不同剂量紫外线照射对血小板活化的影响
作者：张献清 张莉 李翠莹 李琳琳
单位：第四军医大学 西京医院输血科，陕西 西安 710032
关键词：紫外线；血小板/活化；照射；P-Selectin
中国医学物理学杂志990418 摘要： 探讨经不同剂量B波段紫外线(UVB)照射后对浓缩血小板在保存过程中血小板活化的影响。用PRP法制备浓缩血小板，采用1 J/cm2、1.5 J/cm2、2 J/cm2UVB进行照射，常规保存5天，间隔取样分别用RIA、ELISA方法检测血小板表面及血浆中P-Selectin的含量。结果表明：1 J/cm2、1.5 J/cm2UVB照射组与对照组一样，于保存3天后，血小板表面P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度明显升高(P<0.05)，在保存5天后含量进一步升高，差异更为明显(P<0.001)。2 J/cm2UVB照射组于保存1天后血小板表面P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度即明为升高(P<0.05)，在保存3天后，差异更为显著(P<0.001)。上述结果提示：以小于2 J/cm2 UVB照射在5天的保存期内不会引起明显的血小板活化，而大于2 J/cm2 UVB照射会促进血小板的活化，不利于血小板的保存。
, 百拇医药
中图分类号：R331.1+43 文献标识码：A
文章编号：1005-202X(1999)04-
Actiuation of platelet in atored platelet concentrates following variable doses of ultraviolet b irradiation
ZHANG Xian-Qing,ZHANG Li，LI Cui-ying,et al.
(Department of Blood Transfusion,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
Abstract: To evaluate the platelet activation of stored platelet concentrates irradiated by variavle doses of ultravioet B irradiation.Platelet concentrates were prapared by PRP methods.Platelet surface expression of P-selectin was determined by RIA,and P-selectin in plasma was determined by ELISA.Platelet concentrates were irradiated at UVB doses of 1 J/cm2,1.5 J/cm2,2 J/cm2 and stored up to 5 days on standard blood bank conditions.Compared to nonirradiated group,the irradiated unitsof 1 J/cm2,1.5 J/cm2 irradiation showed no significantly changes in platelet surface expression of P-Selectin and the levels of P-Selectin on plasma.However,after a dose of 2 J/cm2,there were significantly increases in platelt surface expression of P-selectin and the levels of P-selectin in plasma as compared to nonirradiation group after 1 ady storage.UVB irradiation of platelet conlentratesat dose up to 2 J/cm2 does not induce significant platelet activation following 5 day storage,it ia likely that 2 J/cm2 UVB irradiation followed by 1 day storage will adversely affect platelet activation.
, 百拇医药
Key words: utraviolet;platlet/activation;irradiation;P-Selectin
血小板在临床输注过程中常由于同种免疫反应的发生而引起血小板输注无效，研究表明可以通过白细胞滤器过滤及紫外线照射来预防。此外，血小板的活化与损伤导致血小板功能丧失也是造成输血失败的原因之一，为了研究浓缩血小板经紫外线照射后对血小板活化的影响，我们对血小板膜表面P-Selectin的分子数及血浆中P-Selectin的含量进行了观察。以探讨浓缩血小板经紫外线照射后的最佳输液时间。
1 材料和方法
1.1 浓缩血小板制备
采用PRP[1]法，将分离的浓缩血小板分为四份，分别用作正常对照组及不同剂量紫外线照射组。
, 百拇医药
1.2 紫外线照射方法
将浓缩血小板放入一次性照血袋(长春亚星光电有限公司生产，紫外线透光率>78%)中，照射厚度为1 cm，紫外线波长范围为280～320 nm，最大波长为310 nm，紫外线照射功率为2.08 mW/cm2(采用UVR-310型紫外线强度计测定)，照射时间分别为8 min,12 min及16 min，照射强度分别为1.0 J/cm2，1.5 J/cm2，2 J/cm2，照射过程不断振荡以保证均匀照射，照射后与对照组一同保存于血小板保存箱中，并分别于保存0天，1天，3天，5天取样待检。
1.3 血小板表面P-Selectin分子数测定
采用放射免疫分析法，取2.5×106血小板数的浓缩血小板，苔氏液洗涤一次，加入50 μl125I标记的单克隆抗体SZ51(苏州医学院血栓与止血研究室提供)，室温下静置30分钟，苔氏液洗涤三次，于γ计数仪上测定待测物的每分钟计数值，并将此值换算成每血小板上P-Selectin表达的分子数。
, http://www.100md.com
1.4 血浆内P-Selectin含量测定
采用双抗体夹心ELISA法(试剂盒由上海太阳医学生物技术公司提供)。
1.5 统计学处理
采用t检验。
2 结果
(1)对照组与经三种不同剂量照射的浓缩血小板中血小板计数在保存5天后虽有降低，但与保存前比较并无显著差异(P>0.05)。
(2)对照组在保存3天后，血小板表面(P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度显著升高，与保存前比较差异显著(P<0.05)，至第5天后差异更为显著(P<0.001)。
(3)经1 J/cm2于1.5 J/cm2 UVB照射后，血小板表面P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度于保存3天后明显升高，并与保存前比较有显著升高(P<0.05)，至保存5天后差异十分显著(P<0.001)，在保存期内，与对照组之间比较无显著差异(P>0.05)。
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(4)经2 J/cm2 UVB照射后，血小板表面P-Selectin分子数与血浆中P-Selectin浓度于保存24 hr后即显著升高(P<0.05)，当保存5天后，与保存前比较极为显著(P<0.001)，并与保存的第1，3，5天与对照组比较均有明显差异(P<0.05)。结果见表1。
表1 不同剂量紫外线照射对血小板表面及血浆中P-Selectin含量的影响(
±s,n=10) 保存时间(天)
对照组
照 射 组
1 J/cm2
1.5 J/cm2
, 百拇医药
2.0 J/cm2
0天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
1524±865
1602±923
1586±907
1554±785
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
41.0±9.2
, 百拇医药
42.6±7.9
38.9±10.1
41.8±9.0
血小板计数(×109/L)
1481±175
1521±108
1483±132
1509±147
1天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
, 百拇医药
1963±792
2022±835
1991±828
2375±691*△
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
42.6±8.4
43.1±6.6
43.7±9.1
52.4±8.9*△
血小板计数(×109/L)
, 百拇医药
1470±181
1510±130
1482±146
1501±161
3天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
2475±734*
2392±680*
2414±781*
3212±655**△
, 百拇医药
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
59.2±23.5*
66.4±29.6*
63.1±26.6**
89.2±27.5**△
血小板计数(×109/L)
1452±137
1498±149
1464±171
, 百拇医药
1488±151
5天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
3189±884**
3377±702**
3481±803**
4265±798**△
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
, 百拇医药 85.6±33.4**
89.1±31.7**
91.4±36.2**
148±30.4**△
血小板计数(×109/L)
1431±129
1481±163
1438±156
1452±170
*P<0.05与保存前比较，**P<0.001与保存前比较，△P<0.05与对照组，1 J/cm2照射组，2 J/cm2照射组比较
, 百拇医药
3 讨论
P-Selectin作为选择素(Selectin)超家族的成员之一，分布于静止血小板内α一颗粒膜上，当血小板受刺激活化时，P-Seletin随α一颗粒内容物的释放而质膜融合，表达于活化血小板质膜表面，因此，P-Selectin可作为血小板活化的特异标志之一。
UVB照射预防HLA同种免疫的研究有不少报道，但如何作好照射的质量控制是关键所在，即对白细胞有效地灭活而对正常血细胞无或尽量少的副作用，但是已往的研究所用照射剂量各不相同，结果也不一致，Pamphilon等报道以0.3 J/cm2 UVB照射，即能有效地抑制混合淋巴细胞反应，但随保存时间的延长会影响血小板功能[2]，若以6 J/cm2进行照射，则对血小血板聚集功能有明显影响[3]。Johnson等曾用0.6 J/cm2、2.4 J/cm2及10 J/cm2的UVB对浓缩血小板进行照射后保存96hr后，LDH、β-TG含量与ATP代谢均与对照组无明显差异，但如以10 J/cm2 的UVB照射会对血小板体外功能有明显影响[4]，而以4 J/cm2，8 J/cm2 UVB照射浓缩血小板时，会使血小板在保存过程中P-Selectin表达增加，且与照射剂量相关[5]。
, 百拇医药
从本实验结果可以看出，浓缩血小板在保存过程中随时间的延长，会造成血小板表面P-Selectin分子数持续增加，说明血小板处于不断激活状态，此外，血浆中P-Selectin含量也随保存时间的延长而不断增加，其可能来源有：(1)活化或衰老的血小板破裂形成碎片至血浆中；(2)活化血小板表面的微颗粒脱落；(3)血小板活化时可溶性P-Selectin释放至血浆内[6]，因此浓缩血小板在保存过程中血浆内P-Selectin的含量的升高与血小板的活化破坏有关。如以1 J/cm2，1.5J /cm2 UVB照射浓缩血小板，不会造成明显的血小板激活，但如以2 /cm2 UVB进行照射时，要保存24 hr后，即会造成明显的血小板激活，因此随着UVB照射剂量的升高，会明显加快血小板的激活，经紫外线照射后的浓缩血小板在临床应用时应尽量减少保存时间，以免影响临床输注效果。
参考文献：
1 肖星甫.输血技术手册[M].成都：四川科学技术出版社，1992：180.
, 百拇医药
2 Pamphilon DH,Potter M,Cutts M,et al.Platelet concentrates irradiated with ultraviolet light retain satisfactory in vito storage characteristics and in vivo survival.Br J Haematol,1990,75:240.
3 Andreu G,Boccaccio C,Lecrubier C,et al.Ultraviolet irradiation of platelet concentrates:feasibility in transfusion practice.Transfusion,1990,30:401.
4 Johnson RB,Napychank PA,Murphy S,et al.In vitro changes in pltelet function and metabolism following increasing doses of uitraviolet-B irradiation.Transfusion,193,33(3):249.
, http://www.100md.com
5 Grijzenhout MA,Aarts-Riemans MI,Akkerma JM,et al.Utraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation marlcers with storage.Br J Haematol,1993,83(4):627.
6 Dunlop LC,Skinner MP,Bendall LJ,et al.Detection and pruification of soluble plasma GMP-140.Thromb Haemostas,1990.65.
收稿日期1998-11-18, http://www.100md.com
单位：第四军医大学 西京医院输血科，陕西 西安 710032
关键词：紫外线；血小板/活化；照射；P-Selectin
中国医学物理学杂志990418 摘要： 探讨经不同剂量B波段紫外线(UVB)照射后对浓缩血小板在保存过程中血小板活化的影响。用PRP法制备浓缩血小板，采用1 J/cm2、1.5 J/cm2、2 J/cm2UVB进行照射，常规保存5天，间隔取样分别用RIA、ELISA方法检测血小板表面及血浆中P-Selectin的含量。结果表明：1 J/cm2、1.5 J/cm2UVB照射组与对照组一样，于保存3天后，血小板表面P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度明显升高(P<0.05)，在保存5天后含量进一步升高，差异更为明显(P<0.001)。2 J/cm2UVB照射组于保存1天后血小板表面P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度即明为升高(P<0.05)，在保存3天后，差异更为显著(P<0.001)。上述结果提示：以小于2 J/cm2 UVB照射在5天的保存期内不会引起明显的血小板活化，而大于2 J/cm2 UVB照射会促进血小板的活化，不利于血小板的保存。
, 百拇医药
中图分类号：R331.1+43 文献标识码：A
文章编号：1005-202X(1999)04-
Actiuation of platelet in atored platelet concentrates following variable doses of ultraviolet b irradiation
ZHANG Xian-Qing,ZHANG Li，LI Cui-ying,et al.
(Department of Blood Transfusion,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
Abstract: To evaluate the platelet activation of stored platelet concentrates irradiated by variavle doses of ultravioet B irradiation.Platelet concentrates were prapared by PRP methods.Platelet surface expression of P-selectin was determined by RIA,and P-selectin in plasma was determined by ELISA.Platelet concentrates were irradiated at UVB doses of 1 J/cm2,1.5 J/cm2,2 J/cm2 and stored up to 5 days on standard blood bank conditions.Compared to nonirradiated group,the irradiated unitsof 1 J/cm2,1.5 J/cm2 irradiation showed no significantly changes in platelet surface expression of P-Selectin and the levels of P-Selectin on plasma.However,after a dose of 2 J/cm2,there were significantly increases in platelt surface expression of P-selectin and the levels of P-selectin in plasma as compared to nonirradiation group after 1 ady storage.UVB irradiation of platelet conlentratesat dose up to 2 J/cm2 does not induce significant platelet activation following 5 day storage,it ia likely that 2 J/cm2 UVB irradiation followed by 1 day storage will adversely affect platelet activation.
, 百拇医药
Key words: utraviolet;platlet/activation;irradiation;P-Selectin
血小板在临床输注过程中常由于同种免疫反应的发生而引起血小板输注无效，研究表明可以通过白细胞滤器过滤及紫外线照射来预防。此外，血小板的活化与损伤导致血小板功能丧失也是造成输血失败的原因之一，为了研究浓缩血小板经紫外线照射后对血小板活化的影响，我们对血小板膜表面P-Selectin的分子数及血浆中P-Selectin的含量进行了观察。以探讨浓缩血小板经紫外线照射后的最佳输液时间。
1 材料和方法
1.1 浓缩血小板制备
采用PRP[1]法，将分离的浓缩血小板分为四份，分别用作正常对照组及不同剂量紫外线照射组。
, 百拇医药
1.2 紫外线照射方法
将浓缩血小板放入一次性照血袋(长春亚星光电有限公司生产，紫外线透光率>78%)中，照射厚度为1 cm，紫外线波长范围为280～320 nm，最大波长为310 nm，紫外线照射功率为2.08 mW/cm2(采用UVR-310型紫外线强度计测定)，照射时间分别为8 min,12 min及16 min，照射强度分别为1.0 J/cm2，1.5 J/cm2，2 J/cm2，照射过程不断振荡以保证均匀照射，照射后与对照组一同保存于血小板保存箱中，并分别于保存0天，1天，3天，5天取样待检。
1.3 血小板表面P-Selectin分子数测定
采用放射免疫分析法，取2.5×106血小板数的浓缩血小板，苔氏液洗涤一次，加入50 μl125I标记的单克隆抗体SZ51(苏州医学院血栓与止血研究室提供)，室温下静置30分钟，苔氏液洗涤三次，于γ计数仪上测定待测物的每分钟计数值，并将此值换算成每血小板上P-Selectin表达的分子数。
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1.4 血浆内P-Selectin含量测定
采用双抗体夹心ELISA法(试剂盒由上海太阳医学生物技术公司提供)。
1.5 统计学处理
采用t检验。
2 结果
(1)对照组与经三种不同剂量照射的浓缩血小板中血小板计数在保存5天后虽有降低，但与保存前比较并无显著差异(P>0.05)。
(2)对照组在保存3天后，血小板表面(P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度显著升高，与保存前比较差异显著(P<0.05)，至第5天后差异更为显著(P<0.001)。
(3)经1 J/cm2于1.5 J/cm2 UVB照射后，血小板表面P-Selectin分子数及血浆中P-Selectin浓度于保存3天后明显升高，并与保存前比较有显著升高(P<0.05)，至保存5天后差异十分显著(P<0.001)，在保存期内，与对照组之间比较无显著差异(P>0.05)。
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(4)经2 J/cm2 UVB照射后，血小板表面P-Selectin分子数与血浆中P-Selectin浓度于保存24 hr后即显著升高(P<0.05)，当保存5天后，与保存前比较极为显著(P<0.001)，并与保存的第1，3，5天与对照组比较均有明显差异(P<0.05)。结果见表1。
表1 不同剂量紫外线照射对血小板表面及血浆中P-Selectin含量的影响(
±s,n=10) 保存时间(天)对照组
照 射 组
1 J/cm2
1.5 J/cm2
, 百拇医药
2.0 J/cm2
0天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
1524±865
1602±923
1586±907
1554±785
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
41.0±9.2
, 百拇医药
42.6±7.9
38.9±10.1
41.8±9.0
血小板计数(×109/L)
1481±175
1521±108
1483±132
1509±147
1天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
, 百拇医药
1963±792
2022±835
1991±828
2375±691*△
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
42.6±8.4
43.1±6.6
43.7±9.1
52.4±8.9*△
血小板计数(×109/L)
, 百拇医药
1470±181
1510±130
1482±146
1501±161
3天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
2475±734*
2392±680*
2414±781*
3212±655**△
, 百拇医药
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
59.2±23.5*
66.4±29.6*
63.1±26.6**
89.2±27.5**△
血小板计数(×109/L)
1452±137
1498±149
1464±171
, 百拇医药
1488±151
5天
血小板表面P-Selectin
分子数(分子数/血小板)
3189±884**
3377±702**
3481±803**
4265±798**△
血浆P-Selectin含量
(μg/L)
, 百拇医药 85.6±33.4**
89.1±31.7**
91.4±36.2**
148±30.4**△
血小板计数(×109/L)
1431±129
1481±163
1438±156
1452±170
*P<0.05与保存前比较，**P<0.001与保存前比较，△P<0.05与对照组，1 J/cm2照射组，2 J/cm2照射组比较
, 百拇医药
3 讨论
P-Selectin作为选择素(Selectin)超家族的成员之一，分布于静止血小板内α一颗粒膜上，当血小板受刺激活化时，P-Seletin随α一颗粒内容物的释放而质膜融合，表达于活化血小板质膜表面，因此，P-Selectin可作为血小板活化的特异标志之一。
UVB照射预防HLA同种免疫的研究有不少报道，但如何作好照射的质量控制是关键所在，即对白细胞有效地灭活而对正常血细胞无或尽量少的副作用，但是已往的研究所用照射剂量各不相同，结果也不一致，Pamphilon等报道以0.3 J/cm2 UVB照射，即能有效地抑制混合淋巴细胞反应，但随保存时间的延长会影响血小板功能[2]，若以6 J/cm2进行照射，则对血小血板聚集功能有明显影响[3]。Johnson等曾用0.6 J/cm2、2.4 J/cm2及10 J/cm2的UVB对浓缩血小板进行照射后保存96hr后，LDH、β-TG含量与ATP代谢均与对照组无明显差异，但如以10 J/cm2 的UVB照射会对血小板体外功能有明显影响[4]，而以4 J/cm2，8 J/cm2 UVB照射浓缩血小板时，会使血小板在保存过程中P-Selectin表达增加，且与照射剂量相关[5]。
, 百拇医药
从本实验结果可以看出，浓缩血小板在保存过程中随时间的延长，会造成血小板表面P-Selectin分子数持续增加，说明血小板处于不断激活状态，此外，血浆中P-Selectin含量也随保存时间的延长而不断增加，其可能来源有：(1)活化或衰老的血小板破裂形成碎片至血浆中；(2)活化血小板表面的微颗粒脱落；(3)血小板活化时可溶性P-Selectin释放至血浆内[6]，因此浓缩血小板在保存过程中血浆内P-Selectin的含量的升高与血小板的活化破坏有关。如以1 J/cm2，1.5J /cm2 UVB照射浓缩血小板，不会造成明显的血小板激活，但如以2 /cm2 UVB进行照射时，要保存24 hr后，即会造成明显的血小板激活，因此随着UVB照射剂量的升高，会明显加快血小板的激活，经紫外线照射后的浓缩血小板在临床应用时应尽量减少保存时间，以免影响临床输注效果。
参考文献：
1 肖星甫.输血技术手册[M].成都：四川科学技术出版社，1992：180.
, 百拇医药
2 Pamphilon DH,Potter M,Cutts M,et al.Platelet concentrates irradiated with ultraviolet light retain satisfactory in vito storage characteristics and in vivo survival.Br J Haematol,1990,75:240.
3 Andreu G,Boccaccio C,Lecrubier C,et al.Ultraviolet irradiation of platelet concentrates:feasibility in transfusion practice.Transfusion,1990,30:401.
4 Johnson RB,Napychank PA,Murphy S,et al.In vitro changes in pltelet function and metabolism following increasing doses of uitraviolet-B irradiation.Transfusion,193,33(3):249.
, http://www.100md.com
5 Grijzenhout MA,Aarts-Riemans MI,Akkerma JM,et al.Utraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation marlcers with storage.Br J Haematol,1993,83(4):627.
6 Dunlop LC,Skinner MP,Bendall LJ,et al.Detection and pruification of soluble plasma GMP-140.Thromb Haemostas,1990.65.
收稿日期1998-11-18, http://www.100md.com