三氧化二砷对转染表达两种早幼粒细胞性白血病融合蛋白的K562细胞的影响
作者：周励 陈国强 潘玲 贾培敏 朱琦 蔡循 余韵 沈玉雷 陈赛娟 王振义 沈志祥 陈竺
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院，上海血液学研究所
关键词：三氧化二砷；维甲酸；白血病；粒细胞；急性
中华医学杂志000422 【摘要】 目的 探讨急性早幼粒细胞性白血病的特异融合蛋白PML-RARα和PLZF-RARα在三氧化二砷(As2O3)效应中的可能作用。方法 应用逆病毒载体转染技术建立稳定表达PML-RARα(KPML)、PLZF-RARα(ΚPLZF)和空载体(KV)的K562细胞克隆。通过活细胞计数、形态学观察、流式细胞仪检测细胞DNA含量和分化抗原。应用免疫荧光分析PML-RARα蛋白的亚细胞分布。结果 1.0 μmol/L As2O3不诱导KV细胞凋亡和分化，但明显抑制其生长。在KPML和KPLZF细胞，As2O3也产生相似的生长抑制效应，但其效应强度明显增加。经1.0 μmol/L As2O3处理3 d时，KV、KPML和KPLZF的生长抑制率分别为32%±3%、57%±4%和54%±6%。1.0 μmol/L的全反式维甲酸也显示对KV细胞克隆的生长抑制，但其效应明显低于As2O3。同时，全反式维甲酸的生长抑制效应在KPML的表现较KV明显(P<0.05)，但在KV和KPLZF之间差异无显著意义。此外，在1.0 μmol/L As2O3作用2 d时，KV和KPML细胞内PML/PML-RARα蛋白颗粒明显减少甚至消失。结论 PML-RARα和PLZF-RARα蛋白明显加强As2O3对K562细胞的生长抑制效应。
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Effects of arsenic trioxide on K562 cells stably expressing two promyelocytic leukemia-specific fusion proteins
ZHOU Li
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
CHEN Guoqiang
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
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PAN Ling
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
【Abstract】 Objective To illustrate the possible roles of acute promyelocytic leukemia-specific chimeric proteins PML-RARα and PLZF-RARα in the effects of arsenic trioxide (As2O3). Methods K562 sublines stably expressing PML-RARα (KPML) and PLZF-RARα(KPLZF)were established by retrovirus transfection with KV transfected empty vectors as controls. Effects of As2O3 and all-trans retinoic acid (ATRA) on these sublines were analyzed through cell count, morphology, measurement of cellular DNA contents and differentiation antigens on flow cytometry. Subcellular distributions of PML-RARα proteins were observed with immunofluorescence. Results 1.0 μmol/L of As2O3 did not induce cell apoptosis and differentiation, but it significantly inhibited the growth of KV sublines. As2O3 showed the similar but more potent effects in KPML and KPLZF sublines. 1.0 μmol/L As2O3 treatment for 3 days induced growth inhibition by 32%±3%, 57%±4% and 54%±6%, respectively in KV, KPML and KPLZF sublines. 1.0 μmol/L ATRA also exerted, to a less extent than As2O3, growth-inhibitory effects in KV sublines, which became more obvious in KPML but not in KPLZF sublines. In addition, PML/PML-RARα proteins were decreased and even disappeared in KV and KPML sublines with the treatment of 1.0 μmol/L As2O3 for 48 hours. Conclusion PML-RARα and PLZF-RARα markedly enhance growth-inhibitory effects of As2O3 on K562 cells.
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【Key words】 Arsenic trioxide； Retinoic acid； Leukemia, myelocytic, acute
急性早幼粒细胞性白血病(APL)以其特异的细胞遗传学改变和对全反式维甲酸(ATRA)、三氧化二砷(As2O3)的临床反应性受到人们的广泛重视。已知90%以上的APL存在染色体易体t(15；17)(q23；21)。该易位导致PML-RARα融合基因的表达。此外，其它罕见的变异型染色体易位也存在APL病例中，如t(11；17)(q23；21)、t(5；17)(q35，21)和t(11；17)(q13；21)。它们分别表达PLZF-RARα、NPM-RARα和NuMA-RARα蛋白。这些蛋白既是APL发生的重要分子基础，也决定APL细胞对ATRA的反应性[1，2]。最近，As2O3有效治APL的临床实践及其实验研究引起人们的广泛兴趣[3-5]。根据As2O3调变和降解PML-RARα蛋白的事实，有人提出该蛋白可能与As2O3对APL细胞效应有关，但对此尚有争议[3，6-8]。我们拟通过观察As2O3和ATRA对转染表达PML-RARα和PLZF-RARα和PLZF-RARα蛋白的K562细胞克隆的影响，进一步了解两者在As2O3和ATRA疚中的可能作用。
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材料与方法
1. 制剂:纯As2O3粉剂紧磷酸盐缓冲液(PBS)配制成5 mmol/L的储存液,使用前稀释至工作浓度.ATRA储存液(5 mmol/L)由无水乙醇配制.4℃避光保存。嘌呤霉素(puramycin)粉剂用PBS配制成1 mg/ml的储存液(美国Sigma公司)
2.细胞克隆建立及其培养:转染表达PML-RARα和PLZF-RARα的克隆分别称为KV、KPML和KPLZF。以1×105个细胞/ml的起始浓度接种KV、KPML和KPLZF细胞克隆于含10%小牛血清和2μg/ml嘌呤霉素的新鲜RPMI160培养液(Gidcol-BRL产品)中，37℃，体积分数0.05的CO2条件下培养。以台盼蓝拒染法计数活细胞。细胞活力(%)=活细胞数/总细胞数×100%和生长抑制率(%)=(对照组-实验组)/对照组活细胞数×100%
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4.细胞凋亡和分化的检测：细胞克隆经1μmol/LAs2O3或ATRA处理一定时间后，经细胞涂片仪(Shandon,800rpm,4min)涂片，并经Wright染色后，光镜下观察细胞形态变化。同时通过检测细胞DNA含量评价细胞凋亡和检测细胞表面分化抗原评价细胞分析[5]。进行PML/PML-RARα蛋白的免疫荧光分析[5]。
5.细胞内谷胱甘肽(GSH)含量和抗氧化酶(CAT)活性的测定:取106-107细胞,以冷PBS清洗后在冷裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCL；10 μmol/L PMSF；1 μg/ml Aprotin; 1μg/ml Leupeptin)中超声裂解。应用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测细胞裂解液中GSH含量和过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽S转移酶(GST)的活性，并以牛血清白蛋白为标准，通过Bradford定量法进行蛋白定量。
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6.统计学处理：每组使用6个样本，重复实验3次，组间差异显著性检验采用均数团体t检验。
结果
1.PML-RARα和PLZF-RARα加强As2O3对K562细胞的生长抑制效应：1.0 μmol/L As2O3明显抑制KV细胞克隆的生长，并呈现时间依赖效应。和KV细胞比较，在1.0 μmol/L As2O3作用下，KPML和KPLZF的生长抑制更为明显(表1，P<0.05)。但是，As2O3的生长抑制效应在KPML和KPLZF细胞间差异无显著意义(P>0.05)。在1.0 μmol/L As2O3处理3 d时，KPML和KPLZF细胞的生长抑制率分别为57%±4%和54%±6%，而KV细胞的生长抑制率为32%±3%，提示PML-RARα和PLZF-RARα以相似效力增强As2O3对K562细胞的生长抑制作用。另一方面，1.0 μmol/L ATRA也显示对KV细胞克隆的生长抑制，但其效应明显低于As2O3。同时，ATRA的生长抑制效应在KPML克隆的表现较KV细胞明显，但在KV和KPLZF克隆之间差异无显著意义。
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表1 As2O3和ATRA处理3 d对K562细胞克隆的
生长抑制率(%，
±s) 组别
样本
Kv
KPML
KPLZF
As2O3(1 μmol/L)
6
33±3
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57±4▲
54±6▲▲△
ATRA(1 μmol/L)
6
13±6*
32±5*
20±6*△△
注：和相应的As2O3组比较，*P<0.05；和KV比较▲P<0.01，▲▲P<0.05；和KPML比较△P>0.05；分别与KV和KPML比较△△P>0.05和P<0.05 2.As2O3和ATRA不诱导3种K562细胞克隆凋亡和分化：在1.0 μmol/L As2O3或ATRA处理2～4 d内，KV、KPML和KPLZF细胞克隆的活力均保持在90%以上。细胞形态学观察也未见到明显的凋亡或分化细胞。应用流式细胞仪分析也未见亚G1期细胞群的出现和细胞表面抗原CD11b、CD14、CD15、CD33的改变。此外，PML-RARα和PLZF-RARα的表达也不影响K562细胞的GSH含量和CAT、GPX和GST活性(表2)。
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表2 3个K562细胞克隆的GSH含量和
抗氧化酶活性(±s) K562细胞
GSH
(μmol/mg)
CAT
(U/mg)
GPX
(U/mg)
GST
(U/mg)
KV
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0.23±0.02
5.70±0.23
42±5
2.8±0.7
KPML
0.21±0.03*
5.39±0.53*
42±6*
2.6±0.4*
KPLZF
0.22±0.01*
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5.20±0.50
40±6*
2.9±0.5*
注：和KV比较*P>0.05
图1，3 为对照；图2，4 1.0 μmol/L As2O3作用2 d时KV、KPML细胞内PML/PML-RARα蛋白颗粒明显较少
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3.As2O3和ATRA对K562细胞克隆细胞周期分布的影响：KV、KPML和KPLZF克隆分别经1 μmol/L As2O3或ATRA处理3 d后，应用流式细胞仪检测细胞DNA含量分布。结果显示，As2O3和ATRA对这3种克隆的细胞周期时相分布均无明显影响。
4.As2O3和ATRA对PML-RARα蛋白在K562细胞定位的影响：野生型PML蛋白以10～20个粗大颗粒方式分布于KV细胞核内。在KPML细胞，由于PML-RARα蛋白的表达，PML/PML-RARα蛋白以许多细胞小颗粒的方式散在分布于细胞核内。在1.0 μmol/L的As2O3作用2 d时，KV和KPML细胞内PML/PML-RARα蛋白颗粒明显减少甚至消失(图1～4)。
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讨论
本组实验发现As2O3和ATRA明显抑制KV细胞的生长，但它们并不发生凋亡和分化，提示As2O3和ATRA对KV细胞的生长抑制效应系细胞增殖受抑所致。后者可能与细胞周期时间延长有关，因为它们也不明显改变KV细胞的细胞周期分布，这和肖冬梅等[7]的报道是一致的。
PML蛋白存在于被称为“核体(nuclear bodies, NBs)”的细胞核结构内，广泛参与多种因素诱导的细胞凋亡途径[8]。本结果显示，野生型PML以10～20个的NBs结构存在于KV细胞。但是，如同APL细胞一样，在KPML细胞，NBs结构因PML-RARα蛋白被转染表达而破坏。已知，As2O3能快速有效地降解在APL细胞特异表达的PML-RARα蛋白[9]。并发现As2O3不仅能降解转染表达的PML-RARα蛋白，而且也能清除存在于K562细胞内的野生型PML颗粒，提示As2O3对PML-RARα蛋白的降解可能主要发生在PML分子。最近，有关PML-RARα蛋白的调变和降解在As2O3诱导细胞凋亡的作用存在怀疑。本组发现在PML-RARα蛋白表达的情况下，As2O3仍不诱导K562细胞凋亡，但PML-RARα明显加强As2O3对K562细胞的生长抑制作用，提示PML-RARα蛋白即使不是As2O3效应(诱导凋亡或抑制生长)所必需的，但它的确刺激As2O3的效应机制。最近，Koken等[10]报道As2O3也不诱导表达PLZF-RARα蛋白的原代APL细胞凋亡和分化。显然，PML-RARα和PLZF-RARα蛋白具有各自不同的生物学功能。然而，本实验发现PLZF-RARα蛋白的表达虽然不影响ATRA对K562细胞的生长抑制，但在As2O3的生长抑制效应方面，PML-RARα和PLZF-RARα蛋白具有相似的加强效应。此外，最近的资料显示，细胞对As2O3的诱导凋亡效应的敏感性和细胞内GSH和(或)过氧化氢酶活性有关[11]。过去我们的结果显示和APL细胞比较，K562细胞有较高的GSH含量和过氧化氢酶活性。本研究发现，PML-RARα/PLZF-RARα融合蛋白的表达并不改变GSH含量和过氧化氢酶活性。推测这可能是KV和KPML、KPLZF细胞不发生凋亡的重要原因。
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基金项目：国家杰出青年科学基金(39725011)；国家自然科学基金资助项目(39730270)；面上项目(39670329、39770410)，上海血液学研究所胡应洲基金部分资助项目
参考文献
1，Grisolano JL, Wesselschmidt RL, Pelicci PG. Altered myeloid development and acute leukemia in transgenic mice expressing PML-RAR alpha under control of cathepsin G regulatory sequences. Blood, 1997, 89:376-387.
2 Maeda Y, Horiuchi F, Miyatake J, et al. Inhibition of growth and induction of apoptosis by all-trans retinoic acid in lymphoid cell lines transfected with the PML/RAR alpha fusion gene. Br J Haematol, 1996, 93:973-976.
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3，Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): II clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood, 1997, 89:3354-3360.
4，Soignet SL, Maslak P, Wang ZG, et al. Complete remission after treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide. N Engl J Med, 1998, 339:1341-1348.
5，Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with down-regulation of Bcl-2 expression and alteration of PML-RARα/PML protein localization. Blood, 1996, 88:1052-1061.
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6，Zhu J, Guo WM, Yao YY, et al. Tissue factors on acute promyelocytic leukemia and endothelial cells are differently regulated by retinoic acid, arsenic trioxide and chemotherapeutic agents. Leukemia, 1999,1062-1670.
7，肖冬梅，孙关林，邬维礼，等.As2O3对K562细胞细胞周期的影响及其机制的研究.中华医学杂志，1999，79：306-307.
8，Quignon F, De Bels F, Koken M, et al. PML induces a novel caspase-independent death process. Nat Genet, 1998, 20:259-266.
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9，Shao W, Fanelli M, Ferrara FF, et al. Arsenic trioxide as an inducer of apoptosis and loss of PML/RAR alpha protein in acute promyelocytic leukemia cells. J Natl Cancer Inst, 1998, 90:124-131.
10，Koken MH, Daniel MT, Gianni M, et al. Retinoic acid, but not arsenic trioxide, degrades the PLZF/RAR alpha fusion protein, without inducing terminal differentiation or apoptosis, in a RA-therapy resistant t (11;17)(q23;q21) APL patient. Oncogene, 1999,18:1113-1121.
11，Dai J, Weinberg RS, Waxman S, et al. Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arsenic through modulation of the glutathione. Blood, 1999, 93:268-277.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院，上海血液学研究所
关键词：三氧化二砷；维甲酸；白血病；粒细胞；急性
中华医学杂志000422 【摘要】 目的 探讨急性早幼粒细胞性白血病的特异融合蛋白PML-RARα和PLZF-RARα在三氧化二砷(As2O3)效应中的可能作用。方法 应用逆病毒载体转染技术建立稳定表达PML-RARα(KPML)、PLZF-RARα(ΚPLZF)和空载体(KV)的K562细胞克隆。通过活细胞计数、形态学观察、流式细胞仪检测细胞DNA含量和分化抗原。应用免疫荧光分析PML-RARα蛋白的亚细胞分布。结果 1.0 μmol/L As2O3不诱导KV细胞凋亡和分化，但明显抑制其生长。在KPML和KPLZF细胞，As2O3也产生相似的生长抑制效应，但其效应强度明显增加。经1.0 μmol/L As2O3处理3 d时，KV、KPML和KPLZF的生长抑制率分别为32%±3%、57%±4%和54%±6%。1.0 μmol/L的全反式维甲酸也显示对KV细胞克隆的生长抑制，但其效应明显低于As2O3。同时，全反式维甲酸的生长抑制效应在KPML的表现较KV明显(P<0.05)，但在KV和KPLZF之间差异无显著意义。此外，在1.0 μmol/L As2O3作用2 d时，KV和KPML细胞内PML/PML-RARα蛋白颗粒明显减少甚至消失。结论 PML-RARα和PLZF-RARα蛋白明显加强As2O3对K562细胞的生长抑制效应。
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Effects of arsenic trioxide on K562 cells stably expressing two promyelocytic leukemia-specific fusion proteins
ZHOU Li
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
CHEN Guoqiang
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
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PAN Ling
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
【Abstract】 Objective To illustrate the possible roles of acute promyelocytic leukemia-specific chimeric proteins PML-RARα and PLZF-RARα in the effects of arsenic trioxide (As2O3). Methods K562 sublines stably expressing PML-RARα (KPML) and PLZF-RARα(KPLZF)were established by retrovirus transfection with KV transfected empty vectors as controls. Effects of As2O3 and all-trans retinoic acid (ATRA) on these sublines were analyzed through cell count, morphology, measurement of cellular DNA contents and differentiation antigens on flow cytometry. Subcellular distributions of PML-RARα proteins were observed with immunofluorescence. Results 1.0 μmol/L of As2O3 did not induce cell apoptosis and differentiation, but it significantly inhibited the growth of KV sublines. As2O3 showed the similar but more potent effects in KPML and KPLZF sublines. 1.0 μmol/L As2O3 treatment for 3 days induced growth inhibition by 32%±3%, 57%±4% and 54%±6%, respectively in KV, KPML and KPLZF sublines. 1.0 μmol/L ATRA also exerted, to a less extent than As2O3, growth-inhibitory effects in KV sublines, which became more obvious in KPML but not in KPLZF sublines. In addition, PML/PML-RARα proteins were decreased and even disappeared in KV and KPML sublines with the treatment of 1.0 μmol/L As2O3 for 48 hours. Conclusion PML-RARα and PLZF-RARα markedly enhance growth-inhibitory effects of As2O3 on K562 cells.
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【Key words】 Arsenic trioxide； Retinoic acid； Leukemia, myelocytic, acute
急性早幼粒细胞性白血病(APL)以其特异的细胞遗传学改变和对全反式维甲酸(ATRA)、三氧化二砷(As2O3)的临床反应性受到人们的广泛重视。已知90%以上的APL存在染色体易体t(15；17)(q23；21)。该易位导致PML-RARα融合基因的表达。此外，其它罕见的变异型染色体易位也存在APL病例中，如t(11；17)(q23；21)、t(5；17)(q35，21)和t(11；17)(q13；21)。它们分别表达PLZF-RARα、NPM-RARα和NuMA-RARα蛋白。这些蛋白既是APL发生的重要分子基础，也决定APL细胞对ATRA的反应性[1，2]。最近，As2O3有效治APL的临床实践及其实验研究引起人们的广泛兴趣[3-5]。根据As2O3调变和降解PML-RARα蛋白的事实，有人提出该蛋白可能与As2O3对APL细胞效应有关，但对此尚有争议[3，6-8]。我们拟通过观察As2O3和ATRA对转染表达PML-RARα和PLZF-RARα和PLZF-RARα蛋白的K562细胞克隆的影响，进一步了解两者在As2O3和ATRA疚中的可能作用。
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材料与方法
1. 制剂:纯As2O3粉剂紧磷酸盐缓冲液(PBS)配制成5 mmol/L的储存液,使用前稀释至工作浓度.ATRA储存液(5 mmol/L)由无水乙醇配制.4℃避光保存。嘌呤霉素(puramycin)粉剂用PBS配制成1 mg/ml的储存液(美国Sigma公司)
2.细胞克隆建立及其培养:转染表达PML-RARα和PLZF-RARα的克隆分别称为KV、KPML和KPLZF。以1×105个细胞/ml的起始浓度接种KV、KPML和KPLZF细胞克隆于含10%小牛血清和2μg/ml嘌呤霉素的新鲜RPMI160培养液(Gidcol-BRL产品)中，37℃，体积分数0.05的CO2条件下培养。以台盼蓝拒染法计数活细胞。细胞活力(%)=活细胞数/总细胞数×100%和生长抑制率(%)=(对照组-实验组)/对照组活细胞数×100%
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4.细胞凋亡和分化的检测：细胞克隆经1μmol/LAs2O3或ATRA处理一定时间后，经细胞涂片仪(Shandon,800rpm,4min)涂片，并经Wright染色后，光镜下观察细胞形态变化。同时通过检测细胞DNA含量评价细胞凋亡和检测细胞表面分化抗原评价细胞分析[5]。进行PML/PML-RARα蛋白的免疫荧光分析[5]。
5.细胞内谷胱甘肽(GSH)含量和抗氧化酶(CAT)活性的测定:取106-107细胞,以冷PBS清洗后在冷裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCL；10 μmol/L PMSF；1 μg/ml Aprotin; 1μg/ml Leupeptin)中超声裂解。应用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测细胞裂解液中GSH含量和过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽S转移酶(GST)的活性，并以牛血清白蛋白为标准，通过Bradford定量法进行蛋白定量。
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6.统计学处理：每组使用6个样本，重复实验3次，组间差异显著性检验采用均数团体t检验。
结果
1.PML-RARα和PLZF-RARα加强As2O3对K562细胞的生长抑制效应：1.0 μmol/L As2O3明显抑制KV细胞克隆的生长，并呈现时间依赖效应。和KV细胞比较，在1.0 μmol/L As2O3作用下，KPML和KPLZF的生长抑制更为明显(表1，P<0.05)。但是，As2O3的生长抑制效应在KPML和KPLZF细胞间差异无显著意义(P>0.05)。在1.0 μmol/L As2O3处理3 d时，KPML和KPLZF细胞的生长抑制率分别为57%±4%和54%±6%，而KV细胞的生长抑制率为32%±3%，提示PML-RARα和PLZF-RARα以相似效力增强As2O3对K562细胞的生长抑制作用。另一方面，1.0 μmol/L ATRA也显示对KV细胞克隆的生长抑制，但其效应明显低于As2O3。同时，ATRA的生长抑制效应在KPML克隆的表现较KV细胞明显，但在KV和KPLZF克隆之间差异无显著意义。
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表1 As2O3和ATRA处理3 d对K562细胞克隆的
生长抑制率(%，
±s) 组别样本
Kv
KPML
KPLZF
As2O3(1 μmol/L)
6
33±3
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57±4▲
54±6▲▲△
ATRA(1 μmol/L)
6
13±6*
32±5*
20±6*△△
注：和相应的As2O3组比较，*P<0.05；和KV比较▲P<0.01，▲▲P<0.05；和KPML比较△P>0.05；分别与KV和KPML比较△△P>0.05和P<0.05 2.As2O3和ATRA不诱导3种K562细胞克隆凋亡和分化：在1.0 μmol/L As2O3或ATRA处理2～4 d内，KV、KPML和KPLZF细胞克隆的活力均保持在90%以上。细胞形态学观察也未见到明显的凋亡或分化细胞。应用流式细胞仪分析也未见亚G1期细胞群的出现和细胞表面抗原CD11b、CD14、CD15、CD33的改变。此外，PML-RARα和PLZF-RARα的表达也不影响K562细胞的GSH含量和CAT、GPX和GST活性(表2)。
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表2 3个K562细胞克隆的GSH含量和
抗氧化酶活性(
±s) K562细胞GSH
(μmol/mg)
CAT
(U/mg)
GPX
(U/mg)
GST
(U/mg)
KV
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0.23±0.02
5.70±0.23
42±5
2.8±0.7
KPML
0.21±0.03*
5.39±0.53*
42±6*
2.6±0.4*
KPLZF
0.22±0.01*
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5.20±0.50
40±6*
2.9±0.5*
注：和KV比较*P>0.05
图1，3 为对照；图2，4 1.0 μmol/L As2O3作用2 d时KV、KPML细胞内PML/PML-RARα蛋白颗粒明显较少
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3.As2O3和ATRA对K562细胞克隆细胞周期分布的影响：KV、KPML和KPLZF克隆分别经1 μmol/L As2O3或ATRA处理3 d后，应用流式细胞仪检测细胞DNA含量分布。结果显示，As2O3和ATRA对这3种克隆的细胞周期时相分布均无明显影响。
4.As2O3和ATRA对PML-RARα蛋白在K562细胞定位的影响：野生型PML蛋白以10～20个粗大颗粒方式分布于KV细胞核内。在KPML细胞，由于PML-RARα蛋白的表达，PML/PML-RARα蛋白以许多细胞小颗粒的方式散在分布于细胞核内。在1.0 μmol/L的As2O3作用2 d时，KV和KPML细胞内PML/PML-RARα蛋白颗粒明显减少甚至消失(图1～4)。
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讨论
本组实验发现As2O3和ATRA明显抑制KV细胞的生长，但它们并不发生凋亡和分化，提示As2O3和ATRA对KV细胞的生长抑制效应系细胞增殖受抑所致。后者可能与细胞周期时间延长有关，因为它们也不明显改变KV细胞的细胞周期分布，这和肖冬梅等[7]的报道是一致的。
PML蛋白存在于被称为“核体(nuclear bodies, NBs)”的细胞核结构内，广泛参与多种因素诱导的细胞凋亡途径[8]。本结果显示，野生型PML以10～20个的NBs结构存在于KV细胞。但是，如同APL细胞一样，在KPML细胞，NBs结构因PML-RARα蛋白被转染表达而破坏。已知，As2O3能快速有效地降解在APL细胞特异表达的PML-RARα蛋白[9]。并发现As2O3不仅能降解转染表达的PML-RARα蛋白，而且也能清除存在于K562细胞内的野生型PML颗粒，提示As2O3对PML-RARα蛋白的降解可能主要发生在PML分子。最近，有关PML-RARα蛋白的调变和降解在As2O3诱导细胞凋亡的作用存在怀疑。本组发现在PML-RARα蛋白表达的情况下，As2O3仍不诱导K562细胞凋亡，但PML-RARα明显加强As2O3对K562细胞的生长抑制作用，提示PML-RARα蛋白即使不是As2O3效应(诱导凋亡或抑制生长)所必需的，但它的确刺激As2O3的效应机制。最近，Koken等[10]报道As2O3也不诱导表达PLZF-RARα蛋白的原代APL细胞凋亡和分化。显然，PML-RARα和PLZF-RARα蛋白具有各自不同的生物学功能。然而，本实验发现PLZF-RARα蛋白的表达虽然不影响ATRA对K562细胞的生长抑制，但在As2O3的生长抑制效应方面，PML-RARα和PLZF-RARα蛋白具有相似的加强效应。此外，最近的资料显示，细胞对As2O3的诱导凋亡效应的敏感性和细胞内GSH和(或)过氧化氢酶活性有关[11]。过去我们的结果显示和APL细胞比较，K562细胞有较高的GSH含量和过氧化氢酶活性。本研究发现，PML-RARα/PLZF-RARα融合蛋白的表达并不改变GSH含量和过氧化氢酶活性。推测这可能是KV和KPML、KPLZF细胞不发生凋亡的重要原因。
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基金项目：国家杰出青年科学基金(39725011)；国家自然科学基金资助项目(39730270)；面上项目(39670329、39770410)，上海血液学研究所胡应洲基金部分资助项目
参考文献
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10，Koken MH, Daniel MT, Gianni M, et al. Retinoic acid, but not arsenic trioxide, degrades the PLZF/RAR alpha fusion protein, without inducing terminal differentiation or apoptosis, in a RA-therapy resistant t (11;17)(q23;q21) APL patient. Oncogene, 1999,18:1113-1121.
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(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药