微量海人藻酸刺激大鼠延髓网状背侧亚核后脊髓和三叉神经脊束核尾侧亚核内c-fos的表达**
作者：凌树才** 李云庆 施际武
单位：第四军医大学解剖学教研室 梁銶琚脑研究中心，西安 710032；**南通医学院神经生物学研究室，南通 226001
关键词：延髓网状背侧亚核；下行通路；海人藻酸；c-fos；BSI-B4；大鼠
解剖学报980304 摘 要 为了观察起自延髓网状背侧亚核(SRD)的下行投射对脊髓和三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)神经元活动的影响，将微量海人藻酸注入大鼠SRD中，致SRD神经元兴奋，在SRD下行通路的作用部位引起c-fos的表达。实验结果表明，在注射后30min，脊髓灰质内出现Fos阳性神经元，1.5～2h时达高峰，4h后明显减少。在高峰期，同一脊髓节段的不同板层内Fos阳性神经元的密度不同：Ⅰ、Ⅱ层>Ⅲ、Ⅳ层>Ⅴ～Ⅹ Ⅱ、Ⅹ层，Ⅷ、Ⅸ层中偶见。Vc内Fos阳性神经元的出现时间和分布与脊髓后角相似。上述结果提示，SRD发出的下行纤维主要调控脊髓和Vc(尤其是浅层)中的神经活动。
, 百拇医药
近年来电生理研究资料表明，延髓网状背侧亚核(subnucleus reticularis dorsalis,SRD)是参与“弥散型伤害性抑制调控”(diffuse noxious inhibitory controls,DNIC)的重要核团[1,2]。形态学研究结果也表明，在SRD与脊髓之间存在着往返纤维联系构成的神经环路，并且认为这种环路是DNIC调控的结构基础[3~5]。然而伤害性信息的调控较复杂，常常涉及到多级神经元的多突触联系，但目前常用的示踪剂很难跨突触转运，只能反应某核团的一级联系，要完整地显示一条神经通路需多次追踪才能完成，而且还不能直接说明其功能上的联系，1987年Morgan[6]等创立了c-fos原癌基因表达法，在神经科学领域已被广泛的应用，包括用于检测外周受伤害性刺激激活的中枢多极神经元功能通路。最近也有用微量海人藻酸注入大鼠中缝大核导致脊髓神经元c-fos表达的报道[7]。为了观察SRD在功能上与脊髓和Vc中的哪些板层的核团发生联系，本研究将微量海人藻酸注入SRD，使SRD神经元发生兴奋，经过一定时间后，观察脊髓和Vc中Fos阳性神经元的分布。
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材料和方法
雄性SD大鼠16只，体重200～300g，分为实验组(n=14)和对照组(n=4)。
1.实验组
1.1 动物准备：将动物置于温暖、安静、避强光的环境下饲养1周，使之完全适应周围环境，以维持良好的基础状态。
1.2 手术过程：先用乙醚诱导麻醉，然后肌注Ketamine(0.5ml/只)维持麻醉，手术暴露闩平面以下的延髓，直视下用微玻管将生理盐水配制的0.1μl海人藻酸(20μmol/L，其中加少量台盼蓝)注入一侧SRD。手术过程在10min内完成，术后将动手放回术前相同的环境中，动物在术后3～5min清醒，分别存活30min(n=2)，1h(n=2),1.5h(n=6),2h(n=2),4h(n=2)。这期间注意观察动物的状态和行为变化。
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1.3 材料制备：各组实验动物成活至预定的成活期，用戊巴比妥钠深麻，开胸，经升主动脉依次灌注生理盐水100～150ml及含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1mol/L PB(pH7.4)500ml，灌毕立即取延髓和脊髓的代表性节段(C[5～6],T[4～5],L[3～6]及S[2～4])并浸入30%蔗糖(0.1mol/L PB配制)中过夜(4℃)，冠状冻切，片厚30μm，隔4片取1，取3组收集于0.01mol/L PBS内。
1.4 Fos免疫组织化学染色：第1，2组切片分别入(1)羊抗Fos血清(Cambridge Res Bio Chiemical,UK,1∶1 4 000)，用含0.2%Triton X-100的PBS稀释，室温下孵育1h后移入冰箱(4℃)中孵育48h；(2)生物素结合的兔抗羊IgG(Vector,1∶200，PBS稀释)，室温下孵育4h；(3)Avidin-HRP(Vector,1∶300,PBS稀释)室温下孵育2h。以上各步骤之间均用PBS漂洗3次，每次5min，最后按GOD-DAB-Ni法呈色，反应时间为20～25min。将第1组切片裱片，晾干，脱水，透明，DPX封片，Olympus显微镜观察并摄片。为了分析Fos阳性神经元与初级传入C纤维终末的关系，将第2组切片在完成上述染色后，置入BSI-B4(Bandeiraea Simplicifolia Isolectin-B4)-HRP(1∶8 000,Sigma)，室温下孵育3h切片，再用DAB-H2O2方法呈色。第3组切片行Nissl染色。
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1.5 脊髓内Fos样阳性胞核分布的图像分析：将Leica Q500MC图像分析仪的摄相系统连接于Olympus BX-50光学显微镜上，对灰度值6～12区间的Fos阳性胞核按核团或板层层次分布进行观察分析，自动记录出其数目和面积的百分比,得出脊髓灰质各层内c-fos表达的密度。为了便于分析，根据图像分析得出的结果(Fos阳性胞核面积占测量总面积的百分比),将脊髓灰质各层中的Fos阳性胞核的密度分成以下几个等级：++++ ·(>12%)、+++ ·(9%～12%)、++ ·(5%～8%)、+ ·(1～4)、±(偶见)。
2.对照实验
2.1 手术对照(n=2)：动物术前的饲养环境、手术过程及染色程序与实验组完全相同，只是注射液不含海人藻酸，动物术后成活1.5h。
2.2 Fos免疫组织化学对照(n=2)：取1套实验组大鼠的切片，用正常羊血清(1∶100)代替一抗，其余步骤不变。
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结果
实验组动物接受海人酸注射后3～5min即清醒，伴轻度的躁动不安和探究活动增加，这种行为变化一般持续5～8min后变安静，对照组动物在术后没有行为改变。
光镜观察，台盼蓝显示的注射区均在SRD的范围内(图1)，没有扩散到邻近的核团。给予海人藻酸刺激后，两侧脊髓灰质中Fos阳性神经元的数量相近，无明显的差别，但是各层中的Fos阳性神经元的数量差异很大，并且随存活时间的不同而出现动态变化。详见附表。
附表 海人藻酸注入SRD后脊髓灰质各层中Fos阳性神经元的密度
Table The density of c-fos positive neurons in different laminae
of the spinal gray after kainic acidinjection into the SRD 脊髓板层
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laminae of spinal gray
存活期(survival period)
0.5h
1h
1.5h
2h
4h
Ⅰ
++
+++
++++
++++
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Ⅱ
+
+++
++++
++++
++
Ⅲ
++
++
+++
+++
+
Ⅳ
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+
++
+++
+++
++
Ⅴ
+
+
++
++
+
Ⅶ
+
++
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++
++
+
Ⅷ
-
-
±
±
-
Ⅸ
-
-
±
±
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-
Ⅹ
+
+
++
+++
+
将微量海人藻酸注入大鼠延髓网状背侧亚核(图1×14)后1.5h,Fos阳性神经元在颈膨大
(图2×35)、胸髓(图3×35)、腰膨大(图4×35)和骶髓后角(图5×35)及三叉神经脊束核尾侧亚
核(图6×35)中的分布。在脊髓后角(图2，3)和三叉神经脊束核尾侧亚核(图6)的Ⅰ和Ⅱ层，BSI-B4标记的初级传入C纤维终末(↑)与Fos阳性神经元(↑)的分布区重叠
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At 1.5 hour after kainic acid microinjection into SRD of the rat(Fig.1×14),Fos-like immunoreactive(Fos-LI)neurons in dorsal horn of cervical enlargement
(Fig.2×35),thoracic cord(Fig.3×35),lumbar enlargement(Fig.4×35)and scacral cord
(Fig.5×35)of the spinal cord and Vc (Fig.6×14)were encountered.The overlaps of
BSI-B4 labelled primary afferent C fiber terminals( ↑ )
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with Fos-LI neurons(↑)in laminae Ⅰ and Ⅱ of the spinal cord(Fig.2 and Fig.3)
and Vc(Fig.6)were also observed.张文斌等.大鼠三叉神经节神经元向三叉神经脊束核尾
侧亚核和孤束核的分支投射
由附表可见，海人藻酸刺激SRD后0.5h，在脊髓灰质中开始出现较低密度的Fos阳性神经元，随着存活期延长，Fos联性神经元的密度逐渐增加，刺激后1.5(图2～5)～2h是c-fos表达的高峰期，此后其密度逐渐减低，至4h时脊髓灰质各层中Fos阳性神经元的密度已明显下降。从各板层中Fos阳性神经元的分布密度看，Ⅰ、Ⅱ层>Ⅲ、Ⅳ层>Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ层而前角的Ⅷ、Ⅸ层中为阴性或偶见。Vc中的c-fos表达情况与脊髓后角相似，即Ⅰ、Ⅱ层>Ⅲ层>Ⅳ、Ⅴ层(图6)。在脊髓和Vc的Ⅰ～Ⅱ层中BSI-B4标记的初级传入C纤维阳性终末(棕黄色)与Fos阳性神经元(黑色)重叠分布(图2，4，6)。
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在手术对照组，仅在颈髓灰质后角浅层中观察到少量的Fos阳性神经元，灰度值一般在5以下的区间，其余板层中均为阴性。Fos免疫组织化学对照实验结果为阴性。
讨论
1.方法学探讨
c-fos原癌基因是“即刻-早期基因”家族中的一种，大量研究表明，外周给予伤害性刺激可以引起伤害性信息传导通路中c-fos的表达。同样直接对中枢核团给予化学性刺激，也可以引起该核团中的神经元的活动发生改变，并通过其传出纤维诱发其他相关结构中c-fos的表达，因而这是一种研究中枢核团之间功能联系的有效手段。但中枢内c-fos的表达是一种敏感的方法，容易受其他因素干扰，所以在实验中首先应考虑排除这些干扰。本实验采用了以下措施：(1)术前将动物置于安静、温暖、避强光的环境中饲养1周，使之充分适应环境，尽可能缩短手术时间和减少术中损伤，术后迅速将动物放回术前的饲养环境。(2)一些麻醉药如戊巴比妥钠等，能阻断c-fos的表达[8]，本实验选用的Katamine具有用量少，作用快，麻醉时程短(15min左右)以及麻醉状态好的优点，可以保证术后动物迅速清醒。为了避免在肌注Ketamine时动物挣扎，先用乙醚诱导麻醉，再进一步用Ketamine麻醉，虽然乙醚具有刺激性气味，但既往结果表明，乙醚主要引起嗅觉传导通路上c-fos的表达，不妨碍本实验的结果。(3)海人藻酸是一种兴奋型氨基酸，据Bett等[7]报道，向中缝大核内注射微量海人藻酸(40μmol/L)后，可以引起中缝大核神经元的兴奋，而对过路纤维没有影响。但是大剂量的海人藻酸(200μmol/L)可以用来损毁核团或造成神经元溃变，也可诱发癫痫。本研究是以兴奋SRD神经元、诱导与SRD有关的神经通路中c-fos的表达为目的，选用大剂量的海人藻酸刺激显然不合适。海人藻酸注射后在脑内扩散的情况已有报道[7，9，10]。本实验参照Bett和Sandkuhler[7]介绍的海人藻酸用量，并且在注射液中加入了少量的台盼蓝，使注射区更易于观察，结果表明用这种方法注射海人藻酸，注射区局限在SRD范围，并诱导出SRD传出通路中的c-fos表达。(4)本研究设置了空白对照组和台盼蓝-生理盐水对照组，对照组中仅在颈髓后角浅层见到少量的Fos阳性神经元，可能是颈部手术过程中的刺激所致。
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2.脊髓灰质和Vc中c-fos表达的特点及意义
海人藻酸剂刺激SRD后，脊髓灰质各层中的Fos阳性神经元的分布具有一定的特征，面积比的顺序是Ⅰ、Ⅱ>Ⅲ、Ⅳ>Ⅴ～Ⅶ、Ⅹ层，Vc中Fos阳性神经元的分布与脊髓相似，尤以Ⅰ、Ⅱ层最密集，并与BSI-B\-4标记的传递伤害性刺激信息的初级传入C纤维终末重叠分布。后角Ⅰ、Ⅱ层是传递伤害性刺激信息的初级传入的主要终止部位，本研究观察到Ⅰ、Ⅱ层中c-fos表达的情况提示SRD的下行纤维与后角浅层的神经元之间存在着功能上的联系，藉此调节伤害性信息的传入。需要注意的是，过去对SRD的下行投射的终止部位有两种说法，一种认为这种投射主要是到后角浅层特别是Ⅰ层[3]，另一种则认为主要是投射到深层[4，5]。最近我们用PHA-L泳入SRD进行顺行追踪的研究结果表明，SRD的下行投射纤维主要终止在同侧脊髓后角Ⅳ～Ⅴ层以及Ⅶ、Ⅹ层，浅层只见到少量的标记终末(未发表资料)，这些结果与海人藻酸刺激SRD后脊髓后角c-fos表达的部位不完全重叠。在类似的研究中，也有这种追踪标记与c-fos表达部位不一致的报道[7]，其原因尚不完全清楚。本文推测这种情况的产生可能与下列两种因素有关：(1)SRD发出的下行投射中可能存在着多级神经元传导。据过去的研究报道，SRD神经元的下行轴突终末在颈髓中分布的密度明显高于脊髓其他节段[1]，提示颈髓可能是SRD下行通路中的中继站，部分来自SRD的下行纤维可能要先经过颈髓换元，再进一步向其他节段或对侧投射；(2)可能与脊髓后角中的局部环路有一定的关系。在脊髓后角存在着3种形式的抑制机制[11]，即通过直接抑制伤害性投射神经元、抑制兴奋性的中间神经元或兴奋抑制性的中间神经元等形式来达到抑制伤害性信息向上传递的目的。延髓吻侧端腹内侧部的神经元可以通过兴奋抑制性中间神经元来抑制投射神经元的活动[11]；给予中脑中央灰质电刺激或离子透入去甲肾上腺素可以兴奋后角浅层的抑制神经元[12]。一般认为，处于兴奋状态的神经元才有可能表达c-fos。后角Ⅱ层主要由中间神经元构成，其中含有大量的GABA能[13]和ENK[14]能神经元，两者均属于抑制性中间神经元，已有研究证明ENK免疫反应终末可与后角Ⅰ、Ⅳ层的丘脑投射神经元构成突触联系[15]，虽然还没有直接的证据说明SRD的下行投射是否也通过上述3种形式来调控伤害性信息的传递，但结合过去的报道和本实验c-fos表达的情况可以推测，至少有一部分SRD神经元可以通过兴奋上述抑制性中间神经元来调控伤害性信息向上位中枢的传递，即当海人藻酸注入SRD，致其中的神经元直接或间接地使Ⅱ层中的抑制性神经元兴奋并表达c-fos。有关这方面的研究尚待进一步完成。
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收稿1997-02 修回1997-05
* 国家自然科学基金资助课题(No.39400039)
参考文献
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EXPRESSION OF c-fos WITHIN SPINAL CORD AND CAUDAL
SPINAL TRIGEMINAL NUCLEUS INDUCED BY KAINIC ACID
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MICROINJECTION INTO SUBNUCLEUS RETICULARIS
DORSALIS OF THE RAT
SPINAL TRIGEMINAL NUCLEUS INDUCED BY KAINIC ACID
MICROINJECTION INTO SUBNUCLEUS RETICULARIS
DORSALIS OF THE RAT
Ling Shucai*,Li Yunqing,Shi Jiwu△
(Department of Anatomy,K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical
, 百拇医药
University,Xi′an;*Department of Neurobiology,Nantong Medical College,Nantong′an;*Department of Neurobiology,Nantong Medical College,Nantong)
In order to observe the influences of the descending projections from the subnucleus reticularis dorsalis(SRD) on the neurons in the spinal cord and caudal spinal trigeminal nucleus(Vc),by using an immunocytochemical method,we investigated the c-fos expression within spinal cord and Vc after kainic acid microinjection into the SRD of the rat.The results were as follows:At 30 minutes postinjection,a small number of Fos-like immunoreactive(Fos-LI) neurons appeared in the spinal gray and Vc;From 1.5 to 2 hours postinjection,high density of Fos-LI neurons appeared in the area mentioned above;At 4 hours after microinjection,the density of Fos-LI neurons decreased remarkablely.The rank order of the densities at different spinal laminae was highly variable,that is,laminae Ⅰ,Ⅱ>laminae Ⅲ,Ⅳ>laminae Ⅴ～Ⅶ and Ⅹ.Only a few Fos-LI neurons was observed in the ventral horn.c-fos expression observed in the Vc was similar to that in the spinal cord.On the other hand,we also found that the distributions of the BSI-B4 labelled primary afferent C fiber terminals overlapped with Fos-LI neurons in laminae Ⅰ and Ⅱ in both spinal cord and Vc.The present results provided evidence that the descending projections from SRD might directly or indirectly modulate the activities of neurons in the spinal cord and Vc,especially in laminae Ⅰ and Ⅱ.
KEY WORDS Subnucleus reticularis dorsalis;Descending pathway;Kainic acid;c-fos;BSI-B4;Rat
△Department of Anatomy,K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China, 百拇医药(凌树才** 李云庆 施际武)
单位：第四军医大学解剖学教研室 梁銶琚脑研究中心，西安 710032；**南通医学院神经生物学研究室，南通 226001
关键词：延髓网状背侧亚核；下行通路；海人藻酸；c-fos；BSI-B4；大鼠
解剖学报980304 摘 要 为了观察起自延髓网状背侧亚核(SRD)的下行投射对脊髓和三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)神经元活动的影响，将微量海人藻酸注入大鼠SRD中，致SRD神经元兴奋，在SRD下行通路的作用部位引起c-fos的表达。实验结果表明，在注射后30min，脊髓灰质内出现Fos阳性神经元，1.5～2h时达高峰，4h后明显减少。在高峰期，同一脊髓节段的不同板层内Fos阳性神经元的密度不同：Ⅰ、Ⅱ层>Ⅲ、Ⅳ层>Ⅴ～Ⅹ Ⅱ、Ⅹ层，Ⅷ、Ⅸ层中偶见。Vc内Fos阳性神经元的出现时间和分布与脊髓后角相似。上述结果提示，SRD发出的下行纤维主要调控脊髓和Vc(尤其是浅层)中的神经活动。
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近年来电生理研究资料表明，延髓网状背侧亚核(subnucleus reticularis dorsalis,SRD)是参与“弥散型伤害性抑制调控”(diffuse noxious inhibitory controls,DNIC)的重要核团[1,2]。形态学研究结果也表明，在SRD与脊髓之间存在着往返纤维联系构成的神经环路，并且认为这种环路是DNIC调控的结构基础[3~5]。然而伤害性信息的调控较复杂，常常涉及到多级神经元的多突触联系，但目前常用的示踪剂很难跨突触转运，只能反应某核团的一级联系，要完整地显示一条神经通路需多次追踪才能完成，而且还不能直接说明其功能上的联系，1987年Morgan[6]等创立了c-fos原癌基因表达法，在神经科学领域已被广泛的应用，包括用于检测外周受伤害性刺激激活的中枢多极神经元功能通路。最近也有用微量海人藻酸注入大鼠中缝大核导致脊髓神经元c-fos表达的报道[7]。为了观察SRD在功能上与脊髓和Vc中的哪些板层的核团发生联系，本研究将微量海人藻酸注入SRD，使SRD神经元发生兴奋，经过一定时间后，观察脊髓和Vc中Fos阳性神经元的分布。
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材料和方法
雄性SD大鼠16只，体重200～300g，分为实验组(n=14)和对照组(n=4)。
1.实验组
1.1 动物准备：将动物置于温暖、安静、避强光的环境下饲养1周，使之完全适应周围环境，以维持良好的基础状态。
1.2 手术过程：先用乙醚诱导麻醉，然后肌注Ketamine(0.5ml/只)维持麻醉，手术暴露闩平面以下的延髓，直视下用微玻管将生理盐水配制的0.1μl海人藻酸(20μmol/L，其中加少量台盼蓝)注入一侧SRD。手术过程在10min内完成，术后将动手放回术前相同的环境中，动物在术后3～5min清醒，分别存活30min(n=2)，1h(n=2),1.5h(n=6),2h(n=2),4h(n=2)。这期间注意观察动物的状态和行为变化。
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1.3 材料制备：各组实验动物成活至预定的成活期，用戊巴比妥钠深麻，开胸，经升主动脉依次灌注生理盐水100～150ml及含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1mol/L PB(pH7.4)500ml，灌毕立即取延髓和脊髓的代表性节段(C[5～6],T[4～5],L[3～6]及S[2～4])并浸入30%蔗糖(0.1mol/L PB配制)中过夜(4℃)，冠状冻切，片厚30μm，隔4片取1，取3组收集于0.01mol/L PBS内。
1.4 Fos免疫组织化学染色：第1，2组切片分别入(1)羊抗Fos血清(Cambridge Res Bio Chiemical,UK,1∶1 4 000)，用含0.2%Triton X-100的PBS稀释，室温下孵育1h后移入冰箱(4℃)中孵育48h；(2)生物素结合的兔抗羊IgG(Vector,1∶200，PBS稀释)，室温下孵育4h；(3)Avidin-HRP(Vector,1∶300,PBS稀释)室温下孵育2h。以上各步骤之间均用PBS漂洗3次，每次5min，最后按GOD-DAB-Ni法呈色，反应时间为20～25min。将第1组切片裱片，晾干，脱水，透明，DPX封片，Olympus显微镜观察并摄片。为了分析Fos阳性神经元与初级传入C纤维终末的关系，将第2组切片在完成上述染色后，置入BSI-B4(Bandeiraea Simplicifolia Isolectin-B4)-HRP(1∶8 000,Sigma)，室温下孵育3h切片，再用DAB-H2O2方法呈色。第3组切片行Nissl染色。
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1.5 脊髓内Fos样阳性胞核分布的图像分析：将Leica Q500MC图像分析仪的摄相系统连接于Olympus BX-50光学显微镜上，对灰度值6～12区间的Fos阳性胞核按核团或板层层次分布进行观察分析，自动记录出其数目和面积的百分比,得出脊髓灰质各层内c-fos表达的密度。为了便于分析，根据图像分析得出的结果(Fos阳性胞核面积占测量总面积的百分比),将脊髓灰质各层中的Fos阳性胞核的密度分成以下几个等级：++++ ·(>12%)、+++ ·(9%～12%)、++ ·(5%～8%)、+ ·(1～4)、±(偶见)。
2.对照实验
2.1 手术对照(n=2)：动物术前的饲养环境、手术过程及染色程序与实验组完全相同，只是注射液不含海人藻酸，动物术后成活1.5h。
2.2 Fos免疫组织化学对照(n=2)：取1套实验组大鼠的切片，用正常羊血清(1∶100)代替一抗，其余步骤不变。
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结果
实验组动物接受海人酸注射后3～5min即清醒，伴轻度的躁动不安和探究活动增加，这种行为变化一般持续5～8min后变安静，对照组动物在术后没有行为改变。
光镜观察，台盼蓝显示的注射区均在SRD的范围内(图1)，没有扩散到邻近的核团。给予海人藻酸刺激后，两侧脊髓灰质中Fos阳性神经元的数量相近，无明显的差别，但是各层中的Fos阳性神经元的数量差异很大，并且随存活时间的不同而出现动态变化。详见附表。
附表 海人藻酸注入SRD后脊髓灰质各层中Fos阳性神经元的密度
Table The density of c-fos positive neurons in different laminae
of the spinal gray after kainic acidinjection into the SRD 脊髓板层
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laminae of spinal gray
存活期(survival period)
0.5h
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将微量海人藻酸注入大鼠延髓网状背侧亚核(图1×14)后1.5h,Fos阳性神经元在颈膨大
(图2×35)、胸髓(图3×35)、腰膨大(图4×35)和骶髓后角(图5×35)及三叉神经脊束核尾侧亚
核(图6×35)中的分布。在脊髓后角(图2，3)和三叉神经脊束核尾侧亚核(图6)的Ⅰ和Ⅱ层，BSI-B4标记的初级传入C纤维终末(↑)与Fos阳性神经元(↑)的分布区重叠
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At 1.5 hour after kainic acid microinjection into SRD of the rat(Fig.1×14),Fos-like immunoreactive(Fos-LI)neurons in dorsal horn of cervical enlargement
(Fig.2×35),thoracic cord(Fig.3×35),lumbar enlargement(Fig.4×35)and scacral cord
(Fig.5×35)of the spinal cord and Vc (Fig.6×14)were encountered.The overlaps of
BSI-B4 labelled primary afferent C fiber terminals( ↑ )
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with Fos-LI neurons(↑)in laminae Ⅰ and Ⅱ of the spinal cord(Fig.2 and Fig.3)
and Vc(Fig.6)were also observed.张文斌等.大鼠三叉神经节神经元向三叉神经脊束核尾
侧亚核和孤束核的分支投射
由附表可见，海人藻酸刺激SRD后0.5h，在脊髓灰质中开始出现较低密度的Fos阳性神经元，随着存活期延长，Fos联性神经元的密度逐渐增加，刺激后1.5(图2～5)～2h是c-fos表达的高峰期，此后其密度逐渐减低，至4h时脊髓灰质各层中Fos阳性神经元的密度已明显下降。从各板层中Fos阳性神经元的分布密度看，Ⅰ、Ⅱ层>Ⅲ、Ⅳ层>Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ层而前角的Ⅷ、Ⅸ层中为阴性或偶见。Vc中的c-fos表达情况与脊髓后角相似，即Ⅰ、Ⅱ层>Ⅲ层>Ⅳ、Ⅴ层(图6)。在脊髓和Vc的Ⅰ～Ⅱ层中BSI-B4标记的初级传入C纤维阳性终末(棕黄色)与Fos阳性神经元(黑色)重叠分布(图2，4，6)。
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在手术对照组，仅在颈髓灰质后角浅层中观察到少量的Fos阳性神经元，灰度值一般在5以下的区间，其余板层中均为阴性。Fos免疫组织化学对照实验结果为阴性。
讨论
1.方法学探讨
c-fos原癌基因是“即刻-早期基因”家族中的一种，大量研究表明，外周给予伤害性刺激可以引起伤害性信息传导通路中c-fos的表达。同样直接对中枢核团给予化学性刺激，也可以引起该核团中的神经元的活动发生改变，并通过其传出纤维诱发其他相关结构中c-fos的表达，因而这是一种研究中枢核团之间功能联系的有效手段。但中枢内c-fos的表达是一种敏感的方法，容易受其他因素干扰，所以在实验中首先应考虑排除这些干扰。本实验采用了以下措施：(1)术前将动物置于安静、温暖、避强光的环境中饲养1周，使之充分适应环境，尽可能缩短手术时间和减少术中损伤，术后迅速将动物放回术前的饲养环境。(2)一些麻醉药如戊巴比妥钠等，能阻断c-fos的表达[8]，本实验选用的Katamine具有用量少，作用快，麻醉时程短(15min左右)以及麻醉状态好的优点，可以保证术后动物迅速清醒。为了避免在肌注Ketamine时动物挣扎，先用乙醚诱导麻醉，再进一步用Ketamine麻醉，虽然乙醚具有刺激性气味，但既往结果表明，乙醚主要引起嗅觉传导通路上c-fos的表达，不妨碍本实验的结果。(3)海人藻酸是一种兴奋型氨基酸，据Bett等[7]报道，向中缝大核内注射微量海人藻酸(40μmol/L)后，可以引起中缝大核神经元的兴奋，而对过路纤维没有影响。但是大剂量的海人藻酸(200μmol/L)可以用来损毁核团或造成神经元溃变，也可诱发癫痫。本研究是以兴奋SRD神经元、诱导与SRD有关的神经通路中c-fos的表达为目的，选用大剂量的海人藻酸刺激显然不合适。海人藻酸注射后在脑内扩散的情况已有报道[7，9，10]。本实验参照Bett和Sandkuhler[7]介绍的海人藻酸用量，并且在注射液中加入了少量的台盼蓝，使注射区更易于观察，结果表明用这种方法注射海人藻酸，注射区局限在SRD范围，并诱导出SRD传出通路中的c-fos表达。(4)本研究设置了空白对照组和台盼蓝-生理盐水对照组，对照组中仅在颈髓后角浅层见到少量的Fos阳性神经元，可能是颈部手术过程中的刺激所致。
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2.脊髓灰质和Vc中c-fos表达的特点及意义
海人藻酸剂刺激SRD后，脊髓灰质各层中的Fos阳性神经元的分布具有一定的特征，面积比的顺序是Ⅰ、Ⅱ>Ⅲ、Ⅳ>Ⅴ～Ⅶ、Ⅹ层，Vc中Fos阳性神经元的分布与脊髓相似，尤以Ⅰ、Ⅱ层最密集，并与BSI-B\-4标记的传递伤害性刺激信息的初级传入C纤维终末重叠分布。后角Ⅰ、Ⅱ层是传递伤害性刺激信息的初级传入的主要终止部位，本研究观察到Ⅰ、Ⅱ层中c-fos表达的情况提示SRD的下行纤维与后角浅层的神经元之间存在着功能上的联系，藉此调节伤害性信息的传入。需要注意的是，过去对SRD的下行投射的终止部位有两种说法，一种认为这种投射主要是到后角浅层特别是Ⅰ层[3]，另一种则认为主要是投射到深层[4，5]。最近我们用PHA-L泳入SRD进行顺行追踪的研究结果表明，SRD的下行投射纤维主要终止在同侧脊髓后角Ⅳ～Ⅴ层以及Ⅶ、Ⅹ层，浅层只见到少量的标记终末(未发表资料)，这些结果与海人藻酸刺激SRD后脊髓后角c-fos表达的部位不完全重叠。在类似的研究中，也有这种追踪标记与c-fos表达部位不一致的报道[7]，其原因尚不完全清楚。本文推测这种情况的产生可能与下列两种因素有关：(1)SRD发出的下行投射中可能存在着多级神经元传导。据过去的研究报道，SRD神经元的下行轴突终末在颈髓中分布的密度明显高于脊髓其他节段[1]，提示颈髓可能是SRD下行通路中的中继站，部分来自SRD的下行纤维可能要先经过颈髓换元，再进一步向其他节段或对侧投射；(2)可能与脊髓后角中的局部环路有一定的关系。在脊髓后角存在着3种形式的抑制机制[11]，即通过直接抑制伤害性投射神经元、抑制兴奋性的中间神经元或兴奋抑制性的中间神经元等形式来达到抑制伤害性信息向上传递的目的。延髓吻侧端腹内侧部的神经元可以通过兴奋抑制性中间神经元来抑制投射神经元的活动[11]；给予中脑中央灰质电刺激或离子透入去甲肾上腺素可以兴奋后角浅层的抑制神经元[12]。一般认为，处于兴奋状态的神经元才有可能表达c-fos。后角Ⅱ层主要由中间神经元构成，其中含有大量的GABA能[13]和ENK[14]能神经元，两者均属于抑制性中间神经元，已有研究证明ENK免疫反应终末可与后角Ⅰ、Ⅳ层的丘脑投射神经元构成突触联系[15]，虽然还没有直接的证据说明SRD的下行投射是否也通过上述3种形式来调控伤害性信息的传递，但结合过去的报道和本实验c-fos表达的情况可以推测，至少有一部分SRD神经元可以通过兴奋上述抑制性中间神经元来调控伤害性信息向上位中枢的传递，即当海人藻酸注入SRD，致其中的神经元直接或间接地使Ⅱ层中的抑制性神经元兴奋并表达c-fos。有关这方面的研究尚待进一步完成。
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收稿1997-02 修回1997-05
* 国家自然科学基金资助课题(No.39400039)
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EXPRESSION OF c-fos WITHIN SPINAL CORD AND CAUDAL
SPINAL TRIGEMINAL NUCLEUS INDUCED BY KAINIC ACID
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MICROINJECTION INTO SUBNUCLEUS RETICULARIS
DORSALIS OF THE RAT
SPINAL TRIGEMINAL NUCLEUS INDUCED BY KAINIC ACID
MICROINJECTION INTO SUBNUCLEUS RETICULARIS
DORSALIS OF THE RAT
Ling Shucai*,Li Yunqing,Shi Jiwu△
(Department of Anatomy,K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical
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University,Xi′an;*Department of Neurobiology,Nantong Medical College,Nantong′an;*Department of Neurobiology,Nantong Medical College,Nantong)
In order to observe the influences of the descending projections from the subnucleus reticularis dorsalis(SRD) on the neurons in the spinal cord and caudal spinal trigeminal nucleus(Vc),by using an immunocytochemical method,we investigated the c-fos expression within spinal cord and Vc after kainic acid microinjection into the SRD of the rat.The results were as follows:At 30 minutes postinjection,a small number of Fos-like immunoreactive(Fos-LI) neurons appeared in the spinal gray and Vc;From 1.5 to 2 hours postinjection,high density of Fos-LI neurons appeared in the area mentioned above;At 4 hours after microinjection,the density of Fos-LI neurons decreased remarkablely.The rank order of the densities at different spinal laminae was highly variable,that is,laminae Ⅰ,Ⅱ>laminae Ⅲ,Ⅳ>laminae Ⅴ～Ⅶ and Ⅹ.Only a few Fos-LI neurons was observed in the ventral horn.c-fos expression observed in the Vc was similar to that in the spinal cord.On the other hand,we also found that the distributions of the BSI-B4 labelled primary afferent C fiber terminals overlapped with Fos-LI neurons in laminae Ⅰ and Ⅱ in both spinal cord and Vc.The present results provided evidence that the descending projections from SRD might directly or indirectly modulate the activities of neurons in the spinal cord and Vc,especially in laminae Ⅰ and Ⅱ.
KEY WORDS Subnucleus reticularis dorsalis;Descending pathway;Kainic acid;c-fos;BSI-B4;Rat
△Department of Anatomy,K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China, 百拇医药(凌树才** 李云庆 施际武)