SiO2尘刺激肺泡巨噬细胞上清液对Mv-1-lu细胞迁移的影响
作者：毛国根 方海林 张琪凤
单位：310031 杭州，浙江大学公共卫生学院(毛国根、张琪凤),传染病研究所(方海林)
关键词：二氧化硅；肺泡上皮细胞；细胞迁移
中华劳动卫生职业病杂志990102
【摘要】 目的 探讨SiO2刺激肺泡巨噬细胞(PAM)的上清液对肺泡上皮细胞的迁移和增殖的影响。方法 采用Boyden-chamber系统，观察空白对照(0 μg/ml SiO2)和200 μg/ml SiO2刺激PAM的上清液(1.0×106～1.5×106 PAM/ml)对貂肺泡上皮细胞株Mv-1-lu细胞的迁移和增殖的影响。结果200 μg/ml SiO2PAM的上清液对Mv-1-lu细胞的迁移和增殖效应明显低于空白对照组。结论 SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞的迁移和增殖均有明显的抑制作用；SiO2吸入可以刺激PAM分泌某些因子，对肺泡上皮细胞损伤的修复产生抑制作用。
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Migration of Mv-1-lu cells chemoattracted by SiO2 stimulated PAM supernatants
Mao Guogen,Fang Hailin,Zhang Qifeng.School of the Public Health,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310031
【Abstract】 Objective To explore the migration and proliferation of pulmonary epithelial cells chemoattracted by SiO2 stimulated PAM supernatants and their effects on repair of injured pulmonary epithelium. Methods The Boyden-chamber system was employed to study the migration of Mv-1-lu cells,a normal mink lung epithelial cell line,elicited by control (0μg/ml SiO2) and 200μg/ml SiO2 stimulated PAM supernatants.In the meantime the effects of proliferation of these supernatants on Mv-1-lu cells were studied. Results The migratory index(MI) in migration assay and A570nm value of MTT assay induced by 200 μg/ml stimulated PAM supernatants were lower than those in control group. Conclusion Silica and PAM that ingested silica appear to inhibit migration and proliferation of the Mv-1-lu cells;PAM stimulated by silica may secrete some active factor to inhibit repair of pulmonary alveolar epithelium injured by deposited silicon dioxide.
, 百拇医药
【Key words】 Silicon dioxide Pulmonary epithelial cell Cellular migration
SiO2的吸入及吞噬了SiO2的肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophage,PAM)产生的一系列有害因素，对肺泡上皮细胞(Ⅰ型细胞)有损害作用，表现为肺泡结构的破坏和Ⅰ型上皮细胞的剥脱和死亡，以致肺间质裸露[1，2]。而肺泡上皮细胞的迁移和增殖对损伤的肺泡上皮修复有重要意义。我们观察了SiO2刺激PAM的上清液对体外培养的Mv-1-lu细胞(肺上皮细胞株)的迁移和增殖的影响，及其对肺泡上皮细胞损伤修复的意义。
材料与方法
1.大鼠PAM的纯化制备：按本研究室常规的方法制备和纯化PAM。健康SD大鼠(浙江大学湖滨校区实验动物中心提供，体重200g左右)，取肺,行支气管肺泡灌洗，收集灌洗液，离心，沉淀物用无血清RPMI1640洗3次。计数PAM，用10%NBS稀释成1.0×106～1.5×106PAM/ml的细胞悬液，37℃、5%CO2孵育1.5小时。弃去上清液，即得到较纯的PAM。
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2.SiO2刺激PAM的上清液制备：贴壁纯化后的PAM加入200μg/ml和不加SiO2(空白对照)的无血清RPMI 1640，继续培养24小时。收获上清液，15000 r/min离心，备用。
3.Mv-1-lu细胞：即正常貂肺泡上皮细胞株ATCC CCL-64，维持于含10%NBS、L-谷氨酰胺2 mmol/L、羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)25 mmol/L的RPMI 1640培养基中。迁移分析的Mv-1-lu细胞密度为2.5×106/ml～3.0×106/ml；四唑盐(MTT)分析的为1×105/ml。
4.细胞迁移分析(migration assay)：根据Microchamber技术[3-5]，采用48孔多孔培养板(multichambers，Nüclepore,tubingen,Germany)进行Mv-1-lu细胞的迁移分析。
, 百拇医药
上述收获的SiO2刺激PAM的上清液，用无血清RPMI 1640按1∶2、1∶8、1∶32、1∶128、1∶512的比例稀释后，加入多孔培养板的下层孔内，每孔30μl。同时用无血清RPMI 1640作空白对照。然后盖上10 μm厚的、经Ⅳ型胶原包被的多聚酯滤膜(polycarbonate membrane,Neuro Probe,MD)，孔径5 μm，膜上再加一封垫板，多孔培养板上层部分置于封垫板之上，用螺丝紧密固定。把生长良好的Mv-1-lu(2.5×106～3.0×106/ml无血清RPMI 1640)加入上层孔内，每孔40μl。整个多孔培养板放入37℃、5%CO2的培养箱内孵5小时。拆卸多孔培养板，取出多孔膜，用PBS湿润的棉球小心擦试多孔膜的上面，即接触上部分Mv-1-lu细胞面)。多孔膜下面的细胞即是迁移的细胞。
室温干燥后，用甲醇固定，苏木精染色。每个迁移孔随机选择5个视野，用高倍镜(×400)计数迁移细胞数目。计算其均数为每孔的迁移细胞数。迁移指数(migratory index,MI)：MI=T/C，其中T代表SiO2刺激PAM的上清液孔的迁移细胞数；C代表单纯的RPMI 1640孔的迁移细胞数。
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5.MTT分析：用常规的MTT分析测定SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞增殖的影响。SiO2刺激PAM的上清液用4%NBS RPMI 1640倍比稀释成含2%NBS的上清应用液。取生长良好的Mv-1-lu细胞(密度为1×105/ml)，在96孔细胞培养板中孵育24小时后，弃去上清液，加上述稀释的上清应用液各200μl。继续孵育20小时后，加入5mg/ml MTT溶液20μl。继续培养4小时，弃去上清液，加入150μl DMSO，振荡10分钟。酶标仪上测定SiO2刺激组和空白对照组A570 nm值。
结 果
1.SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞迁移的影响：不同稀释倍数的SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞迁移指数影响的关系。从表1中可看出：200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞的迁移指数比空白对照组上清液的迁移指数要小(P<0.05)。提示SiO2刺激PAM的上清液可能对Mv-1-lu细胞的迁移有抑制作用。
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表1 不同稀释倍数的PAM上清液对Mv-1-lu细胞的迁移指数的影响(
±s,n=4)
Table 1 Effects of various dilutions of PAM
supernatant on MI of Mv-1-lu cells(±s,n=4)
PAM上清液的稀释倍数 Dilutions of PAM supernatant
1∶2
1∶8
1∶32
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1∶128
1∶512
200μg/mlSiO2△△
3.57±1.03**
2.79±0.98**
2.59±1.17
1.96±0.79
1.21±0.98
空白对照组Control
4.96±1.34
4.51±1.27
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3.35±1.15
2.73±1.14
0.98±0.54
实验组不同的稀释倍数间，△△P<0.01；与空白对照组相比,**P<0.01
△△P<0.01 among different dilute groups;**P<0.01 vs. control
2.SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞增殖的影响：2%NBS RPMI 1640、空白对照组、200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞增殖作用的MTT分析，在570 nm吸光度(A)值(±s,n=8)分别为：1.46±0.10，1.07±0.12和0.81±0.06。经单因素的方差分析和组间两两比较，P<0.05。
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讨 论
1.细胞迁移对肺组织上皮细胞损伤的修复作用的意义：细胞迁移是由一组趋化因子所介导的细胞运动。构成细胞趋化因子的成分可分为α和β趋化细胞因子家系[6]。目前的研究表明：细胞的迁移经常伴有细胞的增殖，并同时需要启动与迁移有关的一些机制[7]。上皮细胞迁移和增殖是损伤愈合的两个重要过程[8]。气管上皮损伤后，TNF-α可以诱发牛气管上皮细胞(BBEC)的迁移和增殖[9]。Kim[10]报道了支气管上皮细胞(GPTEC)在表皮生长因子(EGF)的作用下，发生迁移、趋化和增殖。表明肺上皮细胞损伤后的修复都有上皮细胞的迁移和增殖发生。
2.SiO2刺激PAM的上清液对肺泡上皮细胞迁移和增殖的抑制作用及其在上皮损伤修复中的意义：大鼠染尘后，肺上皮细胞的损伤可以通过Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的增殖，以及Ⅱ型肺泡上皮细胞的胞浆展平并覆盖损伤部位进行代偿性修复。本研究的实验结果显示：200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液，与空白对照组相比，肺泡上皮细胞Mv-1-lu的增生明显减少。同样，200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液使Mv-1-lu细胞的迁移功能也明显降低。说明SiO2可能刺激PAM产生、分泌某些相关的因子，对肺上皮细胞增殖和迁移产生抑制作用，进而阻碍肺泡上皮细胞的损伤修复。提示SiO2吸入在产生肺泡上皮损伤的同时又抑制了上皮细胞的损伤修复，两者相互促进。
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有关肺泡上皮细胞的损伤和修复抑制这一协同过程对石英染尘后的肺纤维化作用，乃至矽肺发生的意义，目前尚不明确。但从直观上理解，Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤、脱落，以至肺间质的裸露，对SiO2尘和尘细胞进入肺间质，或肺泡内SiO2尘直接作用于间质中成纤维细胞等应该有重要作用。所以,从这个意义推测SiO2尘吸入对Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤修复的抑制对矽肺的发生有促进作用。有关机制需作进一步的研究。
参 考 文 献
[1] 杨青.实验性大鼠矽肺纤维化扫描电镜观察.现代预防医学，1995，22：136-137.
[2] 王筑 移兰，刚葆琪主编.现代劳动卫生学.北京：人民卫生出版社，1994.59-60.
[3] Wang MH,Dlugosz AA,Sun Y,et al.Macrophage stimulating protein induces proliferation and migration of murine keratinocytes.Exp Cell Res,1996,226:29-46.
, 百拇医药
[4] Allavena P,Paganin C,Zhou D,et al.Interleukin-12 is chemotactic for natural killer cells and stimulates their interaction with vascular endothelium.Blood,1994,84:2261-2268.
[5] Tan J,Christian GL,Borbala G,et al.Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T cell lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte migration.J Immunol,1993,151:4545-4551.
[6] 叶棋浓.人趋化细胞因子超家族研究进展.国外医学免疫学分册，1995，18：7-11.
, 百拇医药
[7] Birchemier C,Birchemier W.Molecular aspects of mesenchymal-epithelial interactions.Annu Rev Cell Biol,1993,9:511-540.
[8] Nusrat A,Parkos CA,Bacara AE,et al.Hepatocyte growth factor/scatter factor effects on epithelia,regulation of intercellular functions in transformed and nontransformed cell lines,basolateral polarization of c-met receptor in transformed and natural intestinal epithelia,and induction of rapid wound repair in a transformed model epithelium.J Clin Invest,1994,93:2056-2065.
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[9] Wyatt TA,Ito H,Veys TJ,et al.Stimulation of protein kinase C activity by tumor necrosis factor-alpha in bovine bronchial epithelial cells.Am J Physiol,1997,273(5 Pt 1):L1007-1012.
[10] Kim JS,McKinnis VS,Nawrocki A,et al.Stimulation of migration and wound repair of guinea-pig airway epithelial cells in response to epidermal growth factor.Am J Respir Cell Mol Biol,1998,18:66-74.
(收稿：1998-04-27 修回：1998-06-10), 百拇医药
单位：310031 杭州，浙江大学公共卫生学院(毛国根、张琪凤),传染病研究所(方海林)
关键词：二氧化硅；肺泡上皮细胞；细胞迁移
中华劳动卫生职业病杂志990102
【摘要】 目的 探讨SiO2刺激肺泡巨噬细胞(PAM)的上清液对肺泡上皮细胞的迁移和增殖的影响。方法 采用Boyden-chamber系统，观察空白对照(0 μg/ml SiO2)和200 μg/ml SiO2刺激PAM的上清液(1.0×106～1.5×106 PAM/ml)对貂肺泡上皮细胞株Mv-1-lu细胞的迁移和增殖的影响。结果200 μg/ml SiO2PAM的上清液对Mv-1-lu细胞的迁移和增殖效应明显低于空白对照组。结论 SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞的迁移和增殖均有明显的抑制作用；SiO2吸入可以刺激PAM分泌某些因子，对肺泡上皮细胞损伤的修复产生抑制作用。
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Migration of Mv-1-lu cells chemoattracted by SiO2 stimulated PAM supernatants
Mao Guogen,Fang Hailin,Zhang Qifeng.School of the Public Health,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310031
【Abstract】 Objective To explore the migration and proliferation of pulmonary epithelial cells chemoattracted by SiO2 stimulated PAM supernatants and their effects on repair of injured pulmonary epithelium. Methods The Boyden-chamber system was employed to study the migration of Mv-1-lu cells,a normal mink lung epithelial cell line,elicited by control (0μg/ml SiO2) and 200μg/ml SiO2 stimulated PAM supernatants.In the meantime the effects of proliferation of these supernatants on Mv-1-lu cells were studied. Results The migratory index(MI) in migration assay and A570nm value of MTT assay induced by 200 μg/ml stimulated PAM supernatants were lower than those in control group. Conclusion Silica and PAM that ingested silica appear to inhibit migration and proliferation of the Mv-1-lu cells;PAM stimulated by silica may secrete some active factor to inhibit repair of pulmonary alveolar epithelium injured by deposited silicon dioxide.
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【Key words】 Silicon dioxide Pulmonary epithelial cell Cellular migration
SiO2的吸入及吞噬了SiO2的肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophage,PAM)产生的一系列有害因素，对肺泡上皮细胞(Ⅰ型细胞)有损害作用，表现为肺泡结构的破坏和Ⅰ型上皮细胞的剥脱和死亡，以致肺间质裸露[1，2]。而肺泡上皮细胞的迁移和增殖对损伤的肺泡上皮修复有重要意义。我们观察了SiO2刺激PAM的上清液对体外培养的Mv-1-lu细胞(肺上皮细胞株)的迁移和增殖的影响，及其对肺泡上皮细胞损伤修复的意义。
材料与方法
1.大鼠PAM的纯化制备：按本研究室常规的方法制备和纯化PAM。健康SD大鼠(浙江大学湖滨校区实验动物中心提供，体重200g左右)，取肺,行支气管肺泡灌洗，收集灌洗液，离心，沉淀物用无血清RPMI1640洗3次。计数PAM，用10%NBS稀释成1.0×106～1.5×106PAM/ml的细胞悬液，37℃、5%CO2孵育1.5小时。弃去上清液，即得到较纯的PAM。
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2.SiO2刺激PAM的上清液制备：贴壁纯化后的PAM加入200μg/ml和不加SiO2(空白对照)的无血清RPMI 1640，继续培养24小时。收获上清液，15000 r/min离心，备用。
3.Mv-1-lu细胞：即正常貂肺泡上皮细胞株ATCC CCL-64，维持于含10%NBS、L-谷氨酰胺2 mmol/L、羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)25 mmol/L的RPMI 1640培养基中。迁移分析的Mv-1-lu细胞密度为2.5×106/ml～3.0×106/ml；四唑盐(MTT)分析的为1×105/ml。
4.细胞迁移分析(migration assay)：根据Microchamber技术[3-5]，采用48孔多孔培养板(multichambers，Nüclepore,tubingen,Germany)进行Mv-1-lu细胞的迁移分析。
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上述收获的SiO2刺激PAM的上清液，用无血清RPMI 1640按1∶2、1∶8、1∶32、1∶128、1∶512的比例稀释后，加入多孔培养板的下层孔内，每孔30μl。同时用无血清RPMI 1640作空白对照。然后盖上10 μm厚的、经Ⅳ型胶原包被的多聚酯滤膜(polycarbonate membrane,Neuro Probe,MD)，孔径5 μm，膜上再加一封垫板，多孔培养板上层部分置于封垫板之上，用螺丝紧密固定。把生长良好的Mv-1-lu(2.5×106～3.0×106/ml无血清RPMI 1640)加入上层孔内，每孔40μl。整个多孔培养板放入37℃、5%CO2的培养箱内孵5小时。拆卸多孔培养板，取出多孔膜，用PBS湿润的棉球小心擦试多孔膜的上面，即接触上部分Mv-1-lu细胞面)。多孔膜下面的细胞即是迁移的细胞。
室温干燥后，用甲醇固定，苏木精染色。每个迁移孔随机选择5个视野，用高倍镜(×400)计数迁移细胞数目。计算其均数为每孔的迁移细胞数。迁移指数(migratory index,MI)：MI=T/C，其中T代表SiO2刺激PAM的上清液孔的迁移细胞数；C代表单纯的RPMI 1640孔的迁移细胞数。
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5.MTT分析：用常规的MTT分析测定SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞增殖的影响。SiO2刺激PAM的上清液用4%NBS RPMI 1640倍比稀释成含2%NBS的上清应用液。取生长良好的Mv-1-lu细胞(密度为1×105/ml)，在96孔细胞培养板中孵育24小时后，弃去上清液，加上述稀释的上清应用液各200μl。继续孵育20小时后，加入5mg/ml MTT溶液20μl。继续培养4小时，弃去上清液，加入150μl DMSO，振荡10分钟。酶标仪上测定SiO2刺激组和空白对照组A570 nm值。
结 果
1.SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞迁移的影响：不同稀释倍数的SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞迁移指数影响的关系。从表1中可看出：200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞的迁移指数比空白对照组上清液的迁移指数要小(P<0.05)。提示SiO2刺激PAM的上清液可能对Mv-1-lu细胞的迁移有抑制作用。
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表1 不同稀释倍数的PAM上清液对Mv-1-lu细胞的迁移指数的影响(
±s,n=4)Table 1 Effects of various dilutions of PAM
supernatant on MI of Mv-1-lu cells(
±s,n=4)PAM上清液的稀释倍数 Dilutions of PAM supernatant
1∶2
1∶8
1∶32
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1∶128
1∶512
200μg/mlSiO2△△
3.57±1.03**
2.79±0.98**
2.59±1.17
1.96±0.79
1.21±0.98
空白对照组Control
4.96±1.34
4.51±1.27
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3.35±1.15
2.73±1.14
0.98±0.54
实验组不同的稀释倍数间，△△P<0.01；与空白对照组相比,**P<0.01
△△P<0.01 among different dilute groups;**P<0.01 vs. control
2.SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞增殖的影响：2%NBS RPMI 1640、空白对照组、200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液对Mv-1-lu细胞增殖作用的MTT分析，在570 nm吸光度(A)值(
±s,n=8)分别为：1.46±0.10，1.07±0.12和0.81±0.06。经单因素的方差分析和组间两两比较，P<0.05。, http://www.100md.com
讨 论
1.细胞迁移对肺组织上皮细胞损伤的修复作用的意义：细胞迁移是由一组趋化因子所介导的细胞运动。构成细胞趋化因子的成分可分为α和β趋化细胞因子家系[6]。目前的研究表明：细胞的迁移经常伴有细胞的增殖，并同时需要启动与迁移有关的一些机制[7]。上皮细胞迁移和增殖是损伤愈合的两个重要过程[8]。气管上皮损伤后，TNF-α可以诱发牛气管上皮细胞(BBEC)的迁移和增殖[9]。Kim[10]报道了支气管上皮细胞(GPTEC)在表皮生长因子(EGF)的作用下，发生迁移、趋化和增殖。表明肺上皮细胞损伤后的修复都有上皮细胞的迁移和增殖发生。
2.SiO2刺激PAM的上清液对肺泡上皮细胞迁移和增殖的抑制作用及其在上皮损伤修复中的意义：大鼠染尘后，肺上皮细胞的损伤可以通过Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的增殖，以及Ⅱ型肺泡上皮细胞的胞浆展平并覆盖损伤部位进行代偿性修复。本研究的实验结果显示：200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液，与空白对照组相比，肺泡上皮细胞Mv-1-lu的增生明显减少。同样，200μg/ml SiO2刺激PAM的上清液使Mv-1-lu细胞的迁移功能也明显降低。说明SiO2可能刺激PAM产生、分泌某些相关的因子，对肺上皮细胞增殖和迁移产生抑制作用，进而阻碍肺泡上皮细胞的损伤修复。提示SiO2吸入在产生肺泡上皮损伤的同时又抑制了上皮细胞的损伤修复，两者相互促进。
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有关肺泡上皮细胞的损伤和修复抑制这一协同过程对石英染尘后的肺纤维化作用，乃至矽肺发生的意义，目前尚不明确。但从直观上理解，Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤、脱落，以至肺间质的裸露，对SiO2尘和尘细胞进入肺间质，或肺泡内SiO2尘直接作用于间质中成纤维细胞等应该有重要作用。所以,从这个意义推测SiO2尘吸入对Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤修复的抑制对矽肺的发生有促进作用。有关机制需作进一步的研究。
参 考 文 献
[1] 杨青.实验性大鼠矽肺纤维化扫描电镜观察.现代预防医学，1995，22：136-137.
[2] 王筑 移兰，刚葆琪主编.现代劳动卫生学.北京：人民卫生出版社，1994.59-60.
[3] Wang MH,Dlugosz AA,Sun Y,et al.Macrophage stimulating protein induces proliferation and migration of murine keratinocytes.Exp Cell Res,1996,226:29-46.
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[4] Allavena P,Paganin C,Zhou D,et al.Interleukin-12 is chemotactic for natural killer cells and stimulates their interaction with vascular endothelium.Blood,1994,84:2261-2268.
[5] Tan J,Christian GL,Borbala G,et al.Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T cell lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte migration.J Immunol,1993,151:4545-4551.
[6] 叶棋浓.人趋化细胞因子超家族研究进展.国外医学免疫学分册，1995，18：7-11.
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[7] Birchemier C,Birchemier W.Molecular aspects of mesenchymal-epithelial interactions.Annu Rev Cell Biol,1993,9:511-540.
[8] Nusrat A,Parkos CA,Bacara AE,et al.Hepatocyte growth factor/scatter factor effects on epithelia,regulation of intercellular functions in transformed and nontransformed cell lines,basolateral polarization of c-met receptor in transformed and natural intestinal epithelia,and induction of rapid wound repair in a transformed model epithelium.J Clin Invest,1994,93:2056-2065.
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[9] Wyatt TA,Ito H,Veys TJ,et al.Stimulation of protein kinase C activity by tumor necrosis factor-alpha in bovine bronchial epithelial cells.Am J Physiol,1997,273(5 Pt 1):L1007-1012.
[10] Kim JS,McKinnis VS,Nawrocki A,et al.Stimulation of migration and wound repair of guinea-pig airway epithelial cells in response to epidermal growth factor.Am J Respir Cell Mol Biol,1998,18:66-74.
(收稿：1998-04-27 修回：1998-06-10), 百拇医药