect of increasing swimming exhaustion time in rats. 2.BUN was increased immediately after acute exercise while taurine reduced such an increase. 3.MDA contentsof RBC,plasma and mitochondria(Mit) were all increased after exercise while taurine prevented such an increase. 4.Mit-GPX activity was decreased immediately after acute exercise while taurine prevented the decline of the activity. 5.The fluorescence polarization of Mit was increased after acute and exhaustive exercise,while taurine could prevent such an increase. 6.SR Ca2+ ATPase activity and the rate of Ca2+ uptake were decreased immediately after exercise while taurine reduced such a decrease.The results suggested that taurine prevent the onset of fatigue by antagonizing free radicals damage,stabilizing biological membrane and regulating calcium transfer.
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Key words：taurine,exercise,free radicals,biological membrane,calcium
通过以前实验研究，我们得知，牛磺酸可以减轻运动造成的脂质过氧化反应，提高运动员的运动能力[1]。本研究围绕自由基代谢、生物膜流动性、钙离子转运变化，研究牛磺酸对急性运动后血液、线粒体和肌浆网各生化指标的影响，探讨牛磺酸抗运动性疲劳的亚细胞机制。
1. 材料和方法
1.1 实验动物：选用雄性Wistar大鼠50只，体重80～100克，由北京医科大学动物部提供。常规分笼饲养，自由饮水进食。
1.2 分组、用药及运动方式：
大鼠购进后，先适应性喂养3天，同时每天进行30分钟适应性游泳训练1次，然后按体重大小随机分为5组：
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(1)对照组(G1组)10只；(2)急性运动组(G2组)10只；(3)急性运动+牛磺酸组(G3组)10只；(4)力竭运动组(G4组)10只；(5)力竭运动+牛磺酸组(G5组)10只。 牛磺酸补充方式为G3和G5组大鼠每日灌服牛磺酸1次，剂量为500mg/kg；G1、G2、G4组大鼠每日灌服等量蒸馏水(灌胃体积为10ml/kg BW)。
经2周喂养后，各运动组大鼠负其自身体重的3%进行游泳，游泳池呈圆形，内壁光滑，直径45厘米，水深70厘米，水温35±1度。游泳分两日进行，第1日，G4和G5组大鼠游泳至力竭(在水下10秒不能上浮)后捞出；次日，G2和G3组大鼠游泳2小时，如在游泳期间发现有力竭表现，捞出水面休息5分钟后继续游泳至满2小时。
1.3 样本收集与处理：
G2和G3组大鼠游泳运动后即刻处死，同时处死对照组大鼠与力竭后24小时的G4和G5组大鼠。
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样本收集：腹腔注射2%戊巴比妥-生理盐水麻醉(5ml/Kg BW)，腹主动脉取血后摘取心脏分装备用。
每只大鼠可得全血约5ml，分装3只试管：第1管为EDTA抗凝管(10%EDTA 10μl)，注入1ml全血后混匀，4℃离心制备血浆，用于血氨测定；第2管为NaF(1%NaF 0.48ml)，新鲜血20μl，混匀，用于血乳酸测定；第3管为肝素抗凝管(20单位/ml)，全血3ml，注入后混匀，4℃离心，分离血浆与RBC。血浆用于BUN及MDA测定，RBC用于SOD、GSH_Px、MDA测定。
摘取心脏后，用差速离心法分离心肌细胞线粒体和肌浆网(SR)[2，3]。
1.4 观测指标及方法：
各组大鼠体重变化。
血氨测定：Ammonia Reagent_Enzymatic Method
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氨试剂盒由中国科学院生物物理所中生公司提供
血尿素氮测定：脲酶吲哚酚-终点比色法。尿素氮试剂盒由北京化工厂临床试剂分厂提供
血乳酸测定：血乳酸超微量改良法[4]
全血RBC-SOD测定：方法同前[1]
全血RBC-GSH_Px测定：方法同前[1]
全血RBC及血浆MDA测定：方法同前[1]
心肌线粒体膜脂流动性：DPH探针标记法[5]
心肌线粒体Ca2+含量测定：原子吸收法[2]
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心肌线粒体SOD，GSH_Px，MDA测定：方法同前
线粒体蛋白定量：Bradford法[6]
肌肉肌浆网蛋白定量：Lowry法[7]
肌浆网钙泵活性测定：参照Jones等的方法[3]
肌浆网钙泵摄Ca2+率的测定[8]
1.5 统计方法：t检验
2 实验结果
2.1 一般观察指标
2.1.1 体重变化(表1)
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2.1.2 牛磺酸对大鼠运动能力的影响
表1 大鼠体重的变化
Table 1 Changes of body weight of rats Day
G1
(n=10)
G2
(n=10)
G3
(n=10)
G4
(n=10)
G5
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(n=10)
1
100.2±9.5
100.6±9.6
101.2±10.0
98.0±10.6
102.8±12.7
14
182.7±16.6
186.8±15.8
191.8±18.8
183.4±21.1
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188.8±24.9
两组力竭运动大鼠平均游泳时间无显著性差异(P>0.05)，但给予牛磺酸有增加大鼠游泳力竭时间的趋势(0.05
Table 2 Changes of the exhaustive swimming time of rats 组别
Group
n
力竭游泳时间(分)
Exhaustive swimming time(min)
G4
G5
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10
10
87.80+32.73
113.90+40.47
Note:G4:Exhausted group G5:taurine + exhausted group
2.2 血液NH3、BLA、BUN的变化
运动后即刻，G2组大鼠血NH3、BLA及BUN均显著高于对照组水平，G3组血NH3、BLA亦显著增加，且与G2组无显著性差异，而BUN含量与对照组比较则无显著性差异；运动后24小时，G4和G5组大鼠血NH3、BLA、BUN与对照组比较无显著性差异(P>0.05)(表3，4)。
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2.3 血液MDA、SOD、GSH_Px的变化表3 运动后即刻大鼠血液NH3、BLA、BUN的变化
Table 3 Changes of blood NH3、BLA and BUN contents of rats immediately after swimming
G1
(n=10)
G2
(n=9)
G3
(n=10)
NH3(μmol/L)
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34.69±5.09
67.37±12.74*
63.32±9.76*
BLA(mmol/L)
1.52±0.40
3.31±0.84*
3.09±0.62*
BUN(mmol/L)
5.11±0.85
6.59±0.63*
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5.94±0.58#
Note:G1：control group G2:acute exercise group G3:taurine + acute exercise group
*:p<0.05,compared with G1 #:p<0.05,compared with G2表4 运动后24小时大鼠血液NH3、BLA、BUN的变化
Table 4 Changes of blood NH3、BLA and BUN contents of rats 24h after swimming
G1
(n=10)
G4
, 百拇医药
(n=8)
G5
(n=9)
NH3(μmol/L)
34.69±5.09
37.61±5.09
36.20±5.99
BLA(mmol/L)
1.52±0.40
1.60±0.37
1.65±0.34
BUN(mmol/L)
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5.11±0.85
5.27±0.73
5.32±0.60
表5 运动后即刻大鼠血液SOD、GSH_Px活性和MDA含量变化
Table 5 Changes of blood SOD and GSH_Px activities and the MDA content of rats immediately after swimming
G1
(n=10)
G2
(n=9)
, 百拇医药 G3
(n=10)
RBC_SOD(u/gHb)
3583.84±443.63
3327.58±479.71
3410.24±425.36
RBC_GSH_Px(u/gHb)
81.97±10.35
94.08±13.31*
110.22±14.97*#
RBC_MDA(nmol/gHb)
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7.52±0.51
10.05±0.62*
8.30±0.64*#
P_MDA(nmol/ml)
1.73±0.12
2.18±0.19*
2.02±.0.16*
*:P<0.05,compared with G1 #:P<0.05,compared with G2表6 运动后24小时血SOD和GSH_Px活性及MDA含量的变化
Table 6 Changes of blood SOD and GSH_Px activities and the MDA content of rats 24h after acute exercise
, 百拇医药
G1
(n=10)
G4
(n=8)
G5
(n=9)
RBC_SOD(u/gHb)
3583.84±443.63
3548.08±418.00
3633.62±346.27
RBC_GSH_Px(u/gHb)
81.97±10.35
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83.72±9.69
96.55±9.66*#
RBC_MDA(nmol/gHb)
7.52±0.51
10.18±0.36*
7.91±0.60#
P_MDA(nmol/ml)
1.73±0.12
2.25±0.26*
2.00±0.16*＃
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*:P<0.05,compared with G1 #:P<0.05,compared with G4
运动后即刻，G2和G3组大鼠RBC及血浆MDA含量均明显高于对照组水平，但给予牛磺酸可明显抑制其升高幅度；运动后24小时，G4组RBC及血浆MDA含量仍明显高于对照组，而G5组RBC-MDA含量与对照组比较已无显著性差异，血浆MDA虽高于对照组水平，但亦明显低于G4组运动后水平(P<0.05)(表5，6)。
各组大鼠运动后即刻及24小时RBC-SOD活力与对照组均无显著性差异(P>0.05)(表5，6)。
运动后即刻，G2和G3组大鼠RBC-GSH_Px活力明显高于对照组水平，给予牛磺酸可以显著增加RBC-GSH_Px的升高幅度；运动后24小时，G4组大鼠RBC-GSH_Px活力恢复至对照组水平，而G5组RBC-GSH_Px仍处于较高水平，且明显高于对照组及G4组运动后24小时的RBC-GSH_Px活力(P<0.05)(表5，6)。
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2.4 线粒体各指标变化
运动后即刻，G2和G3组大鼠线粒体MDA含量均显著高于对照组水平，给予牛磺酸可以显著抑制运动后线粒体MDA的升高幅度；运动后24小时，G4组大鼠线粒体MDA含量明显高于对照组，而G5组大鼠线粒体MDA虽然也处于较高水平(0.050.05)(表7，8)。表7 运动后即刻大鼠心肌线粒体SOD、GSH_Px活性和MDA、Ca2+含量变化
Table 7 Changes of myocardial mitochondria membrane SOD GSH_Px activities and MDA，Ca2+ contents of rats immediately after swimming
G1
, 百拇医药
(n=10)
G2
(n=9)
G3
(n=10)
MDA(μmol/mg Pr.)
0.51±0.12
0.80±0.14*
0.64±0.13*#
SOD(u/mg Pr.)
126.77±17.49
, 百拇医药
129.29±16.26
112.54±12.87
GSH_Px(u/mg Pr.)
22.76±5.11
15.35±4.68*
20.10±4.74＃
Ca++(nmol/mg Pr.)
20.61±5.35
22.35±8.01
21.19±5.13
, 百拇医药
P value
0.1071±0.0119
0.1556±0.0096*
0.1310±0.0049*#
*:P<0.05,compared with G1 ＃:P<0.05,compared with G2表8 运动后24小时大鼠心肌线粒体SOD、GSH_Px活性和MDA、Ca2+含量变化
Table 8 Changes of myocardial mitochondria membrane SOD、GSH_Px activities and MDA、Ca2+ contents of rats 24h after swimming
, 百拇医药
G1
(n=10)
G4
(n=8)
G5
(n=9)
MDA(μmol/mg Pr.)
0.51±0.12
0.84±0.15*
0.61±0.11#
SOD(u/mg Pr.)
126.77±17.49
, 百拇医药
131.67±16.34
134.95±15.50
GSH_Px(u/mg Pr.)
22.76±5.11
21.24±3.59
26.03±4.83#
Ca++(nmol/mg Pr.)
20.61±5.35
22.61±5.23
20.86±3.78
, 百拇医药 P value
0.1071±0.0119
0.1384±0.0169*
0.1107±0.0101#
*:P<0.05,compared with G1 ＃:P<0.05,compared with G4
运动后即刻，G2组大鼠线粒体GSH_Px活力明显低于对照组，给予牛磺酸明显抑制了这种降低作用；运动后24小时，G4组大鼠线粒体GSH_Px活力基本恢复至对照水平，G5组则较对照组有增高趋势，且明显高于G4组运动后24小时水平(P<0.05)(表7，8)。
运动后即刻，G2组和G3组大鼠线粒体膜荧光偏振值P明显高于对照组水平，给予牛磺酸可以显著降低其升高幅度；运动后24小时，G4组大鼠荧光偏振值P明显高于对照组，而G5组则恢复至正常水平，且明显低于G4组运动后24小时线粒体膜P值(P<0.05)(表7，8)。
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运动后即刻及24小时，各组大鼠线粒体SOD活力、Ca2+含量与对照组均无显著性差异(P>0.05)(表7，8)。
2.5 肌浆网钙泵功能的变化
急性运动后即刻，G2和G3组大鼠SR Ca2+-ATpase活性和ATP依赖的摄钙率明显下降，给予牛磺酸能明显抑制SR Ca2+-ATPase活性的降低，提高SR对钙的摄取率；力竭后24小时，G4和G5组大鼠SR Ca2+-ATPase活性和ATP依赖的摄钙率与对照组比较已无显著性差异(P>0.05)(表9,10)。表9 补充牛磺酸对大鼠运动后即刻SRCa2+_ATPase
和钙摄取率的影响
Table 9 Effects of taurine on SR Ca2+-ATPase and the rate of
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calcium uptake of rat hearts immediately after swimming Group
SR Ca2+-ATPase
(μmol pi/mg pr/h)
rate of calcium uptake
(nmol Ca/mg pr/10min)
G1(n=8)
16.11±1.02
108.32±12.06
G2(n=8)
, 百拇医药
10.36±1.42*
61.74±12.33*
G3(n=8)
13.22±0.91*＃
79.23±13.99*＃
Note:*:p<0.05,compared with G1 #:p<0.05,compared with G2表10 补充牛磺酸对大鼠运动后24小时SRCa2+,ATPase
和钙摄取率的影响
Table 10 Effects of taurine on SR Ca2+,ATPase and the rate of
, http://www.100md.com
calcium uptake of rat hearts 24h after swimming Group
SR Ca2+-ATPase
(μmol pi/mg pr/h)
Rate of Calcium uptake
(nmol Ca/mg pr/10min)
G1(n=8)
16.11±1.02
108.32±12.06
G4(n=8)
15.68±0.96
, 百拇医药
101.21±17.49
G5(n=8)
16.24±0.97
111.95±11.62
3 讨论
以耗竭性游泳为运动模型进行运动疲劳机制的研究已经被国内外很多学者采用[9，10]。但考虑到耗竭运动后即刻各大鼠体内生化指标可能发生比较类似的变化，难以对牛磺酸的运动保护作用进行观测，本研究选用定量游泳方式……负重3%游泳2小时，来观察牛磺酸对运动后即刻各指标变化的影响。而对耗竭性游泳大鼠进行恢复期观测，即牛磺酸对运动后24小时各指标变化的影响。同时记录游泳耗竭时间，评估运动能力。
本研究结果显示，两组耗竭性游泳大鼠平均游泳时间无显著性差异(P>0.05)，但给予牛磺酸有增加大鼠游泳力竭时间的趋势(0.05[11]。
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血乳酸、血氨作为肌肉活动的重要代谢产物，是重要的疲劳物质。其在体内的蓄积将导致内环境的紊乱，从而影响肌肉的收缩功能。本实验结果显示，大鼠经2小时负重游泳后，血乳酸和血氨浓度均比对照组明显提高(P<0.05)，提示此运动量可使大鼠产生一定程度的疲劳。给予牛磺酸未见对运动中血乳酸、血氨的生成有明显的抑制作用。
BUN是蛋白质代谢的重要产物。蛋白质虽为机体的主要结构部分，但在一定条件下也参与能量代谢。运动后，血BUN的增量大小，提示机体利用蛋白质供能的程度。蛋白质作为能源储备被利用时，其被利用的程度则是机体适应力大小的指标之一。机体的适应力越强，所动用的蛋白质就越少，因而体内BUN的生成也就越少。反之，机体的适应力弱时，则被动用的蛋白质就多。大鼠经2小时负重游泳后，血BUN含量明显增加，给予牛磺酸对BUN的升高有明显抑制作用，使运动后BUN含量与对照组比较已无显著性差异。说明牛磺酸可以降低大鼠运动时的蛋白质供能程度，提示牛磺酸具有提高机体适应能力的作用。力竭运动后24小时，各组大鼠血BUN水平与对照组比较均无显著性差异。
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MDA作为自由基与不饱和脂肪酸反应生成的代谢产物，常被用来间接反应机体的自由基代谢的变化。研究表明，运动可导致体内脂质过氧化物水平增高[12]。本研究分别对血浆、RBC和心肌细胞线粒体的MDA含量进行了测定，结果发现：大鼠负重游泳后即刻及力竭后24小时，三者均显著性增高(P<0.05)，给予牛磺酸可以明显阻断体内MDA的生成。运动后即刻，运动+牛磺酸组大鼠RBC及心肌细胞线粒体MDA含量较单纯运动组显著降低；力竭后24小时，给予牛磺酸的大鼠，无论血浆、RBC还是线粒体，MDA含量均明显低于单纯力竭组大鼠，其RBC和线粒体MDA含量与对照组比较已无显著性差异。表明牛磺酸可有效地对抗运动引起的脂质过氧化，对运动机体发挥重要的保护作用。Morales等人的体外研究发现，牛磺酸可以明显减少脂质过氧化产物MDA的形成，减少生物膜损伤[13—16]。侯等人的研究也发现，无论是在血浆还是在心肌，牛磺酸都可以阻断运动所致的MDA生成[17]。
生物体不断产生自由基，引起脂质过氧化作用加强的同时，自由基清除系统的活性也在不断变化。但由于自由基损伤的非特异性，对于不同的运动条件，以及不同的组织和器官，机体自由基代谢和抗氧化酶的变化是有差异的[18—19]。本研究并未发现大鼠急性负荷游泳后血液及心肌线粒体SOD活性的变化。
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GSH_Px是机体又一种重要的抗氧化酶，分解过氧化氢和脂质过氧化物，阻止自由基氧化链式反应。本研究结果表明，大鼠游泳后即刻，RBC_GSH_Px活性显著高于对照组，牛磺酸对其升高有明显的促进作用。甚至力竭后24小时，给予牛磺酸的大鼠RBC-GSH_Px活力仍显著高于对照组水平。心肌线粒体GSH_Px的测定表明，经2小时负重游泳后，大鼠心肌线粒体GSH_Px活力明显降低，与MDA的变化成反平行关系，可能是与线粒体自由基代谢水平较高，造成自由基生成过多，并对蛋白质产生毒性作用有关。给予牛磺酸可以明显抑制心肌线粒体GSH_Px的这种降低作用，使运动后即刻，心肌线粒体GSH_Px与对照组无显著性差异。另外，牛磺酸可明显促进力竭运动后心肌线粒体GSH_Px活力的恢复，使力竭后24小时心肌线粒体GSH_Px水平显著高于对照组水平，牛磺酸对GSH_Px的这种作用机制尚需进一步研究。
脂质过氧化物对生物膜造成许多不良影响[20]。已有研究表明，急性运动诱发内源性自由基生成增多及脂质过氧化反应增强，构成对细胞膜系统结构的损伤，可能与运动性损伤和运动性疲劳的形成有关[21—24]。本研究用稳态荧光偏振技术，对负重游泳的大鼠心肌线粒体膜进行研究发现，无论在运动后即刻，还是力竭后24小时，大鼠心肌线粒体膜流动性均显著下降。给予牛磺酸可以明显抑制膜流动性的降低，甚至力竭运动后24小时，牛磺酸组大鼠心肌线粒体膜流动性已基本恢复至对照组水平。生物膜流动性变化会影响电子传递和偶联磷酸化的进行。Hackenbrock(1981)提出，呼吸链的电子转移是依赖于该链组份的侧向扩散与分子相互碰撞而实现的。这就要求线粒体膜有合适的流动性。Slarter等(1985)提出“碰撞假说”，即电子传递和偶联磷酸化过程均依赖呼吸链成分和ATP酶的碰撞过程。本研究结果提示，牛磺酸可有效抑制急性运动后心肌线粒体膜过氧化脂质增加，从而减少过氧化产物MDA进入膜双层结构的水相，与膜蛋白、膜脂上的NH2交联形成Schiff's碱而降低膜流动性，保护多种膜蛋白的脂微环境，充分发挥生物膜的各种生理功能，进而减轻运动性疲劳和促进运动后疲劳的消除。
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近年来，有关细胞钙离子化谢对机体机能影响的研究十分活跃。大量医学和生物学研究表明，细胞钙代谢紊乱是引起机能异常的重要原因[24，25]。心肌细胞 肌浆网和线粒体对细胞内钙离子的调控起着重要的作用。本研究以心肌为材料，观察了急性运动后线粒体钙含量及SR Ca2+-ATPase活性和摄钙率的变化情况，并研究了牛磺酸对此变化的影响。结果表明，急性运动后未见心肌线粒体钙含量发生显著变化，而SR C2+-ATPase活性和摄钙率在负重游泳后即刻明显下降，分别比对照组下降36%和43%。肌浆网是细胞内的钙贮存库，它通过对Ca2+的释放和聚集，调节肌细胞的收缩和舒张。肌肉兴奋时，SR储存的钙游离到肌浆，当肌浆Ca2+达到10-7～10-5M时，引起骨骼肌收缩；兴奋终止，SR将游离于胞浆的Ca2+重新摄取，胞浆Ca2+下降，肌肉舒张。因此肌浆网可能是肌肉疲劳的一个位点。Byrd(1989)报道，马在一次大强度运动后，肌浆网摄Ca2+能力下降49%，同时SR Ca2+-Mg2+-ATPase活性下降57%[26]。Sembrowich(1977)发现大鼠力竭运动后肌浆网摄钙率明显下降[27]。Pierce(1984)等也观察到：力竭运动显著改变了肌浆网对钙的运转[9]。所有这些报道均与本研究的结果相一致。从理论上分析，大鼠运动后SR Ca2+-ATPase活性的下降和摄钙率的降低，必然使输回SR的Ca2+量减少，速度减慢，使肌动蛋白和肌球蛋白形成的横桥分离减慢，影响肌肉的放松并造成细胞浆中游离Ca2+浓度增加，后者可以通过激活蛋白水解酶和磷酸酶等造成肌纤维蛋白的降解，进而引起肌肉收缩机能的下降，导致肌肉疲劳。本研究发现，给予牛磺酸的大鼠虽然在急性运动后即刻SR Ca2+-ATPase活性和摄钙率也有明显的降低，但降低幅度明显低于单纯运动组大鼠，仅下降18%和27%。提示牛磺酸对急性运动后造成的SR功能降低有明显的保护作用，这可能是其发挥抗运动性疲劳作用的又一重要原因。
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* 本课题为国家体育总局资助项目
4.参考文献
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(1997.09.15收稿), http://www.100md.com
单位：张宜龙 陈吉棣 (北京医科大学第三医院运动医学研究所 北京 100083)
关键词：牛磺酸；运动；自由基；生物膜；钙
中国运动医学杂志990106 提要 50只雄性Wistar大鼠(80-100g)，随机分为对照组(G1)，急性运动组(G2)，急性运动+牛磺酸组(G3)，力竭运动组(G4)，力竭运动+牛磺酸组(G5)。牛磺酸补充方式为每日灌服1次(500mg/kg)。喂养2周后，进行负重游泳，测定血液、线粒体和肌浆网各生化指标变化。结果显示“牛磺酸有增加大鼠游泳力竭时间的趋势(0.05
, 百拇医药
Effects of taurine on free radicals metabolism、membrane fluidity
and calcium transfer after acute exercise in rats
Zhang Yilong, Chen Jidi
Institute of Sports Medicine,3rd Hospital,Beijing Medical University
To observe the effects of taurine on free radicals metabolism、membrane fluidity
and calcium transfer after acute exercise,50 male Wistar rats were randomly divided into five groups as follows:control group(G1),acute exercise group(G2),acute exercise + taurine group(G3),exhaustive exercise group(G4),exhaustive exercise+ taurine group(G5).Taurine-treated animals (G3 and G5)received forced oral administration of 500 mg/kg taurine per day for two weeks by means of a cannulainserted into the esophagus.Other animals received the same amount of water each day as above.After exercise,the blood and heart samples were taken for measurement of biochemical indexes.The results showed that: 1.Taurine has the potential effect of increasing swimming exhaustion time in rats. 2.BUN was increased immediately after acute exercise while taurine reduced such an increase. 3.MDA contentsof RBC,plasma and mitochondria(Mit) were all increased after exercise while taurine prevented such an increase. 4.Mit-GPX activity was decreased immediately after acute exercise while taurine prevented the decline of the activity. 5.The fluorescence polarization of Mit was increased after acute and exhaustive exercise,while taurine could prevent such an increase. 6.SR Ca2+ ATPase activity and the rate of Ca2+ uptake were decreased immediately after exercise while taurine reduced such a decrease.The results suggested that taurine prevent the onset of fatigue by antagonizing free radicals damage,stabilizing biological membrane and regulating calcium transfer.
, 百拇医药
Key words：taurine,exercise,free radicals,biological membrane,calcium
通过以前实验研究，我们得知，牛磺酸可以减轻运动造成的脂质过氧化反应，提高运动员的运动能力[1]。本研究围绕自由基代谢、生物膜流动性、钙离子转运变化，研究牛磺酸对急性运动后血液、线粒体和肌浆网各生化指标的影响，探讨牛磺酸抗运动性疲劳的亚细胞机制。
1. 材料和方法
1.1 实验动物：选用雄性Wistar大鼠50只，体重80～100克，由北京医科大学动物部提供。常规分笼饲养，自由饮水进食。
1.2 分组、用药及运动方式：
大鼠购进后，先适应性喂养3天，同时每天进行30分钟适应性游泳训练1次，然后按体重大小随机分为5组：
, http://www.100md.com
(1)对照组(G1组)10只；(2)急性运动组(G2组)10只；(3)急性运动+牛磺酸组(G3组)10只；(4)力竭运动组(G4组)10只；(5)力竭运动+牛磺酸组(G5组)10只。 牛磺酸补充方式为G3和G5组大鼠每日灌服牛磺酸1次，剂量为500mg/kg；G1、G2、G4组大鼠每日灌服等量蒸馏水(灌胃体积为10ml/kg BW)。
经2周喂养后，各运动组大鼠负其自身体重的3%进行游泳，游泳池呈圆形，内壁光滑，直径45厘米，水深70厘米，水温35±1度。游泳分两日进行，第1日，G4和G5组大鼠游泳至力竭(在水下10秒不能上浮)后捞出；次日，G2和G3组大鼠游泳2小时，如在游泳期间发现有力竭表现，捞出水面休息5分钟后继续游泳至满2小时。
1.3 样本收集与处理：
G2和G3组大鼠游泳运动后即刻处死，同时处死对照组大鼠与力竭后24小时的G4和G5组大鼠。
, 百拇医药
样本收集：腹腔注射2%戊巴比妥-生理盐水麻醉(5ml/Kg BW)，腹主动脉取血后摘取心脏分装备用。
每只大鼠可得全血约5ml，分装3只试管：第1管为EDTA抗凝管(10%EDTA 10μl)，注入1ml全血后混匀，4℃离心制备血浆，用于血氨测定；第2管为NaF(1%NaF 0.48ml)，新鲜血20μl，混匀，用于血乳酸测定；第3管为肝素抗凝管(20单位/ml)，全血3ml，注入后混匀，4℃离心，分离血浆与RBC。血浆用于BUN及MDA测定，RBC用于SOD、GSH_Px、MDA测定。
摘取心脏后，用差速离心法分离心肌细胞线粒体和肌浆网(SR)[2，3]。
1.4 观测指标及方法：
各组大鼠体重变化。
血氨测定：Ammonia Reagent_Enzymatic Method
, 百拇医药
氨试剂盒由中国科学院生物物理所中生公司提供
血尿素氮测定：脲酶吲哚酚-终点比色法。尿素氮试剂盒由北京化工厂临床试剂分厂提供
血乳酸测定：血乳酸超微量改良法[4]
全血RBC-SOD测定：方法同前[1]
全血RBC-GSH_Px测定：方法同前[1]
全血RBC及血浆MDA测定：方法同前[1]
心肌线粒体膜脂流动性：DPH探针标记法[5]
心肌线粒体Ca2+含量测定：原子吸收法[2]
, http://www.100md.com
心肌线粒体SOD，GSH_Px，MDA测定：方法同前
线粒体蛋白定量：Bradford法[6]
肌肉肌浆网蛋白定量：Lowry法[7]
肌浆网钙泵活性测定：参照Jones等的方法[3]
肌浆网钙泵摄Ca2+率的测定[8]
1.5 统计方法：t检验
2 实验结果
2.1 一般观察指标
2.1.1 体重变化(表1)
, http://www.100md.com
2.1.2 牛磺酸对大鼠运动能力的影响
表1 大鼠体重的变化
Table 1 Changes of body weight of rats Day
G1
(n=10)
G2
(n=10)
G3
(n=10)
G4
(n=10)
G5
, http://www.100md.com
(n=10)
1
100.2±9.5
100.6±9.6
101.2±10.0
98.0±10.6
102.8±12.7
14
182.7±16.6
186.8±15.8
191.8±18.8
183.4±21.1
, http://www.100md.com
188.8±24.9
两组力竭运动大鼠平均游泳时间无显著性差异(P>0.05)，但给予牛磺酸有增加大鼠游泳力竭时间的趋势(0.05
Table 2 Changes of the exhaustive swimming time of rats 组别
Group
n
力竭游泳时间(分)
Exhaustive swimming time(min)
G4
G5
, 百拇医药
10
10
87.80+32.73
113.90+40.47
Note:G4:Exhausted group G5:taurine + exhausted group
2.2 血液NH3、BLA、BUN的变化
运动后即刻，G2组大鼠血NH3、BLA及BUN均显著高于对照组水平，G3组血NH3、BLA亦显著增加，且与G2组无显著性差异，而BUN含量与对照组比较则无显著性差异；运动后24小时，G4和G5组大鼠血NH3、BLA、BUN与对照组比较无显著性差异(P>0.05)(表3，4)。
, 百拇医药
2.3 血液MDA、SOD、GSH_Px的变化表3 运动后即刻大鼠血液NH3、BLA、BUN的变化
Table 3 Changes of blood NH3、BLA and BUN contents of rats immediately after swimming
G1
(n=10)
G2
(n=9)
G3
(n=10)
NH3(μmol/L)
, http://www.100md.com
34.69±5.09
67.37±12.74*
63.32±9.76*
BLA(mmol/L)
1.52±0.40
3.31±0.84*
3.09±0.62*
BUN(mmol/L)
5.11±0.85
6.59±0.63*
, 百拇医药
5.94±0.58#
Note:G1：control group G2:acute exercise group G3:taurine + acute exercise group
*:p<0.05,compared with G1 #:p<0.05,compared with G2表4 运动后24小时大鼠血液NH3、BLA、BUN的变化
Table 4 Changes of blood NH3、BLA and BUN contents of rats 24h after swimming
G1
(n=10)
G4
, 百拇医药
(n=8)
G5
(n=9)
NH3(μmol/L)
34.69±5.09
37.61±5.09
36.20±5.99
BLA(mmol/L)
1.52±0.40
1.60±0.37
1.65±0.34
BUN(mmol/L)
, http://www.100md.com
5.11±0.85
5.27±0.73
5.32±0.60
表5 运动后即刻大鼠血液SOD、GSH_Px活性和MDA含量变化
Table 5 Changes of blood SOD and GSH_Px activities and the MDA content of rats immediately after swimming
G1
(n=10)
G2
(n=9)
, 百拇医药 G3
(n=10)
RBC_SOD(u/gHb)
3583.84±443.63
3327.58±479.71
3410.24±425.36
RBC_GSH_Px(u/gHb)
81.97±10.35
94.08±13.31*
110.22±14.97*#
RBC_MDA(nmol/gHb)
, 百拇医药
7.52±0.51
10.05±0.62*
8.30±0.64*#
P_MDA(nmol/ml)
1.73±0.12
2.18±0.19*
2.02±.0.16*
*:P<0.05,compared with G1 #:P<0.05,compared with G2表6 运动后24小时血SOD和GSH_Px活性及MDA含量的变化
Table 6 Changes of blood SOD and GSH_Px activities and the MDA content of rats 24h after acute exercise
, 百拇医药
G1
(n=10)
G4
(n=8)
G5
(n=9)
RBC_SOD(u/gHb)
3583.84±443.63
3548.08±418.00
3633.62±346.27
RBC_GSH_Px(u/gHb)
81.97±10.35
, http://www.100md.com
83.72±9.69
96.55±9.66*#
RBC_MDA(nmol/gHb)
7.52±0.51
10.18±0.36*
7.91±0.60#
P_MDA(nmol/ml)
1.73±0.12
2.25±0.26*
2.00±0.16*＃
, 百拇医药
*:P<0.05,compared with G1 #:P<0.05,compared with G4
运动后即刻，G2和G3组大鼠RBC及血浆MDA含量均明显高于对照组水平，但给予牛磺酸可明显抑制其升高幅度；运动后24小时，G4组RBC及血浆MDA含量仍明显高于对照组，而G5组RBC-MDA含量与对照组比较已无显著性差异，血浆MDA虽高于对照组水平，但亦明显低于G4组运动后水平(P<0.05)(表5，6)。
各组大鼠运动后即刻及24小时RBC-SOD活力与对照组均无显著性差异(P>0.05)(表5，6)。
运动后即刻，G2和G3组大鼠RBC-GSH_Px活力明显高于对照组水平，给予牛磺酸可以显著增加RBC-GSH_Px的升高幅度；运动后24小时，G4组大鼠RBC-GSH_Px活力恢复至对照组水平，而G5组RBC-GSH_Px仍处于较高水平，且明显高于对照组及G4组运动后24小时的RBC-GSH_Px活力(P<0.05)(表5，6)。
, 百拇医药
2.4 线粒体各指标变化
运动后即刻，G2和G3组大鼠线粒体MDA含量均显著高于对照组水平，给予牛磺酸可以显著抑制运动后线粒体MDA的升高幅度；运动后24小时，G4组大鼠线粒体MDA含量明显高于对照组，而G5组大鼠线粒体MDA虽然也处于较高水平(0.05
Table 7 Changes of myocardial mitochondria membrane SOD GSH_Px activities and MDA，Ca2+ contents of rats immediately after swimming
G1
, 百拇医药
(n=10)
G2
(n=9)
G3
(n=10)
MDA(μmol/mg Pr.)
0.51±0.12
0.80±0.14*
0.64±0.13*#
SOD(u/mg Pr.)
126.77±17.49
, 百拇医药
129.29±16.26
112.54±12.87
GSH_Px(u/mg Pr.)
22.76±5.11
15.35±4.68*
20.10±4.74＃
Ca++(nmol/mg Pr.)
20.61±5.35
22.35±8.01
21.19±5.13
, 百拇医药
P value
0.1071±0.0119
0.1556±0.0096*
0.1310±0.0049*#
*:P<0.05,compared with G1 ＃:P<0.05,compared with G2表8 运动后24小时大鼠心肌线粒体SOD、GSH_Px活性和MDA、Ca2+含量变化
Table 8 Changes of myocardial mitochondria membrane SOD、GSH_Px activities and MDA、Ca2+ contents of rats 24h after swimming
, 百拇医药
G1
(n=10)
G4
(n=8)
G5
(n=9)
MDA(μmol/mg Pr.)
0.51±0.12
0.84±0.15*
0.61±0.11#
SOD(u/mg Pr.)
126.77±17.49
, 百拇医药
131.67±16.34
134.95±15.50
GSH_Px(u/mg Pr.)
22.76±5.11
21.24±3.59
26.03±4.83#
Ca++(nmol/mg Pr.)
20.61±5.35
22.61±5.23
20.86±3.78
, 百拇医药 P value
0.1071±0.0119
0.1384±0.0169*
0.1107±0.0101#
*:P<0.05,compared with G1 ＃:P<0.05,compared with G4
运动后即刻，G2组大鼠线粒体GSH_Px活力明显低于对照组，给予牛磺酸明显抑制了这种降低作用；运动后24小时，G4组大鼠线粒体GSH_Px活力基本恢复至对照水平，G5组则较对照组有增高趋势，且明显高于G4组运动后24小时水平(P<0.05)(表7，8)。
运动后即刻，G2组和G3组大鼠线粒体膜荧光偏振值P明显高于对照组水平，给予牛磺酸可以显著降低其升高幅度；运动后24小时，G4组大鼠荧光偏振值P明显高于对照组，而G5组则恢复至正常水平，且明显低于G4组运动后24小时线粒体膜P值(P<0.05)(表7，8)。
, 百拇医药
运动后即刻及24小时，各组大鼠线粒体SOD活力、Ca2+含量与对照组均无显著性差异(P>0.05)(表7，8)。
2.5 肌浆网钙泵功能的变化
急性运动后即刻，G2和G3组大鼠SR Ca2+-ATpase活性和ATP依赖的摄钙率明显下降，给予牛磺酸能明显抑制SR Ca2+-ATPase活性的降低，提高SR对钙的摄取率；力竭后24小时，G4和G5组大鼠SR Ca2+-ATPase活性和ATP依赖的摄钙率与对照组比较已无显著性差异(P>0.05)(表9,10)。表9 补充牛磺酸对大鼠运动后即刻SRCa2+_ATPase
和钙摄取率的影响
Table 9 Effects of taurine on SR Ca2+-ATPase and the rate of
, http://www.100md.com
calcium uptake of rat hearts immediately after swimming Group
SR Ca2+-ATPase
(μmol pi/mg pr/h)
rate of calcium uptake
(nmol Ca/mg pr/10min)
G1(n=8)
16.11±1.02
108.32±12.06
G2(n=8)
, 百拇医药
10.36±1.42*
61.74±12.33*
G3(n=8)
13.22±0.91*＃
79.23±13.99*＃
Note:*:p<0.05,compared with G1 #:p<0.05,compared with G2表10 补充牛磺酸对大鼠运动后24小时SRCa2+,ATPase
和钙摄取率的影响
Table 10 Effects of taurine on SR Ca2+,ATPase and the rate of
, http://www.100md.com
calcium uptake of rat hearts 24h after swimming Group
SR Ca2+-ATPase
(μmol pi/mg pr/h)
Rate of Calcium uptake
(nmol Ca/mg pr/10min)
G1(n=8)
16.11±1.02
108.32±12.06
G4(n=8)
15.68±0.96
, 百拇医药
101.21±17.49
G5(n=8)
16.24±0.97
111.95±11.62
3 讨论
以耗竭性游泳为运动模型进行运动疲劳机制的研究已经被国内外很多学者采用[9，10]。但考虑到耗竭运动后即刻各大鼠体内生化指标可能发生比较类似的变化，难以对牛磺酸的运动保护作用进行观测，本研究选用定量游泳方式……负重3%游泳2小时，来观察牛磺酸对运动后即刻各指标变化的影响。而对耗竭性游泳大鼠进行恢复期观测，即牛磺酸对运动后24小时各指标变化的影响。同时记录游泳耗竭时间，评估运动能力。
本研究结果显示，两组耗竭性游泳大鼠平均游泳时间无显著性差异(P>0.05)，但给予牛磺酸有增加大鼠游泳力竭时间的趋势(0.05
, 百拇医药
血乳酸、血氨作为肌肉活动的重要代谢产物，是重要的疲劳物质。其在体内的蓄积将导致内环境的紊乱，从而影响肌肉的收缩功能。本实验结果显示，大鼠经2小时负重游泳后，血乳酸和血氨浓度均比对照组明显提高(P<0.05)，提示此运动量可使大鼠产生一定程度的疲劳。给予牛磺酸未见对运动中血乳酸、血氨的生成有明显的抑制作用。
BUN是蛋白质代谢的重要产物。蛋白质虽为机体的主要结构部分，但在一定条件下也参与能量代谢。运动后，血BUN的增量大小，提示机体利用蛋白质供能的程度。蛋白质作为能源储备被利用时，其被利用的程度则是机体适应力大小的指标之一。机体的适应力越强，所动用的蛋白质就越少，因而体内BUN的生成也就越少。反之，机体的适应力弱时，则被动用的蛋白质就多。大鼠经2小时负重游泳后，血BUN含量明显增加，给予牛磺酸对BUN的升高有明显抑制作用，使运动后BUN含量与对照组比较已无显著性差异。说明牛磺酸可以降低大鼠运动时的蛋白质供能程度，提示牛磺酸具有提高机体适应能力的作用。力竭运动后24小时，各组大鼠血BUN水平与对照组比较均无显著性差异。
, 百拇医药
MDA作为自由基与不饱和脂肪酸反应生成的代谢产物，常被用来间接反应机体的自由基代谢的变化。研究表明，运动可导致体内脂质过氧化物水平增高[12]。本研究分别对血浆、RBC和心肌细胞线粒体的MDA含量进行了测定，结果发现：大鼠负重游泳后即刻及力竭后24小时，三者均显著性增高(P<0.05)，给予牛磺酸可以明显阻断体内MDA的生成。运动后即刻，运动+牛磺酸组大鼠RBC及心肌细胞线粒体MDA含量较单纯运动组显著降低；力竭后24小时，给予牛磺酸的大鼠，无论血浆、RBC还是线粒体，MDA含量均明显低于单纯力竭组大鼠，其RBC和线粒体MDA含量与对照组比较已无显著性差异。表明牛磺酸可有效地对抗运动引起的脂质过氧化，对运动机体发挥重要的保护作用。Morales等人的体外研究发现，牛磺酸可以明显减少脂质过氧化产物MDA的形成，减少生物膜损伤[13—16]。侯等人的研究也发现，无论是在血浆还是在心肌，牛磺酸都可以阻断运动所致的MDA生成[17]。
生物体不断产生自由基，引起脂质过氧化作用加强的同时，自由基清除系统的活性也在不断变化。但由于自由基损伤的非特异性，对于不同的运动条件，以及不同的组织和器官，机体自由基代谢和抗氧化酶的变化是有差异的[18—19]。本研究并未发现大鼠急性负荷游泳后血液及心肌线粒体SOD活性的变化。
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GSH_Px是机体又一种重要的抗氧化酶，分解过氧化氢和脂质过氧化物，阻止自由基氧化链式反应。本研究结果表明，大鼠游泳后即刻，RBC_GSH_Px活性显著高于对照组，牛磺酸对其升高有明显的促进作用。甚至力竭后24小时，给予牛磺酸的大鼠RBC-GSH_Px活力仍显著高于对照组水平。心肌线粒体GSH_Px的测定表明，经2小时负重游泳后，大鼠心肌线粒体GSH_Px活力明显降低，与MDA的变化成反平行关系，可能是与线粒体自由基代谢水平较高，造成自由基生成过多，并对蛋白质产生毒性作用有关。给予牛磺酸可以明显抑制心肌线粒体GSH_Px的这种降低作用，使运动后即刻，心肌线粒体GSH_Px与对照组无显著性差异。另外，牛磺酸可明显促进力竭运动后心肌线粒体GSH_Px活力的恢复，使力竭后24小时心肌线粒体GSH_Px水平显著高于对照组水平，牛磺酸对GSH_Px的这种作用机制尚需进一步研究。
脂质过氧化物对生物膜造成许多不良影响[20]。已有研究表明，急性运动诱发内源性自由基生成增多及脂质过氧化反应增强，构成对细胞膜系统结构的损伤，可能与运动性损伤和运动性疲劳的形成有关[21—24]。本研究用稳态荧光偏振技术，对负重游泳的大鼠心肌线粒体膜进行研究发现，无论在运动后即刻，还是力竭后24小时，大鼠心肌线粒体膜流动性均显著下降。给予牛磺酸可以明显抑制膜流动性的降低，甚至力竭运动后24小时，牛磺酸组大鼠心肌线粒体膜流动性已基本恢复至对照组水平。生物膜流动性变化会影响电子传递和偶联磷酸化的进行。Hackenbrock(1981)提出，呼吸链的电子转移是依赖于该链组份的侧向扩散与分子相互碰撞而实现的。这就要求线粒体膜有合适的流动性。Slarter等(1985)提出“碰撞假说”，即电子传递和偶联磷酸化过程均依赖呼吸链成分和ATP酶的碰撞过程。本研究结果提示，牛磺酸可有效抑制急性运动后心肌线粒体膜过氧化脂质增加，从而减少过氧化产物MDA进入膜双层结构的水相，与膜蛋白、膜脂上的NH2交联形成Schiff's碱而降低膜流动性，保护多种膜蛋白的脂微环境，充分发挥生物膜的各种生理功能，进而减轻运动性疲劳和促进运动后疲劳的消除。
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近年来，有关细胞钙离子化谢对机体机能影响的研究十分活跃。大量医学和生物学研究表明，细胞钙代谢紊乱是引起机能异常的重要原因[24，25]。心肌细胞 肌浆网和线粒体对细胞内钙离子的调控起着重要的作用。本研究以心肌为材料，观察了急性运动后线粒体钙含量及SR Ca2+-ATPase活性和摄钙率的变化情况，并研究了牛磺酸对此变化的影响。结果表明，急性运动后未见心肌线粒体钙含量发生显著变化，而SR C2+-ATPase活性和摄钙率在负重游泳后即刻明显下降，分别比对照组下降36%和43%。肌浆网是细胞内的钙贮存库，它通过对Ca2+的释放和聚集，调节肌细胞的收缩和舒张。肌肉兴奋时，SR储存的钙游离到肌浆，当肌浆Ca2+达到10-7～10-5M时，引起骨骼肌收缩；兴奋终止，SR将游离于胞浆的Ca2+重新摄取，胞浆Ca2+下降，肌肉舒张。因此肌浆网可能是肌肉疲劳的一个位点。Byrd(1989)报道，马在一次大强度运动后，肌浆网摄Ca2+能力下降49%，同时SR Ca2+-Mg2+-ATPase活性下降57%[26]。Sembrowich(1977)发现大鼠力竭运动后肌浆网摄钙率明显下降[27]。Pierce(1984)等也观察到：力竭运动显著改变了肌浆网对钙的运转[9]。所有这些报道均与本研究的结果相一致。从理论上分析，大鼠运动后SR Ca2+-ATPase活性的下降和摄钙率的降低，必然使输回SR的Ca2+量减少，速度减慢，使肌动蛋白和肌球蛋白形成的横桥分离减慢，影响肌肉的放松并造成细胞浆中游离Ca2+浓度增加，后者可以通过激活蛋白水解酶和磷酸酶等造成肌纤维蛋白的降解，进而引起肌肉收缩机能的下降，导致肌肉疲劳。本研究发现，给予牛磺酸的大鼠虽然在急性运动后即刻SR Ca2+-ATPase活性和摄钙率也有明显的降低，但降低幅度明显低于单纯运动组大鼠，仅下降18%和27%。提示牛磺酸对急性运动后造成的SR功能降低有明显的保护作用，这可能是其发挥抗运动性疲劳作用的又一重要原因。
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* 本课题为国家体育总局资助项目
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(1997.09.15收稿), http://www.100md.com