蛋白激酶C抑制剂对脑缺血大鼠突触体游离钙的影响
作者：陈康宁 董为伟
单位：陈康宁(第三军医大学附属西南医院神经内科，重庆 400038)；董为伟(重庆医科大学神经病学研究所，重庆 400041)
关键词：钙超载；蛋白激酶C；脑缺血/再灌流
第三军医大学学报000104
提要 目的：探讨蛋白激酶C(Protein kinaseC,PKC)参与神经损伤的机制。方法：采用大鼠全脑缺血模型，观察脑缺血/再灌流后突触体游离钙的变化及PKC的抑制剂灯盏花对突触体游离钙的影响。结果：脑缺血/再灌流可以导致突触体游离钙增加的抑制剂灯盏花可以阻止脑缺血/再灌流导致突触体游离钙增加。结论：PKC参与神经元缺血性损伤可能与其促进钙内流有关。
中图法分类号 R743.31;R977.3 文献标识码 A
, 百拇医药
文章编号：1000-5404(2000)01-0012-03
Effects of protein kinase C inhibitor on intraneuronal free calcium content in rats with cerebral ischemia
CHEN Kang-ning,DONG Wei-wei
(Department of Neurology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective:To investigate the role of protein kinase C (PKC) in ischemic neuronal injury.Methods:After the model of ischemia/reperfusion was established in male Wistar rats,the changes of activity of PKC and intraneuronal free calcium content were observed.Meanwhile,the effects of Dengzhanhua,the PKC inhibitor,on the two parameters were also observed.Results:Cerebral ischemia/reperfusion resulted in the increase of intraneuronal free calcium content and activation of PKC.Dengzhanhua could prevent this change.Conclusion:PKC plays an important role in ischemic neuronal injury through inducing calcium overload.
, http://www.100md.com
Key words calcium overload; protein kinase C; cerebral ischemia/reperfusion
1977年，Takai发现了蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)。其后的研究发现该酶在细胞信号传导中起重要的作用。近年来的研究表明PKC激活参与了神经元的缺血损伤。但是，PKC激活参与神经元缺血损伤的机制尚不清楚。为此，本研究以大鼠全脑缺血/再灌流模型，观察脑缺血/再灌流神经元游离钙的变化及PKC抑制剂对上述变化的影响，旨在探讨PKC激活参与神经元损伤的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
健康Wistar大鼠36只，随机分成缺血前、缺血20min、缺血20min再灌流1、6h及1、4d组，每组动物6只。实验动物由我校实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
主要试剂：Fura-2/AM从中国医学科学院购得。其他试剂均为国产分析纯。PKC抑制剂灯盏花注射液由云南生物制药厂提供。
1.2 方法
1.2.1 Wistar大鼠全脑缺血模型制作 采用改良的Pulsinelli法[1]。断头取脑，用于钙测定。
1.2.2 突触体内游离钙的测定 参照我们既往的方法[2]可测得突触体内的游离钙(nmol/L)。
1.2.3 PKC活性测定 参照我们既往的方法[3]。
1.2.4 药物干预 用灯盏花按每次4mg/kg，腹腔内注射。缺血前15min及缺血后20min各给药1次。
1.3 统计学处理
, 百拇医药
采用Oxstat-Ⅱ进行统计学处理。
2 结果
2.1 大鼠脑缺血/再灌流后突触体游离钙含量的变化
结果见表1。
表1 灯盏花对缺血大鼠神经元游离钙的影响(CB/nmol.L，n=6,
)
Tab1 Effect of Dengzhanghua on free calcium content in cerebral ischemia rats(CB/nmol.L，n=6,)
, http://www.100md.com
Preischemic
Ischemia 20 min
Ischemia 20 min with reperfusion
1h
6h
1d
4d
Untreated
130.90±8.07
232.32±8.32☆
427.34±37.36☆
, 百拇医药
1005.46±89.12☆
907.58±89.12☆
762.60±36.74☆
Treated
98.47±9.04
182.72±7.61☆★
254.24±12.54☆★
451.17±12.87☆★
430.25±13.12☆★
, 百拇医药
370.43±9.38☆★
2.2 大鼠脑缺血/再灌流后PKC活性的变化，见表2 表2 灯盏花对缺血大鼠神经元蛋白激酶C活性的影响(λB/pmol.min-1.mg-1,n=6,)
Tab2 Effect of Dengzhanghua on protein kinase C activity in cerebral ischemia rats(λB/pmol.min-1.mg-1,n=6,)
, 百拇医药
Preischemic
Ischemia 20 min
Ischemia 20 min with reperfusion
1h
6h
1d
4d
PKCm
2.83±0.61
7.68±0.61☆★
7.81±1.47☆★
, http://www.100md.com
12.39±0.77☆★
12.39±1.39☆★
12.66±1.48☆
Treated
2.82±0.58
3.64±1.09
4.21±0.65
5.51±0.47
6.80±0.39
6.03±0.71
PKCc
, http://www.100md.com
6.61±0.30
4.45±0.40☆★
2.61±0.30☆★
1.67±0.60☆★
0.94±0.18☆★
0.82±0.35☆★
Treated
6.56±0.42
5.55±0.55
4.77±0.78
, 百拇医药
3.73±0.41
3.29±0.32
4.17±0.20
PKCm:PKC activity of membrane;PKCc:Cytosolic PKC activity;☆:P<0.001 vs preischemic;★:P<0.001 vs treated
3 讨论
3.1 大鼠脑缺血/再灌流神经元游离钙的变化及钙参与神经元损伤的机制
我们的研究发现随脑缺血/再灌流诱导了神经元的钙超载。正常神经元内的游离钙浓度很低，只有细胞外浓度的十万分之一。如此高的电化学梯度是依赖于细胞对钙的主动排出和细胞对钙的相对无通透性来完成的。细胞内的钙平衡对细胞生理功能的正常发挥是非常重要的。细胞通过对钙的主动泵出、细胞内的钙储、某些蛋白的结合等机制来维持细胞内的钙平衡。而脑缺血/再灌流时细胞能量代谢受阻，钙排除受阻；细胞膜对钙的屏障功能遭破坏(大量自由基生成)；兴奋性氨基酸大量释放；PKC的激活等因素促进了钙内流。PKC通过多种途径参与了钙内流，如直接修饰钙通道[4]、促进自由基的生成、消耗ATP[5]及降低G蛋白依赖的钙通道抑制作用[6]等。
, 百拇医药
钙超载参与神经元损伤的机制目前尚不清楚，我们推测可能与钙超载破坏了线粒体的结构和功能；激活多种蛋白(激)酶；钙超载诱导神经元凋亡；钙超载可以激活PKC，PKC可以通过多种途径来引起神经元的凋亡。
3.2 钙超载与PKC激活的关系
我们既往的研究发现脑缺血/再灌流可以激活PKC[3]。PKC的激活参与了钙超载[2]。PKC的激活参与了钙超载的可能机制[7]：①PKC磷酸化底物，消耗了ATP；②PKC磷酸化NMDA受体，使其开启更容易，而且Mg2+对其的阻滞作用明显降低，从而导致钙内流；③PKC的激活可以降低G蛋白依赖的钙通道抑制作用，从而钙通过这些通道大量内流；④PKC的激活抑制了神经元对兴奋性氨基酸的摄取，加重了神经元外的兴奋性氨基酸的堆积；⑤PKC的激活磷酸化电压依赖的钙通道，直接促进钙内流；⑥PKC的激活可以通过钙依赖和非依赖的机制引起血管收缩，加重缺血缺氧。
, 百拇医药
灯盏花注射液的有效成分是灯盏花素，它是从菊科短亭飞蓬[Erigeronbreviscapus(Vand)Hand-Nazz]灯盏花中提取的。徐光等[8]的研究表明，灯盏花素是在黄芩素的4′位接上一个羟基，其对PKC有很强的抑制作用。
我们的研究发现灯盏花通过抑制PKC，从而防止了脑缺血诱导的钙超载。钙超载可以一系列病理生理变化，引起神经元的缺血损伤。所以我们推测灯盏花可以防止钙超载导致的神经元损伤。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670269)
作者简介：陈康宁(1964.8)，男，四川省雅安市人，博士，副主任医师，副教授，主要从事脑血管病、神经症方面的研究，发表论文16篇。电话：(023)68754000-73079
参考文献
, 百拇医药
[1] Pulsinelli W A,Brierley J B.A new model of bilateral in the unanesthesized rat hemispheric ischemia[J].Stroke,1979,102(3):26-271.
[2]陈康宁，董为伟，张帆.蛋白激酶C激动剂PMA对培养神经元胞内游离钙的影响[J].第三军医大学学报，1997，19(5)：408-410.
[3]陈康宁，董为伟.大鼠全脑缺血/再灌流脑组织蛋白激酶C活性变化[J].第三军医大学学报，1998，20(5)：398-400.
[4] Hall K E,Browning M D,Dudek,et al.Enhancement of high threshold calcium currents in rat primary afferent neuron by constitutively active protein kinase C[J].J Neurosci,1995,15(5):6069-6076.
, http://www.100md.com
[5]王福庄，刘振伟，王要航，等.降钙素基因相关肽对缺氧时海马细胞内游离钙的影响[J].中国应用生理杂志，1994，10(4)：325-327.
[6] Swartz K J.Modulation of Ca2+ channels by kinase C in rat central and peripheral neurons:Distriuption of G protein-mediated inhition[J].Neuron,1993,11(2):305-320.
[7]陈康宁，董为伟.PKC与脑缺血损伤[J].国外医学：内科学分册，1996，23(4)：164-167.
[8]徐光，张礼萍，沈慧芳，等.野黄芩甙元及其类似物对蛋白激酶C的抑制作用[J].上海医科大学学报，1993，20(6)：187-190.
收稿日期：1999-03-20
修回日期：1999-10-21, http://www.100md.com
单位：陈康宁(第三军医大学附属西南医院神经内科，重庆 400038)；董为伟(重庆医科大学神经病学研究所，重庆 400041)
关键词：钙超载；蛋白激酶C；脑缺血/再灌流
第三军医大学学报000104
提要 目的：探讨蛋白激酶C(Protein kinaseC,PKC)参与神经损伤的机制。方法：采用大鼠全脑缺血模型，观察脑缺血/再灌流后突触体游离钙的变化及PKC的抑制剂灯盏花对突触体游离钙的影响。结果：脑缺血/再灌流可以导致突触体游离钙增加的抑制剂灯盏花可以阻止脑缺血/再灌流导致突触体游离钙增加。结论：PKC参与神经元缺血性损伤可能与其促进钙内流有关。
中图法分类号 R743.31;R977.3 文献标识码 A
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文章编号：1000-5404(2000)01-0012-03
Effects of protein kinase C inhibitor on intraneuronal free calcium content in rats with cerebral ischemia
CHEN Kang-ning,DONG Wei-wei
(Department of Neurology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective:To investigate the role of protein kinase C (PKC) in ischemic neuronal injury.Methods:After the model of ischemia/reperfusion was established in male Wistar rats,the changes of activity of PKC and intraneuronal free calcium content were observed.Meanwhile,the effects of Dengzhanhua,the PKC inhibitor,on the two parameters were also observed.Results:Cerebral ischemia/reperfusion resulted in the increase of intraneuronal free calcium content and activation of PKC.Dengzhanhua could prevent this change.Conclusion:PKC plays an important role in ischemic neuronal injury through inducing calcium overload.
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Key words calcium overload; protein kinase C; cerebral ischemia/reperfusion
1977年，Takai发现了蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)。其后的研究发现该酶在细胞信号传导中起重要的作用。近年来的研究表明PKC激活参与了神经元的缺血损伤。但是，PKC激活参与神经元缺血损伤的机制尚不清楚。为此，本研究以大鼠全脑缺血/再灌流模型，观察脑缺血/再灌流神经元游离钙的变化及PKC抑制剂对上述变化的影响，旨在探讨PKC激活参与神经元损伤的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
健康Wistar大鼠36只，随机分成缺血前、缺血20min、缺血20min再灌流1、6h及1、4d组，每组动物6只。实验动物由我校实验动物中心提供。
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主要试剂：Fura-2/AM从中国医学科学院购得。其他试剂均为国产分析纯。PKC抑制剂灯盏花注射液由云南生物制药厂提供。
1.2 方法
1.2.1 Wistar大鼠全脑缺血模型制作 采用改良的Pulsinelli法[1]。断头取脑，用于钙测定。
1.2.2 突触体内游离钙的测定 参照我们既往的方法[2]可测得突触体内的游离钙(nmol/L)。
1.2.3 PKC活性测定 参照我们既往的方法[3]。
1.2.4 药物干预 用灯盏花按每次4mg/kg，腹腔内注射。缺血前15min及缺血后20min各给药1次。
1.3 统计学处理
, 百拇医药
采用Oxstat-Ⅱ进行统计学处理。
2 结果
2.1 大鼠脑缺血/再灌流后突触体游离钙含量的变化
结果见表1。
表1 灯盏花对缺血大鼠神经元游离钙的影响(CB/nmol.L，n=6,
)Tab1 Effect of Dengzhanghua on free calcium content in cerebral ischemia rats(CB/nmol.L，n=6,
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Preischemic
Ischemia 20 min
Ischemia 20 min with reperfusion
1h
6h
1d
4d
Untreated
130.90±8.07
232.32±8.32☆
427.34±37.36☆
, 百拇医药
1005.46±89.12☆
907.58±89.12☆
762.60±36.74☆
Treated
98.47±9.04
182.72±7.61☆★
254.24±12.54☆★
451.17±12.87☆★
430.25±13.12☆★
, 百拇医药
370.43±9.38☆★
2.2 大鼠脑缺血/再灌流后PKC活性的变化，见表2 表2 灯盏花对缺血大鼠神经元蛋白激酶C活性的影响(λB/pmol.min-1.mg-1,n=6,
)Tab2 Effect of Dengzhanghua on protein kinase C activity in cerebral ischemia rats(λB/pmol.min-1.mg-1,n=6,
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Preischemic
Ischemia 20 min
Ischemia 20 min with reperfusion
1h
6h
1d
4d
PKCm
2.83±0.61
7.68±0.61☆★
7.81±1.47☆★
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12.39±0.77☆★
12.39±1.39☆★
12.66±1.48☆
Treated
2.82±0.58
3.64±1.09
4.21±0.65
5.51±0.47
6.80±0.39
6.03±0.71
PKCc
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6.61±0.30
4.45±0.40☆★
2.61±0.30☆★
1.67±0.60☆★
0.94±0.18☆★
0.82±0.35☆★
Treated
6.56±0.42
5.55±0.55
4.77±0.78
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3.73±0.41
3.29±0.32
4.17±0.20
PKCm:PKC activity of membrane;PKCc:Cytosolic PKC activity;☆:P<0.001 vs preischemic;★:P<0.001 vs treated
3 讨论
3.1 大鼠脑缺血/再灌流神经元游离钙的变化及钙参与神经元损伤的机制
我们的研究发现随脑缺血/再灌流诱导了神经元的钙超载。正常神经元内的游离钙浓度很低，只有细胞外浓度的十万分之一。如此高的电化学梯度是依赖于细胞对钙的主动排出和细胞对钙的相对无通透性来完成的。细胞内的钙平衡对细胞生理功能的正常发挥是非常重要的。细胞通过对钙的主动泵出、细胞内的钙储、某些蛋白的结合等机制来维持细胞内的钙平衡。而脑缺血/再灌流时细胞能量代谢受阻，钙排除受阻；细胞膜对钙的屏障功能遭破坏(大量自由基生成)；兴奋性氨基酸大量释放；PKC的激活等因素促进了钙内流。PKC通过多种途径参与了钙内流，如直接修饰钙通道[4]、促进自由基的生成、消耗ATP[5]及降低G蛋白依赖的钙通道抑制作用[6]等。
, 百拇医药
钙超载参与神经元损伤的机制目前尚不清楚，我们推测可能与钙超载破坏了线粒体的结构和功能；激活多种蛋白(激)酶；钙超载诱导神经元凋亡；钙超载可以激活PKC，PKC可以通过多种途径来引起神经元的凋亡。
3.2 钙超载与PKC激活的关系
我们既往的研究发现脑缺血/再灌流可以激活PKC[3]。PKC的激活参与了钙超载[2]。PKC的激活参与了钙超载的可能机制[7]：①PKC磷酸化底物，消耗了ATP；②PKC磷酸化NMDA受体，使其开启更容易，而且Mg2+对其的阻滞作用明显降低，从而导致钙内流；③PKC的激活可以降低G蛋白依赖的钙通道抑制作用，从而钙通过这些通道大量内流；④PKC的激活抑制了神经元对兴奋性氨基酸的摄取，加重了神经元外的兴奋性氨基酸的堆积；⑤PKC的激活磷酸化电压依赖的钙通道，直接促进钙内流；⑥PKC的激活可以通过钙依赖和非依赖的机制引起血管收缩，加重缺血缺氧。
, 百拇医药
灯盏花注射液的有效成分是灯盏花素，它是从菊科短亭飞蓬[Erigeronbreviscapus(Vand)Hand-Nazz]灯盏花中提取的。徐光等[8]的研究表明，灯盏花素是在黄芩素的4′位接上一个羟基，其对PKC有很强的抑制作用。
我们的研究发现灯盏花通过抑制PKC，从而防止了脑缺血诱导的钙超载。钙超载可以一系列病理生理变化，引起神经元的缺血损伤。所以我们推测灯盏花可以防止钙超载导致的神经元损伤。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670269)
作者简介：陈康宁(1964.8)，男，四川省雅安市人，博士，副主任医师，副教授，主要从事脑血管病、神经症方面的研究，发表论文16篇。电话：(023)68754000-73079
参考文献
, 百拇医药
[1] Pulsinelli W A,Brierley J B.A new model of bilateral in the unanesthesized rat hemispheric ischemia[J].Stroke,1979,102(3):26-271.
[2]陈康宁，董为伟，张帆.蛋白激酶C激动剂PMA对培养神经元胞内游离钙的影响[J].第三军医大学学报，1997，19(5)：408-410.
[3]陈康宁，董为伟.大鼠全脑缺血/再灌流脑组织蛋白激酶C活性变化[J].第三军医大学学报，1998，20(5)：398-400.
[4] Hall K E,Browning M D,Dudek,et al.Enhancement of high threshold calcium currents in rat primary afferent neuron by constitutively active protein kinase C[J].J Neurosci,1995,15(5):6069-6076.
, http://www.100md.com
[5]王福庄，刘振伟，王要航，等.降钙素基因相关肽对缺氧时海马细胞内游离钙的影响[J].中国应用生理杂志，1994，10(4)：325-327.
[6] Swartz K J.Modulation of Ca2+ channels by kinase C in rat central and peripheral neurons:Distriuption of G protein-mediated inhition[J].Neuron,1993,11(2):305-320.
[7]陈康宁，董为伟.PKC与脑缺血损伤[J].国外医学：内科学分册，1996，23(4)：164-167.
[8]徐光，张礼萍，沈慧芳，等.野黄芩甙元及其类似物对蛋白激酶C的抑制作用[J].上海医科大学学报，1993，20(6)：187-190.
收稿日期：1999-03-20
修回日期：1999-10-21, http://www.100md.com