人卵巢颗粒细胞雌激素β型受体cDNA的克隆和序列分析
作者：黄荷凤 JL Mershon 王金福
单位：黄荷凤(310006 杭州，浙江大学医学院附属妇产科医院妇科)；J L Mershon(Department of Obstetrics and Gynecology, Cincinnati University, Ohio, USA)；王金福(浙江大学生命科学学院生物化学教研组)
关键词：卵巢；受体, 雌激素；序列分析，DNA
中华医学杂志000108 摘 要：目的 测定和分析人卵巢颗粒细胞中雌激素β型受体(ERβ)cDNA的核苷酸序列结构。 方法 采用DMEM培养基、以PERCOLL方法从人体外受精卵泡液中制备颗粒细胞。根据TRIzol Reagent试剂盒方法抽提RNA，并在Dispocolumn柱中用寡聚(dT)纯化mRNA。用SuperScriptTMⅡRT试剂盒反转录PCR合成cDNA。扩增产物与pGEM-T载体连接，并转化大肠杆菌XL1-Blue。测序按Sequenase Version 2.0 DNA测序试剂盒提供的方法进行。核苷酸序列结构用DNAMAN软件包进行分析。结果 经两对引物扩增，获得长度为1 495 bp(其中包括1 431 bp阅读框)的雌激素β受体cDNA序列。根据阅读框编码的氨基酸序列，可分A/B、C、D、E/F功能区，其中C区富含半胱氨酸，为DNA结合区(DBD)；E/F区为配基结合区(LBD)。结论 卵巢颗粒细胞中ERβ基因存在及序列分析结果证实了ERβ对卵巢颗粒细胞中雌激素自分泌的调节意义。
, 百拇医药
Sequencing and cloning of human estrogen β receptor (hERβ) cDNA in human granulosa
HUANG Hefeng
(Women′s Hospital, school of medecine, Zhejiang University, Hangzhou 310006, China)
J L Mershon, WANG Jinfu.
Abstract：Objective To analyze the nucleotide sequence of cDNA and deduce the amino acid sequence of human estrogen receptor (hERβ) in human granulosa cells. Methods Granulosa cells were prepared from the ovary of IVF-ET cases by Percoll technique with Dulbecco′s modified eagle medium. RNA was extracted with the TRIzol reagent kit, and mRNA was purified with oligo-(dT)-cellulose in a sterile dispocolumn. cDNA was synthesized by RT-PCR using the SuperScriptTM ⅡRT kit. Amplified products were cloned into the pGEM-T vector and transfected into E. coli XL1-Blue. The nucleotide sequences were determined by repeated sequencing of both strands of alkaline-denatural plasmid DNA using the Sequenase Version 2.0 DNA sequencing kit. The obtained DNA sequence was compiled and analyzed using DNAMAN computer programs. Results Amplified cDNA of hER β in human granulosa cells was composed of 1 495 bp, containing a 1 431 bp open reading frame. The predicted ER β protein consisted of 477 amino acids. The predicted ER protein included 4 function domains: A/B, C, D, and E/F domains. Among these domains, C domain, richly containing cysteine, was the DNA-binding domain (DBD), and E/F domain was the ligand-binding domain (LBD). Conclusion Detection of ERβ in the ovary granulosa cells played an important role in explaining the self-endocrine function of estrogen.
, http://www.100md.com
Key words：Ovary； Estrogen receptor； Sequence analysis， DNA▲
雌激素的生物效应必需经雌激素受体(ER)的介导。卵巢即是雌激素产生的重要场所，又是雌激素作用的靶组织之一。自1990年Hurst等[1]首先证实人卵巢中有ERα存在之后，Kuiper等[2]的实验表明人卵巢中有ERβ的存在 。但ERβ在人卵巢中的细胞定位至今不详。我们通过人体卵巢中ERβ的细胞定位研究，对卵巢颗粒细胞中ERβ基因进行克隆和序列测定，并与目前已有的动物ERβ基因进行DNA和氨基酸序列比较分析，以确定ERβ在人卵巢颗粒细胞中的存在意义。
材料和方法
1. 颗粒细胞制备：人卵巢颗粒细胞来自体外受精-胚胎移植(IVF-ET)行卵泡穿刺术妇女。所有妇女均为未孕妇女，月经周期和排卵功能正常，内分泌检查正常，不孕原因系男性因素。卵泡刺激方案为长周期促性腺素释放素类似物(GnRHa)加高纯促滤泡素(FSH)。取卵时间为注射人绒毛膜促性腺素(HCG)后36 h。取卵方法为在B型超声引导下经阴道卵泡穿刺术。2 000 r/min离心卵泡液，收集颗粒细胞，用Dulbecco 改进的Eagle 培养基(DMEM)洗涤后经体积分数为0.5珀可悬液(Percoll) 2 500 r/min×30分离红细胞。-70℃冻存备用。
, 百拇医药
2. RNA提取和分析：制备的颗粒细胞在Polytron匀浆器中匀浆，根据TRIzol ReagentTM试剂盒(美国GibcoBRL公司)提供的方法抽提RNA。为消除基因组DNA污染，在蛋白酶K消化、酚抽提和乙醇沉淀后用DNA酶I (美国GibcoBRL公司)处理。在Dispocolumn柱中用寡聚(dT)纯化mRNA。
3. cDNA合成：用反转录PCR(RT-PCR)方法合成cDNA第一链，并设计引物合成cDNA。 cDNA用SuperScriptTMⅡRT试剂盒(美国GibcoBRL公司)并参照其提供的方法合成。设计ER-β基因引物2对：第1对：(正义链)5′-ATAGCCCTGCTGTGATGAATTACA-3′，(反义链)5′-TTAACACCTCCATCCAACAGCTC-3′；第二对：(正义链) 5′-ATCACTATGGAGTCTGGTCGTG-3′，(反义链) 5′-GCTTCAGCTTGTGACCTCTGTG-3′。PCR在GeneAmpTM PCR 9600扩增仪上进行，94℃变性20 s，随后进行40次循环(94℃变性20 s，55℃复性10 s，72℃延伸20 s)，最后72℃延伸2 min。将扩增产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
, 百拇医药
4. ER-β基因扩增片段的克隆和测序：使用pGEM-T 载体系统试剂盒(美国GibcoBRL公司)并按其提供的方法进行质粒纯化，并分别将扩增产物与pGEM-T载体连接。转化大肠杆菌XL1-Blue，并选出带有DNA插入片段的pGEM-T。测序采用Sequenase 2.0 系列DNA测序试剂盒(美国生命科学公司)进行DNA序列分析。
结果
将以2对引物扩增的PCR产物进行凝胶电泳分析，发现两个碱基长度分别约为873 bp和1 165 bp的条带(图1)，这正是所需的ER-β基因2个片段。
1.为HB1和HB6引物扩增片段；2.为HB2和HB5引物扩增片段
, 百拇医药
图1 人体卵巢颗粒细胞雌激素β受体mRNA逆转录聚合酶链反应的两个cDNA片段
将获得的2个cDNA序列合并，除去重叠部分，最终获得人体颗粒细胞ERβ受体基因的克隆片段序列见图2。 该基因克隆片段全长1 495 bp。
图2 人体卵巢颗粒细胞雌激素β受体cDNA克隆片段序列及其编码的氨基酸序列
根据基因片段序列所编码的氨基酸序列分析，阅读框中编码477个与Messelman结果一致的氨基酸残基[3]。该阅读框中的第1个ATG实际上就是Kuiper序列中阅读框的第2个ATG。 该阅读框所编码的肽段比ERα分子短[5]，ERβ与ERα的同源性: 由图3可见ERα与ERβ高度同源，尤其是DBD与LBD，同源性分别高达96%和53%。结合Erα的功能区分析，其中1～95位氨基酸残基区为A/B区，即转录调控功能区； 96～160位区为C区，即DNA结合功能区，图2中用圆圈标记的富含半胱氨酸(C)与ERβ受体结合DNA的锌指(zinc-finger)结构有关；161～193位区为D区，即构像稳定功能区；其余的C端区为E/F区，即配基结合功能区。在大约第210个氨基酸残基之后为ERβ受体C端的配体结合区。
, 百拇医药
图3 ERβ与ERα氨基酸序列同源性比较
讨论
大量的体外研究已经表明，雌激素除了维持生殖功能和性功能外，还有许多其它的生理功能，尤其对卵泡的发育具有强大的调节作用，是构成卵泡发育局部微环境的最主要自分泌调节因素之一。而雌激素的效应必需通过雌激素受体的介导，早在1970年就有人用动物模型实验来推测人卵泡发育的雌激素-雌激素受体自分泌调节途径[3]。为了支持该学说，许多学者采用放射分析法、细胞组织免疫等方法研究哺乳动物卵巢颗粒细胞中ER的存在，但均失败[4]。直到1995年Hurst等[2]用RT-PCR细胞转染首次证实人卵巢颗粒细胞存在ERα后，雌激素对卵泡发育的自分泌调节学说得以确立，并发现雌激素在促卵泡素(FSH)诱导颗粒细胞的增殖[5]、芳香化酶诱导[6，7]、抑制素产生[8]、雌二醇(E2)的产生以及颗粒细胞在FSH受体和黄体生成激素(LH)受体的形成中起着主要的自分泌调节作用。同时，也说明RT-PCR以及现代分子生物学方法远比以前的实验手段先进且敏感。
, 百拇医药
该实验说明人卵巢排卵前颗粒细胞中存在ERβ，并可能是雌激素β受体产生的重要场所。结合Hurst的实验证明人卵巢颗粒细胞中有ERα和ERβ两种受体存在。根据本实验ERα和ERβ的同源区域分析：DNA结合功能区——C区和配基结合功能区(E/F)区其同源性分别高达96%和53%，说明两受体均能与同一雌激素发生特异性结合。但由于转录调控功能区——A/B区和构像稳定功能区(D区)的同源性仅有30%，可能雌激素与不同受体结合后，发挥的效应是不同的，推测两者可能在卵泡发育的调节中起共同作用。这说明人卵巢颗粒细胞中存在雌激素调节的多受体途径机制，并解释缺乏ERα的小鼠(ERKO)发育正常，无ERα的前列腺上皮细胞对雌激素高度敏感等现象。但ERβ的确切细胞角色、ERβ是否在功能上可完全替代ERα、ERβ与ERα的作用机制差异以及雌激素经ERβ途径或ERα途径的生物效应有何不同等问题，尚待今后研究。■
参考文献：
[1]Hurst BS, Zilberstein M, Chou JY, et al. Estrogen receptors are present in human granulosa cell. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80: 229-232.
, 百拇医药
[2]Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, et al. Cloning of a noval receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 5925-5930.
[3]Richards JS. Estradiol receptor content in rat granulosa cell during follicular development: modification by estradiol and goradotropins. Endocrinology, 1975, 97: 1174-1184.
[4]Hild-Petio S, Stouffer RL, Brenner RM. Immunocytchemical localization of estradiol and progesterone receptors in the monkey ovary throughout the mentrual cycle. Endocrinology, 1988, 123: 2896-2905.
, 百拇医药
[5]Fauser BCJM, van Heusden AM. Manipulation of human ovarian function: physiological concepts and clinical consequences. Endocr Rev, 1997, 18: 71-102.
[6]Dorrington JH, Moon YS, Armstrong DT. Estradiol-17beta biosynthesis in cultured granulosa cells from hypophysectomized immature rats; stimulation by follicle-stimulating hormone. Endocrinology, 1975, 97: 1328-1331.
[7]Adashi EY, Hsueh AJ. Estrogens augment the stimulation of ovarian aromatase activity by follicle-stimulating hormone in cultured rat granulosa cells. J Biol Chem, 1982, 257: 6077-6083.
[8]Hillier SG, Wickings EJ, Saunder PTK, et al. Control of inhibin production by primate granulosa cells. J Endocrinol, 1989, 123: 65-73.
收稿日期：1998-12-18, http://www.100md.com
单位：黄荷凤(310006 杭州，浙江大学医学院附属妇产科医院妇科)；J L Mershon(Department of Obstetrics and Gynecology, Cincinnati University, Ohio, USA)；王金福(浙江大学生命科学学院生物化学教研组)
关键词：卵巢；受体, 雌激素；序列分析，DNA
中华医学杂志000108 摘 要：目的 测定和分析人卵巢颗粒细胞中雌激素β型受体(ERβ)cDNA的核苷酸序列结构。 方法 采用DMEM培养基、以PERCOLL方法从人体外受精卵泡液中制备颗粒细胞。根据TRIzol Reagent试剂盒方法抽提RNA，并在Dispocolumn柱中用寡聚(dT)纯化mRNA。用SuperScriptTMⅡRT试剂盒反转录PCR合成cDNA。扩增产物与pGEM-T载体连接，并转化大肠杆菌XL1-Blue。测序按Sequenase Version 2.0 DNA测序试剂盒提供的方法进行。核苷酸序列结构用DNAMAN软件包进行分析。结果 经两对引物扩增，获得长度为1 495 bp(其中包括1 431 bp阅读框)的雌激素β受体cDNA序列。根据阅读框编码的氨基酸序列，可分A/B、C、D、E/F功能区，其中C区富含半胱氨酸，为DNA结合区(DBD)；E/F区为配基结合区(LBD)。结论 卵巢颗粒细胞中ERβ基因存在及序列分析结果证实了ERβ对卵巢颗粒细胞中雌激素自分泌的调节意义。
, 百拇医药
Sequencing and cloning of human estrogen β receptor (hERβ) cDNA in human granulosa
HUANG Hefeng
(Women′s Hospital, school of medecine, Zhejiang University, Hangzhou 310006, China)
J L Mershon, WANG Jinfu.
Abstract：Objective To analyze the nucleotide sequence of cDNA and deduce the amino acid sequence of human estrogen receptor (hERβ) in human granulosa cells. Methods Granulosa cells were prepared from the ovary of IVF-ET cases by Percoll technique with Dulbecco′s modified eagle medium. RNA was extracted with the TRIzol reagent kit, and mRNA was purified with oligo-(dT)-cellulose in a sterile dispocolumn. cDNA was synthesized by RT-PCR using the SuperScriptTM ⅡRT kit. Amplified products were cloned into the pGEM-T vector and transfected into E. coli XL1-Blue. The nucleotide sequences were determined by repeated sequencing of both strands of alkaline-denatural plasmid DNA using the Sequenase Version 2.0 DNA sequencing kit. The obtained DNA sequence was compiled and analyzed using DNAMAN computer programs. Results Amplified cDNA of hER β in human granulosa cells was composed of 1 495 bp, containing a 1 431 bp open reading frame. The predicted ER β protein consisted of 477 amino acids. The predicted ER protein included 4 function domains: A/B, C, D, and E/F domains. Among these domains, C domain, richly containing cysteine, was the DNA-binding domain (DBD), and E/F domain was the ligand-binding domain (LBD). Conclusion Detection of ERβ in the ovary granulosa cells played an important role in explaining the self-endocrine function of estrogen.
, http://www.100md.com
Key words：Ovary； Estrogen receptor； Sequence analysis， DNA▲
雌激素的生物效应必需经雌激素受体(ER)的介导。卵巢即是雌激素产生的重要场所，又是雌激素作用的靶组织之一。自1990年Hurst等[1]首先证实人卵巢中有ERα存在之后，Kuiper等[2]的实验表明人卵巢中有ERβ的存在 。但ERβ在人卵巢中的细胞定位至今不详。我们通过人体卵巢中ERβ的细胞定位研究，对卵巢颗粒细胞中ERβ基因进行克隆和序列测定，并与目前已有的动物ERβ基因进行DNA和氨基酸序列比较分析，以确定ERβ在人卵巢颗粒细胞中的存在意义。
材料和方法
1. 颗粒细胞制备：人卵巢颗粒细胞来自体外受精-胚胎移植(IVF-ET)行卵泡穿刺术妇女。所有妇女均为未孕妇女，月经周期和排卵功能正常，内分泌检查正常，不孕原因系男性因素。卵泡刺激方案为长周期促性腺素释放素类似物(GnRHa)加高纯促滤泡素(FSH)。取卵时间为注射人绒毛膜促性腺素(HCG)后36 h。取卵方法为在B型超声引导下经阴道卵泡穿刺术。2 000 r/min离心卵泡液，收集颗粒细胞，用Dulbecco 改进的Eagle 培养基(DMEM)洗涤后经体积分数为0.5珀可悬液(Percoll) 2 500 r/min×30分离红细胞。-70℃冻存备用。
, 百拇医药
2. RNA提取和分析：制备的颗粒细胞在Polytron匀浆器中匀浆，根据TRIzol ReagentTM试剂盒(美国GibcoBRL公司)提供的方法抽提RNA。为消除基因组DNA污染，在蛋白酶K消化、酚抽提和乙醇沉淀后用DNA酶I (美国GibcoBRL公司)处理。在Dispocolumn柱中用寡聚(dT)纯化mRNA。
3. cDNA合成：用反转录PCR(RT-PCR)方法合成cDNA第一链，并设计引物合成cDNA。 cDNA用SuperScriptTMⅡRT试剂盒(美国GibcoBRL公司)并参照其提供的方法合成。设计ER-β基因引物2对：第1对：(正义链)5′-ATAGCCCTGCTGTGATGAATTACA-3′，(反义链)5′-TTAACACCTCCATCCAACAGCTC-3′；第二对：(正义链) 5′-ATCACTATGGAGTCTGGTCGTG-3′，(反义链) 5′-GCTTCAGCTTGTGACCTCTGTG-3′。PCR在GeneAmpTM PCR 9600扩增仪上进行，94℃变性20 s，随后进行40次循环(94℃变性20 s，55℃复性10 s，72℃延伸20 s)，最后72℃延伸2 min。将扩增产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
, 百拇医药
4. ER-β基因扩增片段的克隆和测序：使用pGEM-T 载体系统试剂盒(美国GibcoBRL公司)并按其提供的方法进行质粒纯化，并分别将扩增产物与pGEM-T载体连接。转化大肠杆菌XL1-Blue，并选出带有DNA插入片段的pGEM-T。测序采用Sequenase 2.0 系列DNA测序试剂盒(美国生命科学公司)进行DNA序列分析。
结果
将以2对引物扩增的PCR产物进行凝胶电泳分析，发现两个碱基长度分别约为873 bp和1 165 bp的条带(图1)，这正是所需的ER-β基因2个片段。
1.为HB1和HB6引物扩增片段；2.为HB2和HB5引物扩增片段
, 百拇医药
图1 人体卵巢颗粒细胞雌激素β受体mRNA逆转录聚合酶链反应的两个cDNA片段
将获得的2个cDNA序列合并，除去重叠部分，最终获得人体颗粒细胞ERβ受体基因的克隆片段序列见图2。 该基因克隆片段全长1 495 bp。
图2 人体卵巢颗粒细胞雌激素β受体cDNA克隆片段序列及其编码的氨基酸序列
根据基因片段序列所编码的氨基酸序列分析，阅读框中编码477个与Messelman结果一致的氨基酸残基[3]。该阅读框中的第1个ATG实际上就是Kuiper序列中阅读框的第2个ATG。 该阅读框所编码的肽段比ERα分子短[5]，ERβ与ERα的同源性: 由图3可见ERα与ERβ高度同源，尤其是DBD与LBD，同源性分别高达96%和53%。结合Erα的功能区分析，其中1～95位氨基酸残基区为A/B区，即转录调控功能区； 96～160位区为C区，即DNA结合功能区，图2中用圆圈标记的富含半胱氨酸(C)与ERβ受体结合DNA的锌指(zinc-finger)结构有关；161～193位区为D区，即构像稳定功能区；其余的C端区为E/F区，即配基结合功能区。在大约第210个氨基酸残基之后为ERβ受体C端的配体结合区。
, 百拇医药
图3 ERβ与ERα氨基酸序列同源性比较
讨论
大量的体外研究已经表明，雌激素除了维持生殖功能和性功能外，还有许多其它的生理功能，尤其对卵泡的发育具有强大的调节作用，是构成卵泡发育局部微环境的最主要自分泌调节因素之一。而雌激素的效应必需通过雌激素受体的介导，早在1970年就有人用动物模型实验来推测人卵泡发育的雌激素-雌激素受体自分泌调节途径[3]。为了支持该学说，许多学者采用放射分析法、细胞组织免疫等方法研究哺乳动物卵巢颗粒细胞中ER的存在，但均失败[4]。直到1995年Hurst等[2]用RT-PCR细胞转染首次证实人卵巢颗粒细胞存在ERα后，雌激素对卵泡发育的自分泌调节学说得以确立，并发现雌激素在促卵泡素(FSH)诱导颗粒细胞的增殖[5]、芳香化酶诱导[6，7]、抑制素产生[8]、雌二醇(E2)的产生以及颗粒细胞在FSH受体和黄体生成激素(LH)受体的形成中起着主要的自分泌调节作用。同时，也说明RT-PCR以及现代分子生物学方法远比以前的实验手段先进且敏感。
, 百拇医药
该实验说明人卵巢排卵前颗粒细胞中存在ERβ，并可能是雌激素β受体产生的重要场所。结合Hurst的实验证明人卵巢颗粒细胞中有ERα和ERβ两种受体存在。根据本实验ERα和ERβ的同源区域分析：DNA结合功能区——C区和配基结合功能区(E/F)区其同源性分别高达96%和53%，说明两受体均能与同一雌激素发生特异性结合。但由于转录调控功能区——A/B区和构像稳定功能区(D区)的同源性仅有30%，可能雌激素与不同受体结合后，发挥的效应是不同的，推测两者可能在卵泡发育的调节中起共同作用。这说明人卵巢颗粒细胞中存在雌激素调节的多受体途径机制，并解释缺乏ERα的小鼠(ERKO)发育正常，无ERα的前列腺上皮细胞对雌激素高度敏感等现象。但ERβ的确切细胞角色、ERβ是否在功能上可完全替代ERα、ERβ与ERα的作用机制差异以及雌激素经ERβ途径或ERα途径的生物效应有何不同等问题，尚待今后研究。■
参考文献：
[1]Hurst BS, Zilberstein M, Chou JY, et al. Estrogen receptors are present in human granulosa cell. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80: 229-232.
, 百拇医药
[2]Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, et al. Cloning of a noval receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 5925-5930.
[3]Richards JS. Estradiol receptor content in rat granulosa cell during follicular development: modification by estradiol and goradotropins. Endocrinology, 1975, 97: 1174-1184.
[4]Hild-Petio S, Stouffer RL, Brenner RM. Immunocytchemical localization of estradiol and progesterone receptors in the monkey ovary throughout the mentrual cycle. Endocrinology, 1988, 123: 2896-2905.
, 百拇医药
[5]Fauser BCJM, van Heusden AM. Manipulation of human ovarian function: physiological concepts and clinical consequences. Endocr Rev, 1997, 18: 71-102.
[6]Dorrington JH, Moon YS, Armstrong DT. Estradiol-17beta biosynthesis in cultured granulosa cells from hypophysectomized immature rats; stimulation by follicle-stimulating hormone. Endocrinology, 1975, 97: 1328-1331.
[7]Adashi EY, Hsueh AJ. Estrogens augment the stimulation of ovarian aromatase activity by follicle-stimulating hormone in cultured rat granulosa cells. J Biol Chem, 1982, 257: 6077-6083.
[8]Hillier SG, Wickings EJ, Saunder PTK, et al. Control of inhibin production by primate granulosa cells. J Endocrinol, 1989, 123: 65-73.
收稿日期：1998-12-18, http://www.100md.com