偶氮胂Ⅲ测定血清镁
作者：蒋兴亮 唐中 周京国 王光华
单位：川北医学院附属医院检验科 南充 637000
关键词：镁；比色法；偶氮胂Ⅲ
川北医学院学报990363 摘 要 目的：建立简便、灵敏的偶氮胂Ⅲ(ArsenanoⅢ)血清镁测定法。方法：在碱性条件下，用EGTA消除钙的干扰，偶氮胂Ⅲ与镁离子形成蓝紫色络合物，以分光光度法测定血清镁。结果：偶氮胂Ⅲ-镁反应液的最大吸收峰为615nm，反应最适pH8.8，偶氮胂Ⅲ最适浓度为150umol/L，EGTA加入量为200umol/L。本法批内CV及批间CV(n=20)分别为1.70～2.10%、2.17～2.57%。平均回收率为99.3%，线性0～3.0mmol/L。胆红素(500umol/L以内)，血红蛋白(7g/L)。脂肪乳剂Interlipid(4g/L)对测定无干扰。该法与MTB法对照，结果无显著差异。(P>0.05)。结论：偶氮胂Ⅲ测定血清镁简便、快速、灵敏、可靠，适于手工分析和自动化分析。
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文章编号：1005-3697(1999)03—0084—03 中图分类号：R446.112 文献标识码：A
Determination of magnesium in serum with arsenazo Ⅲ reagents
Jiang Xingliang,TangZhong.
(Affiliated Hospital Of North Sichuan Medical College)
Abstract Objective:To establish a colormetric method for measuring magnesium in serum by ArsenazoⅢ.Methods:In the alkline medium,calcium has been selectively masking by EGTA,while Magnesium reacts with ArsenazoⅢ to form a compound.The color insensity of the compound was propotional to the concentration of magnesium in serum.Results:ArsenazoⅢ magnesium compound compound absorbs length with a peak at 615nm, under the optium pH,Arsenazo and EGTA concentration in the reagents.Intra-assay precision were 1.70 to 2.10% and interassay precision were 2.17～2.57%.The recoveries ranged from 98.8～101.5%. No interference were observed for bilirubin(500umol/L), hemoglobin(7g/L) and Intralipid (4g/L).The measurement range was 0～3mmol/L.The results showed no difference ArsenazoⅢ and MTB method.Conclusions:This method was simple,rapid,sensitive and applied to manual procedure or automatic analysis.
, 百拇医药
Key Words Magnesium ArsenazoⅢ Colormetry
血清镁的测定方法有原子吸收分光光度法、酶法和比色法等。原子吸收分光光度法是镁测定的参考方法，虽灵敏可靠，但操作繁锁，需要昂贵仪器，不适于常规分析。酶法测定国内外虽有文献报导，仍未用于常规分析。比色法主要有甲基百里酚蓝(MTB)法和钙镁试剂法(Calmagite)及二甲苯胺蓝法等，方法简便、快速，为临床实验室广泛采用，但方法的灵敏度及显色稳定性均不甚理想。目前，偶氮胂Ⅲ主要用于测定血清钙。在碱性条件下，偶氮胂Ⅲ与钙、镁均形成蓝紫色络合物，如加入适量EGTA可消除钙的干扰，可测定血清镁。1965年lamkin等[1]报道用偶氮胂Ⅲ测定血清钙和镁，之后国内外许多文献报道用偶氮胂Ⅲ测定血清钙[2～4]。但用偶氮胂Ⅲ测定血清镁未见报道。我们参考lamkin等的方法，建立了偶氮胂Ⅲ测定血清镁的方法，并对方法学进行了研究，现报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 试 剂
1.1.1 偶氮胂Ⅲ试剂(150umol/L) 称取偶氮胂Ⅲ(Sigma产品，批号110H2603，MW776.4)115.0mg，EGTA80mg，溶于1000ml硼砂-HCl缓冲液中(pH8.8，20mmol/L)加Trinonx-100 0.5g。
1.1.2 镁标准液 10.0mmol/L，1.0mmol/L(含钙2.50mmol/L)，质控血清(正常值、异常值，上海长征公司)。
1.2 仪 器 日本岛津CL-770型半自动生化分析仪，pH计。
1.3 方 法 取洁净试管三支，测定管、标准管、空白管分别加入血清、镁标准应用液、水各20μl，每管加偶氮胂Ⅲ试剂2.0ml，混匀后放置5min，以615mm波长，1cm光经比色杯，空白管调零，读取各管吸光度。
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1.4 计 算
2 结 果
2.1 吸收光谱 用CL-770型分析仪，选择波长500～700nm之间，对偶氮胂Ⅲ试剂空白(以水调零)及偶氮胂Ⅲ与镁反应液(空白试剂调零)，进行连续自动扫描，由图1可见，偶氮胂Ⅲ-Mg反应液在波长610～620nm之间有一平坦吸收峰，故选用测定波长615nm。
a.镁＝2.0mmol/L
b.镁＝1.0mmol/L
c.试剂空白
图1 ArsenazlⅢ反应液及空白试剂吸收光谱
, 百拇医药
2.2 pH的选择 配制pH7.0～10.0的系列偶氮胂Ⅲ显色液，以水调零，测定试剂空白吸光度，其值随pH的增大而增大；以试剂空白调零，测定偶氮胂Ⅲ-Mg反应液吸光度，最大吸收峰位于pH8.5～9.0之间。pH高于9.0时吸光度略有下降(见图2)，故选择最佳pH8.8。
图2 pH对反应液吸光度的影响
2.3 偶氮胂Ⅲ最适浓度的选择 其它条件不变，配制一系列偶氮胂Ⅲ浓度试剂，于CL-770型分析仪上测定试剂空白(以水调零)和反应液(以空白试剂调零)吸光度。随偶氮胂Ⅲ浓度的增加，两者吸光度均增加，当浓度达150umol/L时，反应液吸光度趋于恒定，继续增加浓度时，空白吸光度增加。因而选择偶氮胂Ⅲ浓度为150umol/L，见图3。
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图3 ArsenazoⅢ浓度的选择
2.4 EGTA浓度的选择 在碱性条件下，钙、镁均能与偶氮胂Ⅲ反应生成有色络合物，因而须加入EGTA消除钙的干扰。反应液中分别加入EGTA0～300umol/L，对7.5mmol/L钙进行掩蔽，反应后进行光谱扫描，由图4可见，EGTA200umol/L时可完全消除钙的干扰。
A.0umol/L EGTA B.50umol/L EGTA C.100umol/LEGTA D.200umol/L EGTA
图4 EGTA浓度的选择
2.5 线性试验 配制0～4.0mmol/L系列镁标准液用本法测定，镁在0～3.0mmol/L内线性良好，r＝0.991。
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2.6 回收试验 在已知镁浓度为0.80mmol/L的血清中，分别加入3种浓度(0.40、0.80、1.20mmol/L)镁标准液，回收值分别为0.395、0.781、1.218mmol/L，回收率分别为98.8%、97.6%、101.5%，平均99.3%。
2.7 精密度试验 取高、中、低三种不同浓度质控血清(镁浓度分别为1.61、0.91、0.52mmol/L)，用本法测定20次，批内CV分别为1.70、1.91、2.10%，批间CV分别为2.17、2.30、2.57%。
2.8 显色时间及稳定性 标准及血清显色后，立即、5、10、20、40、60min，2、3、5、8、10h进行比色，结果表明，反应在5min内完成，5h内反应吸光度基本未变。
2.9 干扰试验 (1)加入不同量胆红素于血清标本中，500umol/L以内不干扰测定；(2)血红蛋白干扰：全血破坏红细胞后，配成不同浓度血红蛋白液，加入血清标本中，血红蛋白7.0g/L时不干扰测定；高于7g/L时用血清空白可部分消除干扰；(3)脂质干扰：加入不同量注射用乳剂于血清中，甘油三酯达4g/L时不干扰测定。
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2.10 对照试验 本法(X)与MTB法(Y)平行测定血清样品71份(镁0.51～1.45mmol/L)。Y＝0.989X+0.0161，r=0.991,t=1.112,P>0.05。
2.11 参考值 用本法测定81例正常人血清镁观察值呈正态分布，参考范围(—X1.96s)0.65～1.15mmol/L。
3 讨 论
偶氮胂Ⅲ是高灵敏的金属离子络合剂，在碱性条件下，可与多种离子络合显色。在生理条件下，二价阳离子除钙镁外，其它阳离子含量甚微，产生干扰不大。因而用偶氮胂Ⅲ测定血清镁，干扰主要来自钙离子，加入适量EGTA后，可消除高浓度钙的干扰，但EGTA浓度过大，会影响测定镁的灵敏度，EGTA浓度的选择是非常重要的。
本法为单试剂，试剂稳定，试剂可长期贮存，临用前无需配制应用液，稳定性优于MTB法和Calmagite法，可用于手工分析，也可用于各种单或双试剂功能的自动化分析仪。
, 百拇医药
方法学评价试验证实：本法快速、微量、试剂稳定，配制简单，为目前测定血清镁的唯一单试剂，线性范围宽，重复性好，灵敏度高，既可用于手工测定，也可用于单或多试剂功能的自动化分析仪，尤其适宜于无双试剂功能的自动生化分析仪，能够满足血清镁常规分析的需要。
参考文献
1 Lamkin EG,Williams MB.Spectrophotometric determination of calcium and magnesium in blood serum with ArsenazoⅢ and EGTA.Anal Chem,1965;37:1029
2 Leary NO,Pembroke,Duggan PE.Single stable reagent(ArsenazlⅢ) for optically rubust measurement of calcium in serum and plasma.Clin Chem,1992;28:904
3 Michaylova V.IIkova P.Photometric determination of micro amounts of calcium with ArsenazoⅢ.Anal Chim Acta,1971;53:194
4 刘倩予，黄君富，魏明竞.血清钙的偶氮胂Ⅲ测定法.中华医学检验杂志，1995；18(5)：270
(收稿日期：1999-06-28), http://www.100md.com
单位：川北医学院附属医院检验科 南充 637000
关键词：镁；比色法；偶氮胂Ⅲ
川北医学院学报990363 摘 要 目的：建立简便、灵敏的偶氮胂Ⅲ(ArsenanoⅢ)血清镁测定法。方法：在碱性条件下，用EGTA消除钙的干扰，偶氮胂Ⅲ与镁离子形成蓝紫色络合物，以分光光度法测定血清镁。结果：偶氮胂Ⅲ-镁反应液的最大吸收峰为615nm，反应最适pH8.8，偶氮胂Ⅲ最适浓度为150umol/L，EGTA加入量为200umol/L。本法批内CV及批间CV(n=20)分别为1.70～2.10%、2.17～2.57%。平均回收率为99.3%，线性0～3.0mmol/L。胆红素(500umol/L以内)，血红蛋白(7g/L)。脂肪乳剂Interlipid(4g/L)对测定无干扰。该法与MTB法对照，结果无显著差异。(P>0.05)。结论：偶氮胂Ⅲ测定血清镁简便、快速、灵敏、可靠，适于手工分析和自动化分析。
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文章编号：1005-3697(1999)03—0084—03 中图分类号：R446.112 文献标识码：A
Determination of magnesium in serum with arsenazo Ⅲ reagents
Jiang Xingliang,TangZhong.
(Affiliated Hospital Of North Sichuan Medical College)
Abstract Objective:To establish a colormetric method for measuring magnesium in serum by ArsenazoⅢ.Methods:In the alkline medium,calcium has been selectively masking by EGTA,while Magnesium reacts with ArsenazoⅢ to form a compound.The color insensity of the compound was propotional to the concentration of magnesium in serum.Results:ArsenazoⅢ magnesium compound compound absorbs length with a peak at 615nm, under the optium pH,Arsenazo and EGTA concentration in the reagents.Intra-assay precision were 1.70 to 2.10% and interassay precision were 2.17～2.57%.The recoveries ranged from 98.8～101.5%. No interference were observed for bilirubin(500umol/L), hemoglobin(7g/L) and Intralipid (4g/L).The measurement range was 0～3mmol/L.The results showed no difference ArsenazoⅢ and MTB method.Conclusions:This method was simple,rapid,sensitive and applied to manual procedure or automatic analysis.
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Key Words Magnesium ArsenazoⅢ Colormetry
血清镁的测定方法有原子吸收分光光度法、酶法和比色法等。原子吸收分光光度法是镁测定的参考方法，虽灵敏可靠，但操作繁锁，需要昂贵仪器，不适于常规分析。酶法测定国内外虽有文献报导，仍未用于常规分析。比色法主要有甲基百里酚蓝(MTB)法和钙镁试剂法(Calmagite)及二甲苯胺蓝法等，方法简便、快速，为临床实验室广泛采用，但方法的灵敏度及显色稳定性均不甚理想。目前，偶氮胂Ⅲ主要用于测定血清钙。在碱性条件下，偶氮胂Ⅲ与钙、镁均形成蓝紫色络合物，如加入适量EGTA可消除钙的干扰，可测定血清镁。1965年lamkin等[1]报道用偶氮胂Ⅲ测定血清钙和镁，之后国内外许多文献报道用偶氮胂Ⅲ测定血清钙[2～4]。但用偶氮胂Ⅲ测定血清镁未见报道。我们参考lamkin等的方法，建立了偶氮胂Ⅲ测定血清镁的方法，并对方法学进行了研究，现报告如下。
1 材料与方法
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1.1 试 剂
1.1.1 偶氮胂Ⅲ试剂(150umol/L) 称取偶氮胂Ⅲ(Sigma产品，批号110H2603，MW776.4)115.0mg，EGTA80mg，溶于1000ml硼砂-HCl缓冲液中(pH8.8，20mmol/L)加Trinonx-100 0.5g。
1.1.2 镁标准液 10.0mmol/L，1.0mmol/L(含钙2.50mmol/L)，质控血清(正常值、异常值，上海长征公司)。
1.2 仪 器 日本岛津CL-770型半自动生化分析仪，pH计。
1.3 方 法 取洁净试管三支，测定管、标准管、空白管分别加入血清、镁标准应用液、水各20μl，每管加偶氮胂Ⅲ试剂2.0ml，混匀后放置5min，以615mm波长，1cm光经比色杯，空白管调零，读取各管吸光度。
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1.4 计 算
2 结 果
2.1 吸收光谱 用CL-770型分析仪，选择波长500～700nm之间，对偶氮胂Ⅲ试剂空白(以水调零)及偶氮胂Ⅲ与镁反应液(空白试剂调零)，进行连续自动扫描，由图1可见，偶氮胂Ⅲ-Mg反应液在波长610～620nm之间有一平坦吸收峰，故选用测定波长615nm。
a.镁＝2.0mmol/L
b.镁＝1.0mmol/L
c.试剂空白
图1 ArsenazlⅢ反应液及空白试剂吸收光谱
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2.2 pH的选择 配制pH7.0～10.0的系列偶氮胂Ⅲ显色液，以水调零，测定试剂空白吸光度，其值随pH的增大而增大；以试剂空白调零，测定偶氮胂Ⅲ-Mg反应液吸光度，最大吸收峰位于pH8.5～9.0之间。pH高于9.0时吸光度略有下降(见图2)，故选择最佳pH8.8。
图2 pH对反应液吸光度的影响
2.3 偶氮胂Ⅲ最适浓度的选择 其它条件不变，配制一系列偶氮胂Ⅲ浓度试剂，于CL-770型分析仪上测定试剂空白(以水调零)和反应液(以空白试剂调零)吸光度。随偶氮胂Ⅲ浓度的增加，两者吸光度均增加，当浓度达150umol/L时，反应液吸光度趋于恒定，继续增加浓度时，空白吸光度增加。因而选择偶氮胂Ⅲ浓度为150umol/L，见图3。
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图3 ArsenazoⅢ浓度的选择
2.4 EGTA浓度的选择 在碱性条件下，钙、镁均能与偶氮胂Ⅲ反应生成有色络合物，因而须加入EGTA消除钙的干扰。反应液中分别加入EGTA0～300umol/L，对7.5mmol/L钙进行掩蔽，反应后进行光谱扫描，由图4可见，EGTA200umol/L时可完全消除钙的干扰。
A.0umol/L EGTA B.50umol/L EGTA C.100umol/LEGTA D.200umol/L EGTA
图4 EGTA浓度的选择
2.5 线性试验 配制0～4.0mmol/L系列镁标准液用本法测定，镁在0～3.0mmol/L内线性良好，r＝0.991。
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2.6 回收试验 在已知镁浓度为0.80mmol/L的血清中，分别加入3种浓度(0.40、0.80、1.20mmol/L)镁标准液，回收值分别为0.395、0.781、1.218mmol/L，回收率分别为98.8%、97.6%、101.5%，平均99.3%。
2.7 精密度试验 取高、中、低三种不同浓度质控血清(镁浓度分别为1.61、0.91、0.52mmol/L)，用本法测定20次，批内CV分别为1.70、1.91、2.10%，批间CV分别为2.17、2.30、2.57%。
2.8 显色时间及稳定性 标准及血清显色后，立即、5、10、20、40、60min，2、3、5、8、10h进行比色，结果表明，反应在5min内完成，5h内反应吸光度基本未变。
2.9 干扰试验 (1)加入不同量胆红素于血清标本中，500umol/L以内不干扰测定；(2)血红蛋白干扰：全血破坏红细胞后，配成不同浓度血红蛋白液，加入血清标本中，血红蛋白7.0g/L时不干扰测定；高于7g/L时用血清空白可部分消除干扰；(3)脂质干扰：加入不同量注射用乳剂于血清中，甘油三酯达4g/L时不干扰测定。
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2.10 对照试验 本法(X)与MTB法(Y)平行测定血清样品71份(镁0.51～1.45mmol/L)。Y＝0.989X+0.0161，r=0.991,t=1.112,P>0.05。
2.11 参考值 用本法测定81例正常人血清镁观察值呈正态分布，参考范围(—X1.96s)0.65～1.15mmol/L。
3 讨 论
偶氮胂Ⅲ是高灵敏的金属离子络合剂，在碱性条件下，可与多种离子络合显色。在生理条件下，二价阳离子除钙镁外，其它阳离子含量甚微，产生干扰不大。因而用偶氮胂Ⅲ测定血清镁，干扰主要来自钙离子，加入适量EGTA后，可消除高浓度钙的干扰，但EGTA浓度过大，会影响测定镁的灵敏度，EGTA浓度的选择是非常重要的。
本法为单试剂，试剂稳定，试剂可长期贮存，临用前无需配制应用液，稳定性优于MTB法和Calmagite法，可用于手工分析，也可用于各种单或双试剂功能的自动化分析仪。
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方法学评价试验证实：本法快速、微量、试剂稳定，配制简单，为目前测定血清镁的唯一单试剂，线性范围宽，重复性好，灵敏度高，既可用于手工测定，也可用于单或多试剂功能的自动化分析仪，尤其适宜于无双试剂功能的自动生化分析仪，能够满足血清镁常规分析的需要。
参考文献
1 Lamkin EG,Williams MB.Spectrophotometric determination of calcium and magnesium in blood serum with ArsenazoⅢ and EGTA.Anal Chem,1965;37:1029
2 Leary NO,Pembroke,Duggan PE.Single stable reagent(ArsenazlⅢ) for optically rubust measurement of calcium in serum and plasma.Clin Chem,1992;28:904
3 Michaylova V.IIkova P.Photometric determination of micro amounts of calcium with ArsenazoⅢ.Anal Chim Acta,1971;53:194
4 刘倩予，黄君富，魏明竞.血清钙的偶氮胂Ⅲ测定法.中华医学检验杂志，1995；18(5)：270
(收稿日期：1999-06-28), http://www.100md.com