MTT比色法中应采用分析纯二甲基亚砜作为甲眃溶解剂
作者：彭 涛 刘晓波 田伏洲 尹致良 贺伟旗
单位：成都军区总医院全军普外中心，成都610083
关键词：
中国免疫学杂志990414 中国图书分类号 Q25
噻唑蓝(MTT)可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲眃颗粒(formazan)，且甲眃生成量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系〔见：Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays. J lmmunol Methods,1983;65:55〕。基于此建立的MTT比色法，快速简便，能同时处理大量样品，并可定量检测，已广泛应用于细胞毒测定等多个方面。MTT比色法中，甲眃溶剂是一个重要影响因素。二甲基亚砜(DMSO)较传统酸化异丙醇等溶剂溶解力强，溶解甲眃颗粒时间短，仅需10 min左右，有很好的应用前景。然而有报道〔见：付体辉，谢之荣，邓碧芳 et al.MTT比色法检测肿瘤患者的淋转功能及其条件分析. 中国实验临床免疫学杂志，1994；6(1)：30〕，DMSO与MTT有颜色反应，影响比色。我们分别以国产化学纯、分析纯及进口分析纯DMSO作为甲眃溶液，以探讨DMSO的纯度对MTT比色的实际影响情况。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 DMSO试剂 国产化学纯为广州新港化工厂产品；国产分析纯为成都化学试剂厂产品；进口分析纯为Fluka公司产品。
1.2 MTT试剂 Sigma公司产品，用PBS制成5 mg/ml浓度，过滤分装。
1.3 DMSO与MTT试剂的颜色反应 将不同浓度MTT与DMSO试剂(150μl/孔)于96孔板中混合，37℃孵育3 h，490 nm波长处测各孔吸光度(OD)。
1.4 SP2/0细胞的MTT比色分析 在96孔板中加入SP2/0细胞(每孔5.0×104)，然后加入不同数量的MTT，37℃，5%CO2条件下孵育3 h，吸弃上清，加入DMSO试剂(150μl/孔)，于490 nm波长处测各孔OD值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 三种DMSO与MTT的反应 国产化学纯DMSO与MTT混合会出现红褐色且颜色深浅与MTT量(1～30 μl/孔)呈正相关，OD值较高；分析纯DMSO(国产、进口)与MTT混合无其它颜色出现，仍为MTT本身颜色，OD值较低。
2.2 三种DMSO作为甲眃溶剂所测OD值比较 国产化学纯DMSO作为溶剂所测OD值明显高于分析纯DMSO(国产、进口)，且与MTT量成明显线性关系，提示化学纯DMSO存在较高背景值，有一定的副反应；以两种分析纯DMSO为溶剂的SP2/0细胞OD值与MTT浓度的关系曲线重合性好，无明显区别。
3 讨论
DMSO对甲眃具有高而迅速的溶解能力，因而能克服传统溶剂的不足。但有报道DMSO能与孔中残存MTT发生反应，且呈剂量依赖性，可导致背景OD值较高，灵敏度降低。我们对国产化学纯，分析纯及进口分析纯DMSO作了对比试验发现：与MTT有副反应(颜色反应)的DMSO仅是国产化学纯，而分析纯DMSO无论是国产还是进口的与MTT无副反应或副反应很小，不影响比色，推测与MTT发生副反应的可能是化学纯DMSO中所含杂质，MTT与DMSO本身并不发生反应。本试验还表明，进口分析纯与国产分析纯DMSO作为甲眃溶剂所测OD值无明显差别，因此我们建议，在MTT比色法中应使用分析纯DMSO，并且可使用国产分析纯DMSO作为甲眃溶剂。
彭 涛 解放军大连医学专科学校生化室，大连 116013
作者简介：彭 涛，男，27岁，助教，主要从事生物化学研究与教学；
刘晓波，男，32岁，硕士，主治医师，主要研究肿瘤免疫OD值。
〔收稿1997-03-20 修回1998-08-28〕, 百拇医药
单位：成都军区总医院全军普外中心，成都610083
关键词：
中国免疫学杂志990414 中国图书分类号 Q25
噻唑蓝(MTT)可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲眃颗粒(formazan)，且甲眃生成量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系〔见：Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays. J lmmunol Methods,1983;65:55〕。基于此建立的MTT比色法，快速简便，能同时处理大量样品，并可定量检测，已广泛应用于细胞毒测定等多个方面。MTT比色法中，甲眃溶剂是一个重要影响因素。二甲基亚砜(DMSO)较传统酸化异丙醇等溶剂溶解力强，溶解甲眃颗粒时间短，仅需10 min左右，有很好的应用前景。然而有报道〔见：付体辉，谢之荣，邓碧芳 et al.MTT比色法检测肿瘤患者的淋转功能及其条件分析. 中国实验临床免疫学杂志，1994；6(1)：30〕，DMSO与MTT有颜色反应，影响比色。我们分别以国产化学纯、分析纯及进口分析纯DMSO作为甲眃溶液，以探讨DMSO的纯度对MTT比色的实际影响情况。
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1 材料与方法
1.1 DMSO试剂 国产化学纯为广州新港化工厂产品；国产分析纯为成都化学试剂厂产品；进口分析纯为Fluka公司产品。
1.2 MTT试剂 Sigma公司产品，用PBS制成5 mg/ml浓度，过滤分装。
1.3 DMSO与MTT试剂的颜色反应 将不同浓度MTT与DMSO试剂(150μl/孔)于96孔板中混合，37℃孵育3 h，490 nm波长处测各孔吸光度(OD)。
1.4 SP2/0细胞的MTT比色分析 在96孔板中加入SP2/0细胞(每孔5.0×104)，然后加入不同数量的MTT，37℃，5%CO2条件下孵育3 h，吸弃上清，加入DMSO试剂(150μl/孔)，于490 nm波长处测各孔OD值。
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2 结果
2.1 三种DMSO与MTT的反应 国产化学纯DMSO与MTT混合会出现红褐色且颜色深浅与MTT量(1～30 μl/孔)呈正相关，OD值较高；分析纯DMSO(国产、进口)与MTT混合无其它颜色出现，仍为MTT本身颜色，OD值较低。
2.2 三种DMSO作为甲眃溶剂所测OD值比较 国产化学纯DMSO作为溶剂所测OD值明显高于分析纯DMSO(国产、进口)，且与MTT量成明显线性关系，提示化学纯DMSO存在较高背景值，有一定的副反应；以两种分析纯DMSO为溶剂的SP2/0细胞OD值与MTT浓度的关系曲线重合性好，无明显区别。
3 讨论
DMSO对甲眃具有高而迅速的溶解能力，因而能克服传统溶剂的不足。但有报道DMSO能与孔中残存MTT发生反应，且呈剂量依赖性，可导致背景OD值较高，灵敏度降低。我们对国产化学纯，分析纯及进口分析纯DMSO作了对比试验发现：与MTT有副反应(颜色反应)的DMSO仅是国产化学纯，而分析纯DMSO无论是国产还是进口的与MTT无副反应或副反应很小，不影响比色，推测与MTT发生副反应的可能是化学纯DMSO中所含杂质，MTT与DMSO本身并不发生反应。本试验还表明，进口分析纯与国产分析纯DMSO作为甲眃溶剂所测OD值无明显差别，因此我们建议，在MTT比色法中应使用分析纯DMSO，并且可使用国产分析纯DMSO作为甲眃溶剂。
彭 涛 解放军大连医学专科学校生化室，大连 116013
作者简介：彭 涛，男，27岁，助教，主要从事生物化学研究与教学；
刘晓波，男，32岁，硕士，主治医师，主要研究肿瘤免疫OD值。
〔收稿1997-03-20 修回1998-08-28〕, 百拇医药