诊断超声对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的研究
作者：杜联芳 张青萍 刘望彭
单位：杜联芳 张青萍(430030 武汉同济医科大学附属同济医院超声科)；刘望彭(山西医科大学第一医院)
关键词：超声；细胞凋亡；睾丸；大鼠
中国超声医学杂志000103
摘 要 目的：检测诊断超声不同时间照射后对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响。方法：应用HP8500彩色多普勒诊断仪〔探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW,空间平均时间平均声强(Isata)3.4mW/cm2〕固定持续照射大鼠睾丸组织，分为5分钟组、10分钟组、20分钟组、30分钟组和空照组。照射后24小时取睾丸，应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术检测上述各组凋亡细胞。结果：超声持续照射5分钟组与对照组凋亡细胞数无差异(P>0.05)，其余3组凋亡细胞数都明显增加，30分钟最高达12.86±3.18/1000×油镜，显著高于其它各组(P<0.001)。结论：诊断超声持续照射大鼠睾丸组织10分钟以上可引起睾丸生殖细胞凋亡。
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Study of Diagnostic Ultrasound Effect Causing Rat Testicular Germ Cell Apoptosis
Du Lianfang,Zhang Qingping
Dept.Ultrasound,Tongji Hospital,Tongji Medical University Wuhan 430030
Liu Wangpeng
The First Hospital of Shanxi Medical Universit Taiyuan 030001
ABSTRACT Objective:To detect the effects of rat testicular germ cell apoptosis caused by diagnostic ultrasound.Methods：Thirty male Spraque-Danles rats(post-birth 28-30days,70±5g)were irradiated by diagnostic ultrasound and randomly separated into equal five groups.Control group was blank of radiation,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ groups were respectively irradiated for 5 minutes,10 minutes,20 minutes and 30 minutes.Color coded Doppler sonography(HP 8500)was performed with 7.5MHz linear phased array transducer.Ultrasonic output power was 6.8mW,intensity space average time average(Isata)was 3.4mW/cm2.All testes were removed at 24 hours after irradiation and fixed in 10% neutral buffered formalin,paraffin-embedded.Testicular apoptosis cells were detected by in situ terminal deoxynucleotityl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results:There was no difference between 5 minutes radiation group and normal control group(P>0.05).Apoptosis cells in the other groups increased markably,especially 30 minutes group,apoptosis cells reached to 12.86±3.18/1000x oil higher than others(P<0.001).Conclusion:Continuous irradiation over 10 minutes by diagnostic ultrasound may result in rats testicular germ cell apoptosis.
, 百拇医药
KEY WORDS Ultrasound Apoptosis Testes Rat
诊断超声对动物睾丸组织的影响，以往主要集中于各级精细胞的结构观察。本实验应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(in situ terminal deoxynucleotityl transferase-mediated dUTP nick end labeling TUNEL)技术观察诊断超声不同时间照射大鼠睾丸组织后各级精细胞的凋亡变化，探讨诊断超声与细胞凋亡之间的关系。
资料与方法
实验动物分组：健康SD雄性大鼠30只(山西医科大学实验动物中心提供)，年龄出生后28～30天，体重65～75克，随机分为五组：对照组，Ⅰ组(5分钟)，Ⅱ组(10分钟)，Ⅲ组(20分钟)，Ⅳ组(30分钟)。
实验仪器：HP8500型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，空间平均时间平均声强(Isata)为3.4mW/cm2。该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1毫瓦级超声功率计测试。
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动物模型及标本制备：采用特制支架，将大鼠仰卧固定于三合板上，探头置于会阴部，直接接触睾丸，固定持续照射，根据分组不同，分别进行空照5分钟、10分钟、20分钟、30分钟照射，辐照后24小时用3%戊巴比妥钠30～50mg/kg腹腔注射，麻醉后取出睾丸，于10%福尔马林溶液中固定24小时，常规石蜡包埋，切片(4μm)，将切片捞于预先涂有粘片剂的载玻璃片上，56℃烤箱烘干30分钟。
TUNEL技术：对上述特殊处理的石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度洒精入水，0.01M PBS漂洗5分钟×3次，TUNEL试剂盒(由德国Boechringer Mannheim公司提供)的酶溶液与标记液以1∶9混合后滴于标本上，37℃水浴箱反应75分钟，0.01M PBS漂洗5分钟×3次，加Buffer Ⅱ 37℃水浴箱30分钟，加AP-POD 37℃水浴箱40分钟，在荧光显微镜下观察凋亡细胞。0.01M PBS漂洗5分钟×3次，加底物37℃水浴相箱避光反应30分钟，双蒸水终止反应，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶树脂封片。阴性对照组，标本上只加标记液，不加酶溶液，其余各步同上。光学显微镜下观察凋亡细胞并计数，每张切片选10个高倍视野(1000x)，计数正常细胞和凋亡细胞，求出百分比。
, 百拇医药
统计分析：各辐照组间及辐照组与对照组间凋亡细胞比较采用x2检验。
结果
对照组及超声持续照射5分钟组，睾丸生殖细胞偶见凋亡现象(图1)；持续照射10分钟组，凋亡细胞数达4.72±1.46个/1000×油镜；持续照射20分钟，凋亡细胞数继续增加达7.28±2.07/1000×油镜(图2)；持续照射30分钟组，凋亡细胞更进一步增加达12.86±3.18个/1000×油镜.实验组及对照组凋亡细胞计数及比较见表1。
图1 正常对照组睾丸组织偶见凋亡细胞，细胞核呈棕褐色改变(1000×油镜)
图2 诊断超声照射20分钟，睾丸组织凋亡细胞数量增加达7.28±2.07(1000×油镜)
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表1 辐照与对照组凋亡细胞比较表(
±s) 组 别
凋亡细胞数/1000×
凋亡细胞百分比(%)
对照组(n＝6)
Ⅰ组(n＝6)
Ⅱ组(n＝6)
Ⅲ组(n＝6)
Ⅳ组(n＝6)
0.85±0.51
0.78±0.53
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4.72±1.46*
7.28±2.07*
12.86±3.18*
0.67±0.19
0.60±0.23
2.81±1.25*
4.04±2.13*
7.64±3.85*
*表示与对照组及各辐照组相比P<0.01
讨论
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细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death),它是由英国的Kerr等最初在1972年提出的，用描述一种在形态学上有别于细胞坏死(Necrosis)的细胞死亡过程〔1〕。细胞坏死时，表现细胞肿大、胀裂、胞内物质溢出，导致周围组织发生炎症，是当细胞受到急性伤害时发生。而细胞凋亡是一种主动的正常死亡，以维持细胞群体数量自身稳定平衡。凋亡细胞有其明显的形态学和生物化学的特征，其病理形态学特点为细胞核与细胞浆收缩，细胞膜多处突起，但细胞膜及细胞内的细胞器完整，故细胞内的溶解酶不外逸，不引起炎症反应和瘢痕形成，对附近的细胞也无损害。凋亡时，细胞分裂成为具有完整膜的多数小体，称为凋亡小体，最后被吞噬细胞所吞灭而不留任何痕迹。
精子发生是睾丸精原干细胞增殖、分化，依次经过精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞最后形成精子的发展过程。九十多年前Regaud首先认识到在精子发生过程中存在着生精细胞的退化变性(degeneration)。以后的研究显示，生精过程中实际产生的精子数量比理论上预测的精子数量减少了约25～75%，生精细胞的退变是造成该现象的原因，进一步的研究证实这种退变就是凋亡〔2〕。
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多种因素和外来刺激包括缺血、γ-射线照射、输精管切除术、甲状腺机能减退、促性腺激素撤退、HCG治疗隐睾等均可引起睾丸生殖细胞的凋亡〔3～7〕。1997年美国Harvard大学的研究人员，进行了温度诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡的研究，将一侧睾丸人为地固定在腹腔内前腹壁上，而另一侧睾丸仍留在阴囊内作为正常温度对照组，使用Western blot分析方法，观察温度对细胞周期调节物的表达改变，结果在15天研究期间，阴囊内睾丸重量始终无变化，而腹腔内睾丸在头7天没有变化，7天后重量开始下降，最后两天下降达40%，生殖细胞数量减少的组织学证据仅在实验的第7天后表现明显，而P53蛋白质的表达改变早于生殖细胞数量减少1～2天，而阴囊内睾丸无上述表现。表明P53诱导的细胞凋亡在温度介导的生殖细胞数量减少方面起着重要作用〔8〕。
一侧睾丸扭转可致双侧睾丸损伤。1998年瑞士学者F.Hadziselimovic等人对17例睾丸扭转患者(年龄14～34岁，扭转距手术时间为0.5～11小时)进行单测扭转缓解术，并行双侧睾丸活检，对照组为3例疑为不育症而接受睾丸活检的患者，用TUNEL技术对活检标本进行凋亡检测。结果所有患者扭转对侧睾丸的凋亡发生率都比对照组增加，凋亡主要发生在精母细胞，早期和晚期精细胞和Sertoli's细胞，而精原细胞，管周结缔组织(纤维细胞和肌纤维细胞)及内皮细胞很少发生凋亡，Leydig细胞凋亡较精母细胞少见〔9〕。
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本文观察诊断超声对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响，发现随照射时间延长，睾丸生殖细胞凋亡数量增加，对照组和持续5分钟照射组细胞凋亡数量无差异(P>0.05)，而从持续照射10分钟开始，凋亡细胞数量持续增加，30分钟组凋亡细胞数最多达12.86±3.18/1000×油镜，显著高于其它各组(P<0.001)，有统计学意义。而且凋亡细胞主要发生在精母细胞，但精原细胞和管周结缔组织等细胞末见凋亡现象，与F.Hadziselimovic等人的研究结果相似。提示超声工作者，对睾丸这种敏感组织进行超声检查时，应特别注意严格掌握适应症，照射时间不应达到或超过10分钟，以免引起生殖细胞凋亡。
参考文献
1.Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR. Apoptosis:A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kineties.Br J Cancer,1972,26:239～357
, http://www.100md.com
2.Jaladanki N.Rao,Luciano Debeljuk,Andrzej Bartke.Effects of tachykinins on the secretory activity of rat Sertoli cells in vitro.Endocrinology,1995,136:1315～1318
3.Lue Y,Hikim AP,Wang C,et al.Early effects of vasectomy on testicular structure and on germ cell and macrophage apoptosis in the hamster.J Androl,1997,18:166～173
4.Hikim AP,Lue Y,Swerdloff RS.Separation of germ cell apoptosis from toxin-induced cell death by necrosis using in situ end-labeling histochemistry after glutaraldehyde fixation.Tissue Cell.1997,29:487～493
, 百拇医药
5.Hasegawa M,Wilson G,Russell LD,etal.Radiation-induced cell death in the mouse testis:Relationship to apoptosis,Radiat Res,1997,147:457～467
6.Turner TT,Tung KS,Tomomasa,et al.Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat.Biol Reprod,1997,57:267～274
7.Leo Dunkel,Seppo Taskinen ,Outi Hovatta,et al.Germ cell apoptosis after treatment of cryptorchidism with human chorionic gonadotropin is associated with impaired reproductive function in the adult.J Clin Invest,1997,100:2341～2346
, 百拇医药
8.Steven A.Socher,Yizhong Yin,William C,et al.Temperature-mediated germ cell loss in the testis is associated with altered expression of the cell-cycle regulator P53.J Urology,1997,157:1986～1989
9.Hadiselimovic F.,Geneto R.,Emmons L R.Increase apoptosis in the contralateral testes of patients with testicular torsion as a factor for infertility.J Urology,1998,160:1158～1160
1999-06-04, http://www.100md.com
单位：杜联芳 张青萍(430030 武汉同济医科大学附属同济医院超声科)；刘望彭(山西医科大学第一医院)
关键词：超声；细胞凋亡；睾丸；大鼠
中国超声医学杂志000103
摘 要 目的：检测诊断超声不同时间照射后对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响。方法：应用HP8500彩色多普勒诊断仪〔探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW,空间平均时间平均声强(Isata)3.4mW/cm2〕固定持续照射大鼠睾丸组织，分为5分钟组、10分钟组、20分钟组、30分钟组和空照组。照射后24小时取睾丸，应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术检测上述各组凋亡细胞。结果：超声持续照射5分钟组与对照组凋亡细胞数无差异(P>0.05)，其余3组凋亡细胞数都明显增加，30分钟最高达12.86±3.18/1000×油镜，显著高于其它各组(P<0.001)。结论：诊断超声持续照射大鼠睾丸组织10分钟以上可引起睾丸生殖细胞凋亡。
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Study of Diagnostic Ultrasound Effect Causing Rat Testicular Germ Cell Apoptosis
Du Lianfang,Zhang Qingping
Dept.Ultrasound,Tongji Hospital,Tongji Medical University Wuhan 430030
Liu Wangpeng
The First Hospital of Shanxi Medical Universit Taiyuan 030001
ABSTRACT Objective:To detect the effects of rat testicular germ cell apoptosis caused by diagnostic ultrasound.Methods：Thirty male Spraque-Danles rats(post-birth 28-30days,70±5g)were irradiated by diagnostic ultrasound and randomly separated into equal five groups.Control group was blank of radiation,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ groups were respectively irradiated for 5 minutes,10 minutes,20 minutes and 30 minutes.Color coded Doppler sonography(HP 8500)was performed with 7.5MHz linear phased array transducer.Ultrasonic output power was 6.8mW,intensity space average time average(Isata)was 3.4mW/cm2.All testes were removed at 24 hours after irradiation and fixed in 10% neutral buffered formalin,paraffin-embedded.Testicular apoptosis cells were detected by in situ terminal deoxynucleotityl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results:There was no difference between 5 minutes radiation group and normal control group(P>0.05).Apoptosis cells in the other groups increased markably,especially 30 minutes group,apoptosis cells reached to 12.86±3.18/1000x oil higher than others(P<0.001).Conclusion:Continuous irradiation over 10 minutes by diagnostic ultrasound may result in rats testicular germ cell apoptosis.
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KEY WORDS Ultrasound Apoptosis Testes Rat
诊断超声对动物睾丸组织的影响，以往主要集中于各级精细胞的结构观察。本实验应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(in situ terminal deoxynucleotityl transferase-mediated dUTP nick end labeling TUNEL)技术观察诊断超声不同时间照射大鼠睾丸组织后各级精细胞的凋亡变化，探讨诊断超声与细胞凋亡之间的关系。
资料与方法
实验动物分组：健康SD雄性大鼠30只(山西医科大学实验动物中心提供)，年龄出生后28～30天，体重65～75克，随机分为五组：对照组，Ⅰ组(5分钟)，Ⅱ组(10分钟)，Ⅲ组(20分钟)，Ⅳ组(30分钟)。
实验仪器：HP8500型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，空间平均时间平均声强(Isata)为3.4mW/cm2。该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1毫瓦级超声功率计测试。
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动物模型及标本制备：采用特制支架，将大鼠仰卧固定于三合板上，探头置于会阴部，直接接触睾丸，固定持续照射，根据分组不同，分别进行空照5分钟、10分钟、20分钟、30分钟照射，辐照后24小时用3%戊巴比妥钠30～50mg/kg腹腔注射，麻醉后取出睾丸，于10%福尔马林溶液中固定24小时，常规石蜡包埋，切片(4μm)，将切片捞于预先涂有粘片剂的载玻璃片上，56℃烤箱烘干30分钟。
TUNEL技术：对上述特殊处理的石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度洒精入水，0.01M PBS漂洗5分钟×3次，TUNEL试剂盒(由德国Boechringer Mannheim公司提供)的酶溶液与标记液以1∶9混合后滴于标本上，37℃水浴箱反应75分钟，0.01M PBS漂洗5分钟×3次，加Buffer Ⅱ 37℃水浴箱30分钟，加AP-POD 37℃水浴箱40分钟，在荧光显微镜下观察凋亡细胞。0.01M PBS漂洗5分钟×3次，加底物37℃水浴相箱避光反应30分钟，双蒸水终止反应，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶树脂封片。阴性对照组，标本上只加标记液，不加酶溶液，其余各步同上。光学显微镜下观察凋亡细胞并计数，每张切片选10个高倍视野(1000x)，计数正常细胞和凋亡细胞，求出百分比。
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统计分析：各辐照组间及辐照组与对照组间凋亡细胞比较采用x2检验。
结果
对照组及超声持续照射5分钟组，睾丸生殖细胞偶见凋亡现象(图1)；持续照射10分钟组，凋亡细胞数达4.72±1.46个/1000×油镜；持续照射20分钟，凋亡细胞数继续增加达7.28±2.07/1000×油镜(图2)；持续照射30分钟组，凋亡细胞更进一步增加达12.86±3.18个/1000×油镜.实验组及对照组凋亡细胞计数及比较见表1。
图1 正常对照组睾丸组织偶见凋亡细胞，细胞核呈棕褐色改变(1000×油镜)
图2 诊断超声照射20分钟，睾丸组织凋亡细胞数量增加达7.28±2.07(1000×油镜)
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表1 辐照与对照组凋亡细胞比较表(
±s) 组 别凋亡细胞数/1000×
凋亡细胞百分比(%)
对照组(n＝6)
Ⅰ组(n＝6)
Ⅱ组(n＝6)
Ⅲ组(n＝6)
Ⅳ组(n＝6)
0.85±0.51
0.78±0.53
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4.72±1.46*
7.28±2.07*
12.86±3.18*
0.67±0.19
0.60±0.23
2.81±1.25*
4.04±2.13*
7.64±3.85*
*表示与对照组及各辐照组相比P<0.01
讨论
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细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death),它是由英国的Kerr等最初在1972年提出的，用描述一种在形态学上有别于细胞坏死(Necrosis)的细胞死亡过程〔1〕。细胞坏死时，表现细胞肿大、胀裂、胞内物质溢出，导致周围组织发生炎症，是当细胞受到急性伤害时发生。而细胞凋亡是一种主动的正常死亡，以维持细胞群体数量自身稳定平衡。凋亡细胞有其明显的形态学和生物化学的特征，其病理形态学特点为细胞核与细胞浆收缩，细胞膜多处突起，但细胞膜及细胞内的细胞器完整，故细胞内的溶解酶不外逸，不引起炎症反应和瘢痕形成，对附近的细胞也无损害。凋亡时，细胞分裂成为具有完整膜的多数小体，称为凋亡小体，最后被吞噬细胞所吞灭而不留任何痕迹。
精子发生是睾丸精原干细胞增殖、分化，依次经过精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞最后形成精子的发展过程。九十多年前Regaud首先认识到在精子发生过程中存在着生精细胞的退化变性(degeneration)。以后的研究显示，生精过程中实际产生的精子数量比理论上预测的精子数量减少了约25～75%，生精细胞的退变是造成该现象的原因，进一步的研究证实这种退变就是凋亡〔2〕。
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多种因素和外来刺激包括缺血、γ-射线照射、输精管切除术、甲状腺机能减退、促性腺激素撤退、HCG治疗隐睾等均可引起睾丸生殖细胞的凋亡〔3～7〕。1997年美国Harvard大学的研究人员，进行了温度诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡的研究，将一侧睾丸人为地固定在腹腔内前腹壁上，而另一侧睾丸仍留在阴囊内作为正常温度对照组，使用Western blot分析方法，观察温度对细胞周期调节物的表达改变，结果在15天研究期间，阴囊内睾丸重量始终无变化，而腹腔内睾丸在头7天没有变化，7天后重量开始下降，最后两天下降达40%，生殖细胞数量减少的组织学证据仅在实验的第7天后表现明显，而P53蛋白质的表达改变早于生殖细胞数量减少1～2天，而阴囊内睾丸无上述表现。表明P53诱导的细胞凋亡在温度介导的生殖细胞数量减少方面起着重要作用〔8〕。
一侧睾丸扭转可致双侧睾丸损伤。1998年瑞士学者F.Hadziselimovic等人对17例睾丸扭转患者(年龄14～34岁，扭转距手术时间为0.5～11小时)进行单测扭转缓解术，并行双侧睾丸活检，对照组为3例疑为不育症而接受睾丸活检的患者，用TUNEL技术对活检标本进行凋亡检测。结果所有患者扭转对侧睾丸的凋亡发生率都比对照组增加，凋亡主要发生在精母细胞，早期和晚期精细胞和Sertoli's细胞，而精原细胞，管周结缔组织(纤维细胞和肌纤维细胞)及内皮细胞很少发生凋亡，Leydig细胞凋亡较精母细胞少见〔9〕。
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本文观察诊断超声对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响，发现随照射时间延长，睾丸生殖细胞凋亡数量增加，对照组和持续5分钟照射组细胞凋亡数量无差异(P>0.05)，而从持续照射10分钟开始，凋亡细胞数量持续增加，30分钟组凋亡细胞数最多达12.86±3.18/1000×油镜，显著高于其它各组(P<0.001)，有统计学意义。而且凋亡细胞主要发生在精母细胞，但精原细胞和管周结缔组织等细胞末见凋亡现象，与F.Hadziselimovic等人的研究结果相似。提示超声工作者，对睾丸这种敏感组织进行超声检查时，应特别注意严格掌握适应症，照射时间不应达到或超过10分钟，以免引起生殖细胞凋亡。
参考文献
1.Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR. Apoptosis:A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kineties.Br J Cancer,1972,26:239～357
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2.Jaladanki N.Rao,Luciano Debeljuk,Andrzej Bartke.Effects of tachykinins on the secretory activity of rat Sertoli cells in vitro.Endocrinology,1995,136:1315～1318
3.Lue Y,Hikim AP,Wang C,et al.Early effects of vasectomy on testicular structure and on germ cell and macrophage apoptosis in the hamster.J Androl,1997,18:166～173
4.Hikim AP,Lue Y,Swerdloff RS.Separation of germ cell apoptosis from toxin-induced cell death by necrosis using in situ end-labeling histochemistry after glutaraldehyde fixation.Tissue Cell.1997,29:487～493
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5.Hasegawa M,Wilson G,Russell LD,etal.Radiation-induced cell death in the mouse testis:Relationship to apoptosis,Radiat Res,1997,147:457～467
6.Turner TT,Tung KS,Tomomasa,et al.Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat.Biol Reprod,1997,57:267～274
7.Leo Dunkel,Seppo Taskinen ,Outi Hovatta,et al.Germ cell apoptosis after treatment of cryptorchidism with human chorionic gonadotropin is associated with impaired reproductive function in the adult.J Clin Invest,1997,100:2341～2346
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8.Steven A.Socher,Yizhong Yin,William C,et al.Temperature-mediated germ cell loss in the testis is associated with altered expression of the cell-cycle regulator P53.J Urology,1997,157:1986～1989
9.Hadiselimovic F.,Geneto R.,Emmons L R.Increase apoptosis in the contralateral testes of patients with testicular torsion as a factor for infertility.J Urology,1998,160:1158～1160
1999-06-04, http://www.100md.com